一种五味子酚的药物新用途及其均质混悬剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种五味子酚的药物新用途及其均质混悬剂的制备方法，用于治疗帕金森病，拓宽了五味子酚的应用范围，同时也为帕金森病的治疗提供了一种具有潜能的候选药物。采用一种新的配制方法，将五味子酚配制成均质混悬剂，用于实验动物的口服给药。经动物实验发现，在MPTP诱导的小鼠帕金森病动物模型，五味子酚均质混悬剂可显著改善实验动物的运动障碍，且呈现出良好的剂量依赖趋势。具体表现为：与模型组相比，五味子酚均质混悬剂用药组小鼠在转棒仪的掉落次数显著减少，潜伏期明显增加；爬杆法检测小鼠的爬杆时间明显缩短，运动障碍评分显著降低。五味子酚均质混悬剂对帕金森病具有良好的治疗效果。

权利要求

1.一种五味子酚均质混悬剂的制备方法，其特征在于：第一步：0.5% 羧甲基纤维素钠CMC-Na溶液的配制：称取CMC-Na 0.5 g至100 mL烧杯中，加双蒸水至100 mL，烧杯内加入磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，并加热至60℃使溶解，2 h后烧杯内液体呈澄清透明状，自然冷却至室温后，转移至100 mL量筒中，补加双蒸水至100 mL，即得0.5％CMC-Na溶液；

第二步：五味子酚均质混悬剂的配制：称取五味子酚粉末100 mg至容量为20 mL的研钵中，用注射器抽取CMC-Na溶液10 mL，最初加的速度要慢，逐滴加入，边加边研磨，研磨要有一定的力度，使五味子酚粉末与CMC-Na溶液充分接触，待研磨至粘稠糊状，逐渐增加每次加入CMC-Na溶液的量，由小滴增至大滴，再依次增加至1 mL、2 mL，整个过程中注意边加边研磨，最终配制成10 mg/mL的五味子酚均质混悬剂；

第三步：称取五味子酚粉末50 mg或25 mg，其余操作同第二步，配制成5 mg/mL和2.5 mg/mL的五味子酚均质混悬剂；

第四步：将配制好的五味子酚均质混悬剂转移至适当的容器中。

2.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的五味子酚均质混悬剂的药物用途，其特征在于：将五味子酚均质混悬剂作为制备帕金森病药物中的应用。

3.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的五味子酚均质混悬剂，其特征在于：所述的五味子酚均质混悬剂在用于治疗帕金森病时采用口服方式给药。

说明书

一种五味子酚的药物新用途及其均质混悬剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种五味子酚的药物新用途及其均质混悬剂的制备方法。

背景技术

[0002] 帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是由锥体外系功能障碍引起的一种慢性进行性神经系统疾病，与衰老密切相关。据调查，60岁以上老年人的发病率高达1%。随着老龄化社会的到来，PD发病人数不断增多。PD的主要临床症状为肌肉震颤、僵直、运动困难和运动平衡失调，严重者吃饭，穿衣等日常活动都受到影响，进一步发展还会出现识别、知觉、记忆障碍及明显痴呆，严重影响老年人的健康，已成为困扰社会和家庭的主要问题之一。已有的抗PD药物如左旋多巴等大多为替代疗法，只能在一定程度上改善症状，不能延缓疾病的进程，且长期服药副作用较多，因此临床急需疗效好的治疗新药，寻找新型抗PD药已成为国际上研究的一个热点。

