地中海荚蒾的组培繁殖方法

摘要

本发明提供了一种地中海荚蒾的组培繁殖方法，包括：外植体的选取与处理：选取地中海荚蒾带腋芽茎段作为培养材料，用流水冲洗；在超净台上用酒精表面灭菌，无菌水冲洗，接着用氯化汞灭菌，然后用无菌水冲洗，接种于诱导培养基中；诱导培养：使用MS培养基、6‑苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂混合后作为诱导培养基，将所选取的地中海荚蒾带腋芽茎段接种于诱导培养基中；增殖培养：将生长于诱导培养基上的外植体转接于MS培养基、6‑苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂混合后作为诱导培养基进行连续培养；生根培养：选择1/2MS培养基、吲哚丁酸、活性炭、蔗糖、琼脂混合后作为生根培养基；移栽：将已生根的植株取出，移栽到腐质土：炭渣：锯木屑混合基质上。

权利要求

1.一种地中海荚蒾的组培繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤101：外植体的选取与处理：选取地中海荚蒾带腋芽茎段作为培养材料，用流水冲洗；在超净台上用酒精表面灭菌，无菌水冲洗，接着用氯化汞灭菌，所述氯化汞比例为

0.1％，然后用无菌水冲洗，接种于诱导培养基中；

步骤102：诱导培养：使用MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.3mg/L、蔗糖2％和琼脂0.6％混合后作为诱导培养基，将所选取的地中海荚蒾带腋芽茎段接种于诱导培养基中；所述步骤102中诱导培养基的pH值为5.8；

步骤103：增殖培养：将生长于诱导培养基上的外植体转接于MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.2mg/L、蔗糖2％和琼脂0.6％混合后作为诱导培养基进行连续培养；

步骤104：生根培养：选择1/2MS培养基、吲哚丁酸1.0mg/L、活性炭0.3％、蔗糖2％和琼脂0.6％混合后作为生根培养基,所述步骤104的培养基的培养条件：光强为1500-20001X，温度为23至27℃，光照时间为12h/d，生根培养基的pH值为5.8；

步骤105：移栽：将已生根的植株取出，移栽到腐质土、炭渣和锯木屑混合基质上,其中，腐质土∶炭渣∶锯木屑的比例为3∶1∶1；

其中，所述步骤101中用水冲洗时间为20-30分钟，酒精比例为70％，表面灭菌时间为30秒，用氯化汞灭菌的时间为4-12分钟。

说明书

地中海荚蒾的组培繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及农学技术领域，更具体而言，特别涉及一种地中海荚蒾(Viburnum tinus)的组培繁殖方法。

背景技术

[0002] 地中海荚蒾树冠呈球形，冠径可达2.5～3米。叶椭圆形，深绿色，叶长10厘米，聚伞花序，单花小，仅0.6厘米，花蕾粉红色，花蕾期很长，可达5个多月，盛开后花白色，整个花序直径达10厘米，花期在原产地从11月直到翌春4月。在上海地区10月初便可见细小的黄绿色花蕾，随着花序的伸长，花蕾越来越密集覆盖于枝顶，颜色也逐步加深呈殷红色，远远望去像一片片红云，飘浮在墨绿色的树冠上，格外引人注目，为冬日增添了暖意和生气。盛花期在3月中下旬，红云般的花蕾绽放成雪白一片，在春日的百花园里大放光彩。果卵形，深蓝黑色，径0.6厘米。地中海荚蒾，较容易分化花芽，一到两年生幼树常见开花。如果适当控制营养生长，也可使其在夏季或秋季开花，群植则可在一年中常见有花植株。生长快速，枝叶繁茂，耐修剪，适于作绿篱，也可栽于庭园观赏，是长江三角洲地区冬季观花植物中不可多得的常绿灌木。

