酸枣枝叶提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及酸枣枝叶提取物及其制备方法和用途，还涉及酸枣枝叶提取物在制备镇静催眠、抗抑郁药物中的应用。提取物的化学成分主要是黄酮类成分和三萜类成分。其制备方法为酸枣枝叶经水或醇溶剂提取，减压浓缩得浸膏，将浸膏分散于水中，经大孔吸附树脂纯化后，合并40%‑60%和70%‑90%乙醇洗脱液，减压浓缩得到乙醇洗脱物，分光光度法测定各部分总黄酮含量为45.5%‑60.7%，总三萜含量为66.7%‑73.5%，合并两部分得到提取物中总黄酮含量为15.9%‑21.1%，总三萜含量43.3%‑47.8%。利用多种分离手段，从酸枣枝叶提取物中分离得到16个化合物。药理学试验证明酸枣枝叶提取物具有镇静催眠、抗抑郁的作用，可应用于治疗中枢神经系统的药物中。

权利要求

1.一种酸枣枝叶提取物，其特征在于，通过如下步骤制备：

(1)将酸枣枝叶粉碎，酸枣枝叶粉末用水或体积浓度为30％-80％醇溶液提取，浓缩成浸膏；

(2)浸膏加入5～10倍的蒸馏水溶解；

(3)将步骤(2)所得液体通过大孔树脂柱色谱，依次用水、10％-30％乙醇、40％-60％乙醇和70％-90％乙醇的溶液洗脱；

(4)弃去水、10％-30％乙醇洗脱液，合并40％-60％和70％-90％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到酸枣枝叶提取物；

步骤(3)所述的大孔树脂为D101、HPD-100或AB-8；

所述的酸枣枝叶提取物包含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基(1→2)-α-L-鼠李糖苷、(+)-儿茶素、2R,3R-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyflavane、(R)-3-苯基乳酸甲酯、(S)-3-(3-吲哚基)乳酸甲酯。

2.如权利要求1所述的酸枣枝叶提取物，其特征在于，所述的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基(1→2)-α-L-鼠李糖苷、(+)-儿茶素、2R,3R-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyflavane、(R)-3-苯基乳酸甲酯、(S)-3-(3-吲哚基)乳酸甲酯通过如下方法得到：(1)将40％-60％的乙醇洗脱液浓缩后经聚酰胺柱色谱，用0％-90％乙醇水溶液梯度洗脱，其中经聚酰胺柱色谱洗脱下的30％乙醇流份再经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷-甲醇5:1-

3:1梯度洗脱，得到4个流份；将流份1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，再经反相制备型高效液相分离，甲醇-水53：47洗脱，得到化合物1山奈酚-3-O-芸香糖苷；将流份2经ODS柱色谱及反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱，得到化合物2芦丁和化合物3槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；

将流份3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，再经反相制备型高效液相分离，甲醇-水36：64洗脱，得到化合物4槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基(1→2)-α-L-鼠李糖和化合物5山奈酚；将流份4进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇100:0-100:50梯度洗脱，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇4:1:1洗脱，得到化合物6槲皮素、化合物7(+)-儿茶素和化合物8 2R,3R-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyflavane；将Fr.4进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇-水100:0:0-0:0:100梯度洗脱，流分经ODS柱色谱及反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱得到化合物9lupeol和化合物10maslinic acid；

(2)将70％-90％的乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇100:0-100:10梯度洗脱，得到Fr.1～Fr.6 6个流份；Fr.2进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯100:0-1:1梯度洗脱，流份经反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化及重结晶等手段得化合物11齐墩果酸、化合物12白桦脂酸、化合物13epiceanothic acid和化合物14麦珠子酸；将Fr.3进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇100:0-100:50梯度洗脱，流份经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，再进行反相制备型高效液相分离，用甲醇-水40:60洗脱，得到化合物15(R)-3-苯基乳酸甲酯和化合物16(S)-3-(3-吲哚基)乳酸甲酯。

3.根据权利要求1所述的酸枣枝叶提取物，其特征在于：步骤(1)中的醇溶液浓度为

40％-80％。

4.根据权利要求1所述的酸枣枝叶提取物，其特征在于：步骤(1)中所述的醇溶液为甲醇、乙醇或正丁醇的含水溶液，所述的水或醇溶液的用量为酸枣枝叶的8-20倍量。

5.根据权利要求1所述的酸枣枝叶提取物，其特征在于：步骤(3)所述的大孔树脂的重量用量为浸膏重量的10～20倍。

6.根据权利要求1所述的酸枣枝叶提取物，其特征在于：总黄酮含量为15.9％-21.1％，总三萜含量为43.3％-47.8％。

7.一种药物组合物，包含权利要求1-6任何一项所述的酸枣枝叶提取物。

8.权利要求1-6任何一项所述的酸枣枝叶提取物或权利要求7所述的组合物在制备防治中枢神经系统药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的中枢神经系统药物为镇静催眠药或抗抑郁药。