[0003] 五味子酚（Schisanhenol, Sal）是从传统中药五味子（Schisandra chinensis （TurcZ） Bail）果仁中提取的木脂素类成分之一。由中国医学科学院药物研究所陈延镛研究员从红花五味子种子的乙醇提取物中分离得到，其结构经光谱分析鉴定。药理实验表明，五味子酚具有显著的抗氧化活性，对神经细胞损伤具有明显的保护作用：五味子酚对氧化低密度脂蛋白（ox- LDL）和谷氨酸诱导的神经细胞株 NG108-15细胞的氧化应激损伤具有明显的保护作用，具体表现为可显著提高细胞的存活率，降低乳酸脱氢酶（LDH）的释放及凋亡细胞百分率。其抗凋亡机制包括维持细胞内抗氧化成分谷胱甘肽（GSH）水平，清除氧自由基（ROS）、抑制凋亡信号通路的重要信号分子细胞色素C的释放。而ox- LDL和谷氨酸均可在神经退行性疾病中引起ROS的过度释放，导致神经元的氧化应激损伤和凋亡。另外，五味子酚对谷氨酸、无糖无氧及血红素造成的大鼠胎脑神经细胞的氧化应激损伤、对过氧化氢（H2O2）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）及缺血再灌导致的细胞凋亡、对大鼠脑突触体和线粒体氧化应激损伤亦具有明显的保护作用。综上，五味子酚的抗氧化作用明确，对神经细胞具有明显的保护作用。且给小鼠口服五味子酚后可经胃肠道吸收通过血脑屏障。因此，很值得将五味子酚朝着防治与衰老相关的中枢神经系统退行性疾病的方向进行深入研究。本项目是国家自然科学基金资助项目，项目编号为：81102829。

发明内容

[0004] 本发明公开一种五味子酚的药物新用途及其均质混悬剂的制备方法。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种五味子酚的药物新用途是可用于治疗帕金森病。其化学结构是：

[0007]

[0008] 一种五味子酚的均质混悬剂的制备方法是：

[0009] 第一步：0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液的配制：称取CMC-Na 0.5 g至100 mL烧杯中，加双蒸水至100 mL。烧杯内加入磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，并加热至60℃使溶解。约2 h后烧杯内液体呈澄清透明状，自然冷却至室温后，转移至100 mL量筒中，补加（由于加热挥发的）双蒸水至100 mL。即得0.5％CMC-Na溶液；

[0010] 第二步：五味子酚均质混悬剂的配制：称取五味子酚粉末100 mg至容量为20 mL的研钵中，用注射器抽取CMC-Na溶液10 mL，最初加的速度要慢，逐滴加入，边加边研磨，研磨要有一定的力度，使五味子酚粉末与CMC-Na溶液充分接触，待研磨至粘稠糊状，可逐渐增加每次加入CMC-Na溶液的量，如由小滴增至大滴，再依次增加至1 mL、2 mL，整个过程中注意边加边研磨，最终配制成10 mg/mL的五味子酚均质混悬剂；

[0011] 第三步：称取五味子酚粉末50 mg或25 mg，其余操作同第二步，配制成5 mg/mL和2.5 mg/mL的五味子酚均质混悬剂；

[0012] 第四步：将配制好的五味子酚均质混悬剂转移至适当的容器中，供小鼠灌胃给药。

[0013] 本发明的有益效果是：五味子酚均质混悬剂可明显改善MPTP引起的动物行为学障碍，对实验性帕金森氏病有明显的防治作用；五味子酚的对帕金森病的治疗新用途有望进一步开发为帕金森病的临床治疗药物。

附图说明

[0014] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。

[0015] 图1为实验中给药及检测时间表。

[0016] 图2为五味子酚均质混悬剂对MPTP诱导小鼠行为学障碍的改善作用（掉落次数-转棒法）实验数据图表。

[0017] 图3 为五味子酚均质混悬剂对MPTP诱导小鼠行为学障碍的改善作用（潜伏期-转棒法）实验数据图表。

[0018] 图4 为五味子酚均质混悬剂对MPTP诱导小鼠行为学障碍的改善作用（爬杆时间-爬杆法）实验数据图表。

具体实施方式

[0019]  1. 实验材料

[0020] 1.1 药品及试剂

[0021] 五味子酚（Schisanhenol）购于成都普思生物科技有限公司（纯度，HPLC>99%）。1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶 (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine，MPTP)，司来吉兰（Selegiline）购于美国Sigma-Aldrich公司。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）,上海化学试剂采购供应站经销。

[0022] 1.2 实验仪器

[0023] 转棒仪：KN-75型，日本产，转棒直径2.5cm, 表面为橡胶质地。测试时为水平位置，转速设为10 转/分钟。爬杆：直径13 mm，高 50 cm，顶部有一直径3 cm 木球的光滑木杆 由中国医学科学院药物研究所研制。测试时将杆竖直放置。