[0003] 但是目前尚未公开有效的地中海荚蒾的快速组培繁殖方法。

发明内容

[0004] 本发明旨在至少解决背景技术中存在的问题之一。

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种地中海荚蒾的组培繁殖方法，包括如下步骤：步骤101：外植体的选取与处理：选取地中海荚蒾带腋芽茎段作为培养材料，用流水冲洗；在超净台上用酒精表面灭菌，无菌水冲洗，接着用氯化汞灭菌，然后用无菌水冲洗，接种于诱导培养基中；步骤102：诱导培养：使用MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂混合后作为诱导培养基，将所选取的地中海荚蒾带腋芽茎段接种于诱导培养基中；步骤103：增殖培养：将生长于诱导培养基上的外植体转接于MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂混合后作为诱导培养基进行连续培养；步骤104：生根培养：选择1/2MS培养基、吲哚丁酸、活性炭、蔗糖、琼脂混合后作为生根培养基；步骤105：移栽：将已生根的植株取出，移栽到腐质土：炭渣：锯木屑混合基质上。

[0006] 进一步的，所述步骤101中用水冲洗时间为20-30分钟，酒精比例为70％，用表面灭菌时间为30秒，氯化汞比例为0.1％，用氯化汞灭菌的时间为4-12分钟。

[0007] 进一步的，所述步骤102中6-苄氨基腺嘌呤的比例为0.5-2.0mg/L，萘乙酸的比例为0.1-0.5mg/L，蔗糖比例为2％，琼脂比例为0.6％，诱导培养基的pH值为5.8。

[0008] 进一步的，所述步骤103中6-苄氨基腺嘌呤的比例为0.1-0.5mg/L，萘乙酸比例为0.1-0.3mg/L，蔗糖比例为2％，琼脂比例为0.6％。

[0009] 进一步的，所述步骤104的培养基的培养条件：光强为1500-2000lx，温度为23至27℃，光照时间为12h/d，吲哚丁酸比例为0.1-2.0mg/L，活性炭比例为0.1-0.5％，蔗糖比例为2％，琼脂比例为0.6％，生根培养基的pH值为5.8。

[0010] 进一步的，所述步骤105中腐质土：炭渣：锯木屑的比例为3∶1∶1。

[0011] 本发明的有益效果在于：(1)地中海荚蒾的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件、土壤、病虫害和农药等因素的影响，严格控制地中海荚蒾苗木的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，节省人力和物力等，便于工厂化生产。(3)在组织培养过程中进行了脱毒处理，提高了地中海荚蒾苗木的质量，同时该技术方法解决了地中海荚蒾快速繁殖及其稳定生根的重要技术环节，可应用于工厂化生产。(4)可以保存地中海荚蒾种质资源，丰富园林绿化树种及其资源。

附图说明

[0012] 图1所示为本发明实施例一种地中海荚蒾的组培繁殖方法的流程图。

具体实施方式

[0013] 下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

[0014] 图1所示为本发明实施例一种地中海荚蒾的组培繁殖方法的流程图。

[0015] 本发明实施例提供的地中海荚蒾的组培繁殖方法，包括如下步骤：

[0016] 步骤101：外植体的选取与处理：选取地中海荚蒾带腋芽茎段作为培养材料，用流水冲洗；在超净台上用酒精表面灭菌，无菌水冲洗，接着用氯化汞灭菌，然后用无菌水冲洗，接种于诱导培养基中；

[0017] 步骤102：诱导培养：使用MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂混合后作为诱导培养基，将所选取的地中海荚蒾带腋芽茎段接种于诱导培养基中；

[0018] 步骤103：增殖培养：将生长于诱导培养基上的外植体转接于MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂混合后作为诱导培养基进行连续培养；

[0019] 步骤104：生根培养：选择1/2MS培养基、吲哚丁酸、活性炭、蔗糖、琼脂混合后作为生根培养基；

[0020] 步骤105：移栽：将已生根的植株取出，移栽到腐质土：炭渣：锯木屑混合基质上。

[0021] 进一步的，所述步骤101中用水冲洗时间为20-30分钟，酒精比例为70％，用表面灭菌时间为30秒，氯化汞比例为0.1％，用氯化汞灭菌的时间为4-12分钟。