10.权利要求1-6任何一项所述的酸枣枝叶提取物或权利要求7所述的药物组合物与药学上可接受的载体结合制成固体制剂或液体制剂。

说明书

酸枣枝叶提取物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中药化学技术领域，涉及酸枣枝叶提取物及其制备方法和应用，具体涉及酸枣枝叶提取物及其制备方法和该提取物在制备治疗镇静催眠、抗抑郁药物方面的应用。

背景技术

[0002] 流行病学调查表明，西方国家有不同程度失眠者约为35.2％。中国卫生部一项统计资料也显示，目前我国失眠者已达120万～140万人次，失眠率高达10％～20％。据专家估计，到2020年全球失眠者将超过7亿。

[0003] 长期失眠会引起人体免疫机能降低和代谢紊乱，加重原有的心脑血管、消化系统等疾病，失眠又可以加重抑郁、焦虑障碍，导致严重的心理卫生问题。抑郁症是一种常见的精神障碍，目前其发病率已跃居世界常见疾病的第四位，专家预测今后20年内抑郁症将会上升为第二大常见疾病。据统计，人群中约5％～6％的人在不同程度上患有抑郁症。随着生活节奏不断加快，社会压力越来越大，抑郁症发病率逐年增加，严重影响了人们的生活质量。

[0004] 目前市场上有各种治疗失眠、抗抑郁的药物，虽然能控制疾病，但是仍存在长期疗效不佳和不良反应等方面的缺点，如催眠药苯二氮类(如艾司唑仑、氟西泮、夸西泮和替马西泮等)存在明显副作用，包括精神和行为变化、记忆障碍，长期用药时产生一定耐受性，久服可能发生依赖性和成瘾，停药时可能出现反跳和戒断症状(失眠、焦虑、激动、震颤等)，可能出现白天残留作用等。用于抑郁症治疗的药物如：三环类药物、单胺氧化酶抑制剂和选择性5-HT重吸收抑制剂等，虽有确切的疗效，但同时有多种副作用和禁忌症，使病人不能耐受，难以达到满意疗效，复发率高。因此，世界各国学者都从植物中寻找强效、无毒的活性成分来开发新药。传统中药有效成分的提取分离工作正受到世界各国的广泛专注，从中药中提取有效的部位或单体，为新药的发现提供了有效手段。

[0005] 酸枣(Ziziphus jujuba Mill var.spinosa(Bunge)Hu ex H.Fu Chow)是鼠李科枣属植物，性平，味甘酸，具有很好的开胃健脾、生津止渴、消食止滞的疗效。《神农本草经》中记载，酸枣可以“安五脏，轻身延年”。酸枣仁在临床上常用于治疗神经衰弱、心烦失眠、多梦、盗汗、易惊等病。本发明所述的酸枣枝叶，为鼠李科植物酸枣(Ziziphus jujuba Mill var.spinosa(Bunge)Hu ex H.Fu Chow)的枝和叶。酸枣枝称“棘刺”，主治消肿，溃脓，止痛。酸枣叶也称棘叶，主治胫臁疮，具有麻醉作用，民间多用于泡水代茶饮，治疗高血压、失眠，经临床验证，酸枣叶对冠心病也有较好疗效。酸枣树为野生资源，近年来，由于一些地区野生资源遭到破坏，且一些偏远的丘陵地区的酸枣资源未得到开发，导致酸枣仁的价格逐年增长，其枝叶也只是作为饲料用，造成资源的极大浪费。目前对酸枣仁的化学成分和药理作用研究相对较多。据报道，酸枣仁中含有黄酮类、生物碱类、皂苷类、脂肪油、多糖及有机酸类等多种化合物。而有关酸枣枝叶的化学成分研究，有学者进行了酸枣叶总黄酮的测定及HPLC-PDA-ESI-MS/MS法鉴定酸枣叶中的三萜类、皂苷类和黄酮类成分。药理作用方面，酸枣仁镇静催眠抗抑郁作用的研究比较深入，而酸枣枝叶抗失眠和抗抑郁的报道较少。

发明内容

[0006] 为了有效的利用资源，本发明提供酸枣枝叶提取物及单体化合物的制备方法，以及在治疗失眠抑郁等中枢神经系统药物的应用。

[0007] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0008] 1.酸枣枝叶提取物的制备：

[0009] (1)将酸枣枝叶粉碎，酸枣枝叶粉末用水或体积浓度为30％-80％醇溶液提取，浓缩成浸膏；

[0010] (2)浸膏加入5～10倍的蒸馏水溶解；

[0011] (3)将步骤(2)所得液体通过大孔树脂柱色谱，依次用水、10％-30％乙醇、40％-60％乙醇和70％-90％乙醇的溶液洗脱；

[0012] (4)弃去水、10％-30％乙醇洗脱液，合并40％-60％和70％-90％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到酸枣枝叶提取物。