[0024] 1.3 实验动物

[0025] C57/BL6雄性小鼠，体重20±2g, Wistar 雄性大鼠，体重200±10g,；购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号 SCXK(吉)2011-0004。实验过程中动物自由进食饮水。适应性喂饲3天后进行正式实验。实验过程中所有操作及处理均严格遵循《实验动物管理条例》。

[0026] 2. 实验方法

[0027] 2.1五味子酚均质混悬剂的配制及给药

[0028] 2.1.1 五味子酚均质混悬剂（Sal）的配制

[0029] 0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液的配制：称取CMC-Na 0.5 g至100 mL烧杯中，加双蒸水至100 mL。烧杯内加入磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，并加热至60℃使溶解。约2 h后烧杯内液体呈澄清透明状，自然冷却至室温后，转移至100 mL量筒中，补加（由于加热挥发的）双蒸水至100 mL。即得0.5％CMC-Na溶液。

[0030] 五味子酚均质混悬剂的配制：称取五味子酚粉末100 mg至容量为20 mL的研钵中，用注射器抽取CMC-Na溶液10 mL，最初很关键，加的速度要慢，逐滴加入，边加边研磨，研磨要有一定的力度，使五味子酚粉末与CMC-Na溶液充分接触，待研磨至粘稠糊状，可逐渐增加每次加入CMC-Na溶液的量，如由小滴增至大滴，再依次增加至1 mL、2 mL，整个过程中注意边加边研磨，最终配制成10 mg/mL的五味子酚均质混悬剂。另称取五味子酚粉末50 mg或25 mg，其余操作同上，配制成5 mg/mL和2.5 mg/mL的五味子酚均质混悬剂。将配制好的五味子酚均质混悬剂转移至适当的容器中，供小鼠灌胃给药。

[0031] 2.1.2五味子酚均质混悬剂（Sal）的口服给药方法

[0032] 将含有不同浓度五味子酚均质混悬剂的容器置于磁力搅拌器上，一直处于搅拌状态，使混悬液成均质状，保证灌胃给药时药液的均匀性和给药剂量的准确性。用带有灌胃针头的注射器抽取适量的五味子酚均质混悬剂，给小鼠灌胃给药（即口服）。

[0033] 2.2 其他药物的配制

[0034] 1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）用生理盐水溶解，配成3mg/mL的溶液，临用前新鲜配制。司来吉兰溶于生理盐水。

[0035] 2.3 动物分组及给药

[0036] 小鼠提前用转棒仪或爬杆训练3天，每天2次。将运动不协调的小鼠剔除后，按体重随机分为6组，每组15只。（1）模型组（MPTP组），（2）Sal 大剂量组（Sal 100 mg/kg+MPTP），（3）Sal 中剂量组（Sal 50 mg/kg+MPTP），（4）Sal 小剂量组（Sal 25 mg/kg+MPTP）（5）阳性对照组（司来吉兰+MPTP），（6）正常对照组。Sal每天灌胃给药1次，连续4周。MPTP于Sal给药一周后开始给予，在Sal灌胃后30min 1h内进行皮下注射，隔日一次，连续3周，剂量为25 ~mg/kg。司来吉兰与Sal同时灌胃给予，剂量为10 mg/kg。正常对照组同时灌胃给予相同剂量的0.5% CMC-Na及皮下注射相同剂量的生理盐水。

[0037] 2.4 行为学检测

[0038]  于Sal给药后第1，2，3，4 周各进行1次行为学检测。给药及检测时间详见图1；

[0039] 2.4.1 转棒实验（rotarod test）

[0040] 采用转棒仪观察小鼠的运动协调功能。于皮下注射MPTP后30min—2h内将小鼠置于转棒仪上进行行为学检测，记录小鼠在转棒上停留的时间作为潜伏期（即第一次掉落的时间，）和2min内掉落的次数，以此表示其运动协调能力。每只小鼠测定3次，每次间隔30min，取平均值。同时观察注射MPTP后小鼠的急性行为学改变。

[0041]  2.4.2 爬杆实验 （pole test）

[0042] 同时采用爬杆法评价小鼠的行为学改变。具体方法如下：将小鼠头向下置于杆的顶部球上，其沿杆自然爬下到杆底部的时间为爬杆时间。同时观察小鼠在爬下过程中的行为，并按如下评分标准记分：四肢并用，一步一步向下爬行，记为0分；一步一步向下爬行但兼有后肢滑行，记为1分；向下滑行，但可抱紧金属杆，记为2分；滑行很快，后肢呈拖行，记为3分；不能抓杆，记为4分；翻正反射消失，记为5分。用爬杆时间和评分两项指标反映其运动协调能力。每只小鼠测定3次，每次间隔30min，取平均值。