[0022] 在本发明中，所述步骤102中6-苄氨基腺嘌呤的比例为0.5-2.0mg/L，萘乙酸的比例为0.1-0.5mg/L，蔗糖比例为2％，琼脂比例为0.6％，诱导培养基的pH值为5.8。所述步骤103中6-苄氨基腺嘌呤的比例为0.1-0.5mg/L，萘乙酸比例为0.1-0.3mg/L，蔗糖比例为2％，琼脂比例为0.6％。所述步骤104的培养基的培养条件：光强为1500-2000lx，温度为23至27℃，光照时间为12h/d，吲哚丁酸比例为0.1-2.0mg/L，活性炭比例为0.1-0.5％，蔗糖比例为
2％，琼脂比例为0.6％，生根培养基的pH值为5.8。所述步骤105中腐质土：炭渣：锯木屑的比例为3∶1∶1。

[0023] 下边将举出具体例子进行详细说明：

[0024] 首先，对于地中海荚蒾离体繁殖的启动和增殖培养的过程如下：

[0025] (1)外植体的选取与处理

[0026] 从植株上剪取带腋芽的枝条，切成1cm左右带腋芽茎段，用流水冲洗20～30min。在超净台上用70％酒精表面灭菌30s，无菌水冲洗1次，接着用0.1％氯化汞灭菌，分别处理4、6、8、10、12min，然后用无菌水冲洗5次，接种在MS培养基(含蔗糖2％、琼脂0.6％，pH5.8)中，每个处理接种50瓶，每瓶接1个外植体。30d后调查各处理的死亡率、污染率和成活率。死亡率(％)＝死亡的外植体数/接种外植体数×100％；污染率(％)＝污染的外植体数/接种外植体数×100％；成活率(％)＝成活的外植体数/接种外植体数×100％。

[0027] (2)启动培养

[0028] 选取1cm左右带腋芽茎段为试材。以MS培养基为基本培养基，分别附加如下激素浓度(单位：mg/L)组合：6-苄氨基腺嘌0.5+萘乙酸0.1；6-苄氨基腺嘌呤0.5+萘乙酸0.3；6-苄氨基腺嘌呤0.5+萘乙酸0.5；6-苄氨基腺嘌呤1.0+萘乙酸0.1；6-苄氨基腺嘌呤1.0+萘乙酸0.3；6-苄氨基腺嘌呤1.0+萘乙酸0.5；6-苄氨基腺嘌呤2.0+萘乙酸0.1；6-苄氨基腺嘌呤2.0+萘乙酸0.3；6-苄氨基腺嘌呤2.0+萘乙酸0.5。每种培养基均添加蔗糖2％、琼脂0.6％，pH5.8。每处理接种50瓶，每瓶接1个外植体，30d后统计腋芽萌发率及芽的生长状况。腋芽萌发率＝腋芽萌发的外植体数/接种的外植体数×100％。

[0029] (3)增殖培养

[0030] 选取启动培养得到的芽体为试材。以MS培养基为基本培养基，分别附加如下激素浓度(单位：mg/L)组合：6-苄氨基腺嘌呤0.1+萘乙酸0.1；6-苄氨基腺嘌呤0.1+萘乙酸0.2；6-苄氨基腺嘌呤0.1+萘乙酸0.3；6-苄氨基腺嘌呤0.3+萘乙酸0.1；6-苄氨基腺嘌呤0.3+萘乙酸0.2；6-苄氨基腺嘌呤0.3+萘乙酸0.3；6-苄氨基腺嘌呤0.5+萘乙酸0.1；6-苄氨基腺嘌呤0.5+萘乙酸0.2；6-苄氨基腺嘌呤0.5+萘乙酸0.3。每种培养基均添加蔗糖2％、琼脂
0.6％，pH5.8。每处理接种30瓶，每瓶接1个，30d后统计增殖系数，并观察不定芽生长情况。
增殖系数＝不定芽总数/接种的芽体数×100％。上述培养基的培养条件：光强约1500lx，温度(25±2)℃，光照时间12h/d。