[0013] 步骤(1)中，药材粉碎目数为10-40目，优选20目。

[0014] 所述的醇溶液为甲醇、乙醇或正丁醇的含水溶液，优选乙醇溶液，浓度优选40％-80％。

[0015] 所述的水或醇溶液的用量为酸枣枝叶的8-20倍量，优选15-20倍。

[0016] 所述的提取所用方法为回流、冷浸或闪式提取，每次1min～1h，优选回流提取。

[0017] 所述的回流提取中，提取时间为1～3小时，回流温度为70～90℃，优选1小时。

[0018] 冷浸时间为1～3小时，优选3小时。

[0019] 闪式提取时间为20秒～3分钟，优选1分钟。

[0020] 步骤(2)中，加入蒸馏水的用量为浸膏重量5～10倍，在60～80℃或超声的条件下溶解浸膏；

[0021] 步骤(3)中，所述的大孔树脂为D101、AB-8、HPD-100、HPD-400或HPD-450，优选D101、HPD-100或AB-8。

[0022] 步骤(3)包括如下步骤：

[0023] (a)用水上柱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，水用量为柱体积的10～15倍，流速为1～2柱体积/小时；

[0024] (b)用体积浓度为10％-30％的乙醇溶液洗脱，冲洗至盐酸镁粉反应阳性，乙醇用量为柱体积的10～20倍，流速为1～2柱体积/小时；优选10％，30％。

[0025] (c)用体积浓度为40％-60％的乙醇溶液上柱，冲洗至盐酸镁粉阴性乙醇用量为柱体积的10～20倍，流速为1～2柱体积/小时；优选40％,60％。

[0026] (d)用体积浓度为70-90％的乙醇溶液上柱，冲洗至Liebrmann Burchard反应阴性，乙醇用量为柱体积的10～20倍，流速为1～2柱体积/小时；优选70％,90％。

[0027] 2.酸枣枝叶单体化合物的分离

[0028] 利用多种分离手段，包括硅胶、聚酰胺﹑Sephadex LH-20和ODS柱色谱及制备HPLC等，从酸枣枝叶乙醇提取物中共分离得到16个化合物，，根据理化性质及波谱数据，确定了化合物的结构，其中化合物3、4、7、8、15和16为首次从枣属植物中分离得到。

[0029] 上述16个化合物是由如下的方法制备：

[0030] 将40％-60％的乙醇洗脱液浓缩后经聚酰胺柱色谱，用乙醇-水系统0:100-90:100梯度洗脱，其中经聚酰胺柱色谱洗脱下的30％乙醇流份再经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷-甲醇或石油醚-丙酮(100:20-100:30)梯度洗脱。得到三个流份。流份1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，再经制备高效液相分离得到化合物1。流份2经ODS柱色谱及反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱，得到化合物2和化合物3。流份3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱和制备高效液相得到化合物4、化合物5、化合物6、化合物7和化合物8。

[0031] 将70％-90％的乙醇洗脱液浓缩后经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇或石油醚-丙酮(100:0-100:10)梯度洗脱，得到5个流份(Fr.1～Fr.5)。Fr.2经硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱及重结晶等手段得化合物9、化合物10、化合11、化合物12和化合物13。Fr.3经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/乙酸乙酯系统梯度(100:1-100:20)洗脱，再用Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，制备高效液相色谱分离等手段得化合物14。Fr.5经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇-水(100:10:0-100:20:1)梯度洗脱，再用ODS柱色谱及Sephadex LH-20凝胶柱色谱等手段得化合物15和化合物16。

[0032] 本发明还提供了一种药物组合物，包含如上所述的酸枣枝叶提取物。所述的酸枣枝叶提取物可以和药学上可接受的载体混合制备临床可接受的固体制剂或液体制剂，固体制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等，液体制剂包括，口服液体制剂和注射液体制剂。