[0043] 2.5 统计学分析

[0044] 数据用均数±标准差表示，采用SPSS 15.0 统计软件进行单因素方差分析，检验各组间差异是否具有显著性。

[0045] 3. 实验结果

[0046] 3.1 Sal对MPTP诱导的PD模型小鼠急性行为学改变的影响

[0047] 正常对照组小鼠在口服0.5%CMC-Na和注射生理盐水前后，肉眼观察其行为学表现，未见明显改变。其他各组在每次给予MPTP 25mg/kg数分钟后，即可观察到小鼠一系列的急性行为学改变，包括震颤、运动减少、肌张力减退、对外界刺激反应低下，呼吸急促、步态不稳、弓背、流涎、竖尾、竖毛等。震颤表现为局部性的，如下颌、四肢或者尾部，以尾部较常见。随着MPTP注射时间的延长，动物运动障碍程度逐渐增加，症状持续时间延长。而给予司来吉兰及不同剂量Sal各组小鼠的上述表现均明显减轻。不同剂量Sal组小鼠急性行为学改善的程度呈显著的剂量依赖趋势。

[0048] 3.2 Sal 对MPTP诱导的PD模型小鼠运动行为障碍的改善作用（转棒法）[0049] 在转棒实验中，以潜伏期和掉落次数为观察指标。正常对照组小鼠在2min内几乎没有掉落，潜伏期记为120秒。MPTP模型组小鼠的运动协调能力明显下降，与正常对照组小鼠相比具有显著性差异，表现为潜伏期明显缩短，掉落次数显著增加（P<0.01）。且观察到随着MPTP损伤的累积，小鼠的运动障碍呈进行性加重。而与MPTP模型组相比，Sal100mg/kg，50mg/kg及25mg/kg各剂量组小鼠在转棒上停留的潜伏期明显延长，掉落次数显著减少（P<
0.05或P<0.01），且不同剂量组小鼠潜伏期和掉落次数的改变都呈现出显著的剂量依赖趋势。Sal100mg/kg与阳性对照药司来吉兰效果相当或优于司来吉兰。结果见图2、图3。

[0050] 图2中，与正常对照组相比，**P < 0.01；与MPTP模型组相比，#P < 0.05，## P < 0.01。

[0051] 图3中，与正常对照组相比，**P < 0.01；与MPTP模型组相比，#P < 0.05，## P < 0.01。

[0052] 3.3 Sal 对MPTP诱导的PD模型小鼠运动行为障碍的改善作用（爬杆法）[0053] 在爬杆实验中，正常对照组小鼠均能迅速爬到杆底部，且动作协调。而给予 MPTP 的小鼠，爬杆时间与正常对照组相比均有不同程度的延长，且随着MPTP在体内剂量的累积而日渐加重；小鼠运动障碍明显，评分明显增加，出现后肢滑行、拖行、甚至不能抓杆，严重者翻正反射消失（P<0.01）。而Sal100mg/kg，50mg/kg及25mg/kg各剂量组小鼠与模型组小鼠相比，爬杆时间均明显缩短，运动障碍也有显著改善，评分明显降低。且呈现出显著的剂量依赖趋势（P<0.05或P<0.01）。Sal100mg/kg的效果优于阳性对照药司来吉兰。结果见图4和表1。

[0054] 图4中与正常对照组相比，**P < 0.01；与MPTP模型组相比，#P < 0.05，## P < 0.01。

[0055] 表1五味子酚均质混悬剂对MPTP诱导小鼠行为学障碍的改善作用（运动障碍评分-爬杆法）

[0056]

[0057] 与正常对照组相比，**P < 0.01；与MPTP模型组相比，#P < 0.05，## P < 0.01[0058] 4. 结论

[0059] Sal可明显改善MPTP引起的动物行为学障碍，对实验性帕金森氏病有明显的防治作用，有望进一步开发为帕金森病的临床治疗药物。