[0031] 关于上述培养的试验结果：

[0032] 研究结果表明，以0.1％氯化汞消毒8min效果最好，其成活率为70％；最佳腋芽启动培养基是培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+萘乙酸0.3mg/L+蔗糖2％+琼脂0.6％，腋芽萌发率为90％；最有利于不定芽增殖的培养基是MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L+蔗糖2％+琼脂0.6％，培养30d，增殖系数高达4.57。

[0033] 其次，本发明所使用的实验材料、实验设计，及实验结果如下：

[0034] (1)实验材料

[0035] 以地中海荚蒾无根组培苗为材料，苗高约3cm，生长健壮，叶色浓绿。

[0036] (2)实验设计

[0037] 培养基对地中海荚蒾组培苗生根的影响：将均匀的地中海荚蒾组培苗分别接种到培养基、1/2MS培养基和1/4MS培养基上，培养基中均加入0.6％琼脂和2％蔗糖，pH为5.8，于温度(25±2)℃，光照12h/d，光强1500-2000lx条件下培养(下同)。每处理接种组培苗15个，设置3次重复。记录生根开始时间，培养25d后，计算每处理平均生根率(生根苗数/接种苗数)、平均生根数(生根总数/接种苗数)和根的平均长度。

[0038] 吲哚丁酸浓度对地中海荚蒾组培苗生根的影响：以1/2MS培养基为基本培养基，在其中分别添加0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L的吲哚丁酸，灭菌后接种均匀的地中海荚蒾组培苗进行培养。每处理接种组培苗15个，设置3次重复。记录生根开始时间，培养25d后，计算每处理平均生根率、平均生根数和根的平均长度。

[0039] 活性炭对地中海荚蒾组培苗生根的影响：以1/2MS培养基为基本培养基，培养基中加入1.0mg/L的吲哚丁酸溶液，同时在其中分别添加0、0.1％、0.3％和0.5％的活性炭，灭菌后接种均匀的地中海荚蒾组培苗进行培养。每处理接种组培苗15个，设置3次重复。记录生根开始时间，培养25d后，计算每处理平均生根率、平均生根数和根的平均长度。

[0040] (3)试验结果

[0041] 研究结果表明，采用1/2MS培养基添加1.0mg/L吲哚丁酸和0.3％活性炭，地中海荚蒾生根效果最好，平均生根率达95.6％，平均生根数可达4.53条，根的平均长度为2.67cm。

[0042] 最后，对于利用上述方式培育出的地中海荚蒾，进行试管苗炼苗及移栽的过程如下：

[0043] 将瓶苗直接从组培室移入大棚炼苗3d，再揭开瓶盖，在瓶中加人少量水炼苗2d。将炼苗后的健壮苗从瓶内夹出，洗净培养基后放在0.1％的多菌灵溶液中浸泡1～2h后，移栽在混合基质(腐质土60％+炭渣20％+锯木屑20％)上，浇足水，搭设小拱棚，盖好薄膜，定期通风、浇水和防病等管理，成活率在85％以上。

[0044] 本发明的有益效果：(1)地中海荚蒾的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件、土壤、病虫害和农药等因素的影响，严格控制地中海荚蒾苗木的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，节省人力和物力等，便于工厂化生产。(3)在组织培养过程中进行了脱毒处理，提高了地中海荚蒾苗木的质量，同时该技术方法解决了地中海荚蒾快速繁殖及其稳定生根的重要技术环节，可应用于工厂化生产。(4)可以保存地中海荚蒾种质资源，丰富园林绿化树种及其资源。

[0045] 本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。