[0033] 3.酸枣枝叶提取物抗失眠、抗抑郁作用的研究

[0034] (1)酸枣枝叶提取物对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的影响

[0035] 昆明种小鼠随机分为空白对照组(生理盐水)、酸枣仁粗提取物组、阳性药组、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物组、70％-90％乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组(实施例1)，每组8只，连续灌胃给药5d，于末次给药60min后，腹腔注射戊巴比妥钠50mg·kg-1(阈上剂量指90％的小鼠入睡的剂量)，观察并记录小鼠发生睡眠只数、睡眠潜伏期及睡眠持续时间。以注射戊巴比妥钠后15min内翻正反射消失达1min以上者确定为阳性，以注射戊巴比妥钠后15min内出现翻正反射消失为睡眠潜伏期；以动物翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间。
全部数据均采用Spss 16.0统计软件进行处理。结果表明各给药组对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的睡眠潜伏期均无显著性影响，除酸枣枝叶70％-90％洗脱物组外，其他各给药组均能显著增加小鼠睡眠时间(P<0.01)。

[0036] (2)酸枣枝叶提取物对对氯苯丙胺酸(PCPA)致失眠大鼠血清细胞因子的影响[0037] 研究表明，中枢的细胞因子参与睡眠的调节，其中白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在睡眠调节中发挥着重要的作用。IL-1是一种具有致睡作用的细胞因子，当睡眠剥夺时IL-1以及其他促睡眠物质在体内的蓄积标志着睡眠的积累，这些物质给机体以睡眠压力，从而形成睡眠剥夺后的睡眠“反跳”现象，以补偿所失去的睡眠。IL-I包括IL-1α、IL-1β和IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)。IL-1β是血液循环中的主要形式，生理功能较强，所以目前大多以IL-1β研究为主。TNF-α与IL-1具有类似的睡眠调节作用。TNF-α在免疫系统影响睡眠过程中起到中介的作用，可通过提高脑内5-羟色胺(5-HT)的更新率，增强5-HT能神经元的功能，延长慢波睡眠时间。本研究观察酸枣枝叶提取物对对氯苯丙胺酸(PCPA)致失眠大鼠血清细胞因子的影响。

[0038] 选用SD大鼠，随机分为空白组、模型组、酸枣枝叶粗提物组、酸枣仁粗提取物组、阳性药组、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物组、70％-90％乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组(实施例1)，每组8只，除空白组外，其他各组均于每天上午8:00～9:00一次性腹腔注射PCPA300mg/kg，连续注射两天，造模成功后，空白组与模型组分别用相应体积的生理盐水灌胃，其他各组大鼠分别灌胃相对应的提取物水溶液，阳性药组用地西泮灌胃，每天一次，连续10天。于末次给药24h后眼眶取血3ml，静置1h，1500r/min离心30min，取上清液，采用酶联免疫吸附法检测各组血清中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量均减少，与空白组比较有显著性差异(P<0.01)；阳性药组、酸枣枝叶粗提取物组、酸枣枝叶40％乙醇洗脱物组、酸枣仁粗提取物组和酸枣枝叶提取物组的大鼠的IL-1β、TNF-α的含量升高，与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<
0.01)。表明酸枣枝叶粗提取物、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物和酸枣枝叶提取物组具有镇静催眠的作用可能与通过改变了与睡眠有关的细胞因子的含量有关，且酸枣枝叶40％-
60％乙醇洗脱物在镇静催眠中起主要作用。具体试验结果见实施例7-8。

[0039] (3)小鼠悬尾和强迫游泳实验

[0040] 小鼠悬尾和强迫游泳实验的抗抑郁模型的原理是为其提供一个无可回避的压迫环境，使实验中的小鼠产生一种“行为绝望和扭曲”或“对强压环境适应失败”的状态，类似于人类的抑郁状态，是广泛用于抗抑郁药物筛选的经典模型。具体试验过程如下：

[0041] 1.悬尾实验

[0042] 昆明种小鼠随机分为空白组、阳性药组(阿米替林，20mg·kg-1)、酸枣枝叶粗提物组、酸枣仁粗提取物组、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱液组、70％-90％乙醇洗脱液组和酸枣枝叶提取物组(实施例5)，每组8只。除空白组灌胃给予相应体积的生理盐水外，其余各组均分别灌胃给予相应的药物，每天1次，连续给药10天，空白组给予相应体积的生理盐水，于末次给药30min后，立即用胶布将小鼠尾距尾尖2cm处粘在平衡支架上，使其呈倒挂状态，头部离桌面约15cm，两侧用木板隔断视线，适应2min后，测定小鼠在4min内的不动时间。实验结果显示：与空白组比较，阳性药组、酸枣枝叶粗提物组、酸枣仁粗提取物、70％-90％乙醇洗脱液组和酸枣枝叶提取物组均能显著减少小鼠悬尾时的不动时间(P<0.001)，40％-60％乙醇洗脱物组接近空白组水平。

[0043] 2.强迫游泳实验

[0044] 实验动物分组同悬尾实验，将小鼠放入直径20cm，水深10cm的水桶中，水温保持(23±1)℃，适应2min后，测定小鼠在4min内的不动时间(不动时间为在水中停止挣扎、呈漂浮状态、仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间)。FST实验结果显示：与空白组比较，阳性药组、酸枣枝叶粗提取物组，酸枣仁粗提取物组，70％-90％乙醇洗脱物组均能显著减少小鼠强迫游泳时的不动时间(P<0.001)，酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物组接近空白组水平。结果表明，酸枣枝叶粗提物70％-90％乙醇洗脱物和酸枣枝叶提取物组均具有抗抑郁作用，且70％-90％乙醇洗脱物在抗抑郁中起主要作用。具体试验结果见实施例7。

[0045] 本发明的有益效果如下：

[0046] 1.本发明中所用的原料为酸枣枝叶，使酸枣树资源得到充分的开发和利用。

[0047] 2.本发明所述方法制备的酸枣枝叶提取物，具有镇静催眠、抗抑郁等方面的作用，应用于开发镇静催眠类的药物具有广阔的应用前景。

[0048] 3.本发明的提取方法使用常规提取设备，造价低廉，简便合理，工艺中没有使用到有毒的有机溶剂，无污染，有利于保护环境，适于工业化生产，总黄酮含量为15.9％-21.1％；总三萜含量为43.3％-47.8％。

[0049] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进行进一步阐述。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。具体实施方式：

[0050] 实施例1

[0051] 将酸枣枝叶100g粉碎后，以20倍量浓度为80％的乙醇溶液加热回流提取3次，每次1h，减压回收溶剂，浓缩得浸膏，然后加入浸膏重量10倍的蒸馏水，在超声的条件下溶解浸膏，将上述溶液通过D101大孔树脂层析柱，大孔树脂的用量为浸膏重量的10倍，先用水洗脱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，流速为1个柱体积/小时，然后依次用体积浓度为10％、
30％、40％、60％、70％和90％的乙醇溶液梯度洗脱，流速分别为1个柱体积/小时，用量分别为柱体积的10倍，弃去水及10-30％乙醇洗脱液，得40％-60％和70％-90％乙醇洗脱液，分光光度法测得40％-60％乙醇洗脱液中总黄酮含量为58.2％，70％-90％乙醇洗脱液中总三萜的含量为73.5％。将洗脱液合并，减压浓缩至干，得酸枣枝叶提取物，酸枣枝叶提取物中总黄酮含量为20.4％，总三萜的含量为47.8％。

[0052] 实施例2

[0053] 将酸枣枝叶100g粉碎后，以8倍量浓度为30％的乙醇溶液闪式提取2次，每次1min，回收溶剂，浓缩得浸膏，然后加入浸膏重量5倍的蒸馏水，在超声的条件下溶解浸膏，将上述溶液通过D101大孔树脂层析柱，大孔树脂的用量为浸膏重量的10倍，先用水洗脱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，流速为1个柱体积/小时，然后依次用体积浓度为10％、30％、40％、60％、70％和80％的乙醇溶液梯度洗脱，流速分别为1个柱体积/小时，用量分别为柱体积的
10倍，弃去水及10-30％乙醇洗脱液，分别得40％-60％和70％-90％乙醇洗脱液，分光光度法测得40％-60％乙醇洗脱液中总黄酮含量为50.0％，70％-90％乙醇洗脱液中总三萜的含量为66.7％。将洗脱液合并，减压浓缩至干，得酸枣枝叶提取物，酸枣枝叶提取物中总黄酮含量为16.9％，总三萜的含量为44.0％。

[0054] 实施例3

[0055] 将酸枣枝叶100g粉碎后，以10倍量水溶液冷浸提取3次，每次3h，回收溶剂，浓缩得浸膏，然后加入浸膏重量8倍的蒸馏水，在超声的条件下溶解浸膏，将上述溶液通过D101大孔树脂层析柱，大孔树脂的用量为浸膏重量的10倍，先用水洗脱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，流速为1个柱体积/小时，然后依次用体积浓度为10％、30％、40％、60％和70％的乙醇溶液梯度洗脱，流速分别为1个柱体积/小时，用量分别为柱体积的10倍，弃去水及10％-30％乙醇洗脱液，分别得40％-60％和70％-90％乙醇洗脱液，分光光度法测得40％-60％乙醇洗脱液中总黄酮含量为45.5％，70％-90％乙醇洗脱液中总三萜的含量为66.7％。将洗脱液合并，减压浓缩至干，得酸枣枝叶提取物，酸枣枝叶提取物中总黄酮含量为15.9％，总三萜的含量为43.3％。

[0056] 实施例4

[0057] 将酸枣枝叶100g粉碎后，以8倍量正丁醇热浸提取3次，每次3h，回收溶剂，浓缩得浸膏，然后加入浸膏重量10倍的蒸馏水，在超声的条件下溶解浸膏，将上述溶液通过HPD-100大孔树脂层析柱，大孔树脂的用量为浸膏重量的8倍，先用水洗脱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，流速为1个柱体积/小时，然后依次用体积浓度为水、30％、40％、60％、70％和
90％的乙醇溶液梯度洗脱，流速分别为1个柱体积/小时，用量分别为柱体积的10倍，弃去水及30％乙醇洗脱液，分别得40％-60％和70％-90％乙醇洗脱液，分光光度法测得40％-60％乙醇洗脱液中总黄酮含量为47.1％，70％-90％乙醇洗脱液中总三萜的含量为67.7％。将洗脱液合并，减压浓缩至干，酸枣枝叶提取物中总黄酮含量为16.4％，总三萜的含量为
44.1％。

[0058] 实施例5

[0059] 将酸枣枝叶100g粉碎后，以15倍量浓度为50％的甲醇溶液加热回流提取2次，每次1.5h，减压回收溶剂，浓缩得浸膏，然后加入浸膏重量10倍的蒸馏水，在超声的条件下溶解浸膏，将上述溶液通过AB-8大孔树脂层析柱，大孔树脂的用量为浸膏重量的10倍，先用水洗脱，冲洗至苯酚-硫酸试液反应阴性，流速为1个柱体积/小时，然后依次用体积浓度为30％、
40％、60％、70％和80％的乙醇溶液梯度洗脱，流速分别为1个柱体积/小时，用量分别为柱体积的10倍，弃去水及10％-30％乙醇洗脱液，分别得40％-60％和70％-80％乙醇洗脱液，分光光度法测得40％-60％乙醇洗脱液中总黄酮含量为60.7％，70％-90％乙醇洗脱液中总三萜的含量为72.4％。将洗脱液合并，减压浓缩至干，酸枣枝叶提取物中总黄酮含量为
21.1％，总三萜的含量为46.9％。

[0060] 实施例6单体化合物的分离鉴定

[0061] (1)将40％-60％的乙醇洗脱液浓缩后经聚酰胺柱色谱，用0％-90％乙醇水溶液梯度洗脱，其中经聚酰胺柱色谱洗脱下的30％乙醇流份再经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷-甲醇(5:1-3:1)梯度洗脱。得到4个流份。将流份1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，再经反相制备型高效液相分离，甲醇-水(53：47)洗脱，得到化合物1山奈酚-3-O-芸香糖苷；将流份2经ODS柱色谱及反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱，得到化合物2芦丁和化合物3槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；将流份3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，再经反相制备型高效液相分离，甲醇-水(36：64)洗脱，得到化合物4槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基(1→2)-α-L-鼠李糖和化合物5山奈酚；将流份4进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇(100:0-100:50)梯度洗脱，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇(4:1:1)洗脱，得到化合物6槲皮素、化合物7(+)-儿茶素和化合物8 2R,3R-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyflavane。

[0062] 将Fr.4进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇-水(100:0:0-0:0:100)梯度洗脱，流分经ODS柱色谱及反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱得到化合物9lupeol和化合物10maslinic acid。

[0063] (2)将70％-90％的乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇(100:0-100:10)梯度洗脱，得到6个流份(Fr.1～Fr.6)。

[0064] 1)Fr.2进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(100:0-1:1)梯度洗脱，流份经反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化及重结晶等手段得化合物11齐墩果酸、化合物12白桦脂酸、化合物13epiceanothic acid和化合物14麦珠子酸。

[0065] 2)将Fr.3进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇(100:0-100:50)梯度洗脱，流份经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，再进行反相制备型高效液相分离，用甲醇-水(40:60)洗脱，得到化合物15(R)-3-苯基乳酸甲酯和化合物16(S)-3-(3-吲哚基)乳酸甲酯。

[0066] 结构鉴定

[0067] 主要利用光谱，包括紫外、质谱和核磁共振谱(1HNMR、13CNMR)等分析手段，鉴定其结构。

[0068] 化合物的理化常数及主要光谱数据

[0069] 化合物1山奈酚-3-O-芸香糖苷

[0070] 分子式C28H31O15，黄色无定形粉末，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，盐酸-镁粉、1
Molish反应均为阳性。H-NMR(300MHz，DMSO-d6)谱δ：7.98(2H,d,J＝8.1Hz,H-2′,6′)、6.87(2H,d,J＝8.1Hz,H-3′,5′)、6.32(1H,d,J＝1.8Hz,H-8)、6.16(1H,J＝1.8Hz,H-6)、5.30(1H,d,J＝7.2Hz,H-1″)、4.38(1H,brs,H-1″′)、2.5-3.8(10H,m,sugar)、0.98(3H,d,J＝
6.0Hz,CH3)。13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)。

[0071] 化合物3槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷

[0072] 分子式C21H20O12，黄色无定形粉末，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，盐酸-镁粉、Molish反应均为阳性。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)谱δ:6.18(1H,brs,H-6)、6.40(1H,brs,H-8)、6.83(1H,d,J＝9Hz，H-5′)、7.56(2H,m,H-6′、2′)、12.61(1H,s,5-OH)为槲皮素母核质子
13
信号。5.45(1H,d,J＝7.2Hz)为糖端基质子信号，并根据偶合常数确定苷健构型为β型。C-NMR(125MHz,DMSO-d6)：见表1。

[0073] 化合物4槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基(1→2)-α-L-鼠李糖苷

[0074] 分子式C26H28O15，黄色无定性粉末，ESI-MS m/z：603[M+Na]+,579[M-H]－,615[M-Cl]－。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，盐酸-镁粉、Molish反应均为阳性。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ：6.16(1H,brs,H-6)、6.35(1H,brs,H-8)、6.87(1H,d,J＝8.3Hz,H-5′)、7.25(1H,brd,J＝8.3Hz,H-6′)、7.33(1H,brs,2′)、12.73(1H,s,5-OH)为槲皮素母核质子信号。5.30(1H,brs,H-1″)、4.09(1H,d,J＝6.84Hz，H-1″′)为糖端基质子信号。13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)：见表1。

[0075] 化合物7(+)-儿茶素

[0076] 分子式C15H14O6：白色无定型粉末。紫外灯(254nm)下为一黄色暗斑,体积分数为10％的硫酸乙醇溶液显色呈棕黄色。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)谱δ：4.48(1H，d，7.2Hz,H-2)、
3.82(1H，m，H-3)、2.35(1H，dd，J＝15.9、8.1Hz，H-4)，2.66(1H，dd，J＝15.9、5.4Hz，H-4)、
6.60(1H，dd，J＝8.1、1.8Hz，H-6′)、6.69(1H，d，J＝8.1Hz、H-5′)、6.72(1H，d，J＝1.8Hz、H-
2′)、5.69(1H，d，J＝2.1Hz，H-6)、5.89(1H，d，J＝2.4Hz，H-8)。由2位氢的偶合常数推断C-2和C-3位氢成反式构型。13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：见表2。

[0077] 化合物8 2R,3R-3,5,7,3′,5′-pentahydroxy flavane

[0078] 分子式C15H14O6，红色无定型粉末，[α]20D＝-35°(c1.6,MeOH)。紫外灯(254nm)下为一黄色暗斑,体积分数为10％的硫酸乙醇溶液显色呈棕黄色。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)谱δ：δ4.72(1H,s,H-2)、4.00(1H,s,H-3)、2.67(1H,dd,J＝16.2、4.2Hz，H-4)和2.44(1H,d,J＝
3.3Hz，H-4)、6.66(2H,m,H-2′,H-6′)、6.88(1H,s,H-4′)、5.71(1H,d,J＝1.8Hz,H-6)、5.88(1H,d,J＝1.8Hz,H-8)，2位氢4.72(1H,s)呈现单峰，没有裂分推断C-2和C-3位氢成顺式构型。13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：见表2。

[0079] 化合物15(R)-3-苯基乳酸甲酯

[0080] 分子式C10H11O3：白色结晶，[α]20D＝9.2°(c0.4,CHCl3)，体积分数为10％硫酸乙醇溶液显紫色。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)谱δ：2.80(1H,dd,J＝13.8、8.1Hz)、2.93(1H,dd,J＝13.8、5.1Hz)为CH2质子信号，4.23(1H,dd,J＝4.8、8.1Hz)为连氧的CH质子信号，3.58(3H,s)为OCH3质子信号，7.24(5H,m)为苯基质子信号。13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)：见表3。

[0081] 化合物16(S)-3-(3-吲哚基)乳酸甲酯

[0082] 分子式C12H12O3:白色粉末，[α]20D＝-24°(c1.0,CHCl3)，碘化铋钾反应阳性。1H-NMR(300Hz,CDCl3)谱δ：8.08(1H,s,H-NH)，7.60(1H,d,J＝7.8Hz)、7.34(1H,d,J＝8.1Hz)、7.18(1H,t,J＝9Hz)和7.12(1H,t,J＝9Hz)为邻二取代苯环上质子信号，7.08(1H,s)为吲哚环上的氢信号，3.30(1H,dd,J＝14.7Hz、4.2Hz)、3.18(1H,dd,J＝14.7Hz、6Hz)为CH2质子信号，4.52(1H,t,J＝5.25Hz)为连氧的CH质子信号。13C-NMR(75MHz,CDCl3)：见表3。

[0083] 表1化合物3、4的13CNMR化学位移值

[0084]

[0085]

[0086] 表2化合物7、8的13CNMR化学位移值

[0087]碳原子 化合物5(δ，溶剂DMSO-d6) 化合物6(δ，溶剂DMSO-d6)
1 - 174.7
2 81.1 78.1
3 66.4 64.9
4 27.9 28.3
5 156.5 155.8
6 93.9 95.2
7 156.3 156.6
8 95.2 94.2
9 155.4 156.3
10 99.2 98.6
1′ 130.7 130.7
2′ 114.6 114.9
3′ 144.9 144.5
4′ 144.9 118.0
5′ 115.2 144.4
6′ 118.5 114.8

[0088] 表3化合物15、16的13C-NMR化学位移值

[0089]碳原子 化合物15(δ，溶剂DMSO-d6) 化合物16(δ，溶剂CDCl3)
1 174.0 174.7
2 71.3 70.8
3 39.6 30.3
1′ 137.7 -
2′ 129.4 123.2
3′ 128.1 110.1
4′ 126.3 118.8
5′ 128.1 119.5
6′ 129.4 122.1
7′ - 111.2
8′ - 136.1
9′ - 127.6
-OCH3 51.4 52.4

[0090] 此外化合物2芦丁、化合物5山奈酚、6槲皮素、9lupeol、10maslinic acid、11齐墩果酸、12白桦脂酸、13epiceanothic acid、14麦珠子酸等通过用三种不同展开剂与对照品共薄层方法鉴定出来。

[0091] 实施例7对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的影响

[0092] 昆明种小鼠随机分为6组，每组8只，空白对照组(生理盐水)、阳性对照组(天麻素片，50mg·kg-1)、酸枣仁粗提取物、酸枣枝叶粗提取物、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物(实施例1)、酸枣枝叶70％-90％乙醇洗脱物(实施例1)、酸枣枝叶提取物组(实施例1)，连续灌胃给药5d，于末次给药60min后，腹腔注射戊巴比妥钠50mg·kg-1(阈上剂量指90％的小鼠入睡的剂量)，观察并记录小鼠发生睡眠只数、睡眠潜伏期及睡眠持续时间。以注射戊巴比妥钠后15min内翻正反射消失达1min以上者确定为阳性，以注射戊巴比妥钠后15min内出现翻正反射消失为睡眠潜伏期；以动物翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间。结果以 表示。组与组之间的比较采用配对t检验。多组之间的比较采用单因素方差分析，全部数据均采用Spss 16.0统计软件进行处理。结果显示各给药组对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的睡眠潜伏期均无显著性影响，除酸枣枝叶70％-90％乙醇洗脱物组外，其他各给药组均能显著增加小鼠睡眠时间(P<0.01)。结果见表4。

[0093] 表4对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡的影响

[0094]

[0095] **表示与空白组相比P＜0.01

[0096] 实施例8酸枣枝叶提取物对氯苯丙胺酸(PCPA)致失眠大鼠血清细胞因子的影响[0097] 随即将健康清洁级雄性SD大鼠70只，分为7组，空白组、模型组、阳性药组(药物)、酸枣枝叶粗提取物组、酸枣仁粗提取物、酸枣枝叶粗提取物组、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物(实施例1)和酸枣枝叶70％-90％乙醇洗脱物(实施例1)、酸枣枝叶提取物组(实施例1)。除正常对照组外，其他各组均一次性腹腔注射PCPA300mg/kg，连续注射两天，30h后观察大鼠行为，复制大鼠完全失眠模型。造模成功后的大鼠，除空白组与模型组分别给予相同体积的生理盐水，其他各组每只按1mL/100g灌胃，酸枣枝叶粗提取物组和酸枣仁粗提取物组及40％-60％酸枣枝叶乙醇洗脱物和70％-90％酸枣枝叶乙醇洗脱物剂量按折算的生药量
5.4g/kg给药，阳性药组按0.9mg/mL浓度给药，每天1次，连续10d。实验各组于末次给药24h后眼眶取血3mL，静置1h，4℃过夜，1500r/min离心30min，取上清液，大鼠血清中IL-1β和TNF-α的含量采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测，均严格按照试剂盒操作，结果见表5。

[0098] 表5各组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比较 (pg·mL-1)

[0099]

[0100] 统计方法：方差分析；##P＜0.01，与空白组比较；*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较。

[0101] 表5中结果显示，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量均减少，与空白组比较有显著性差异(P<0.01)；阳性药组、酸枣仁粗提取物组、酸枣枝叶粗提取物组、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组的大鼠IL-1β、TNF-α的含量升高，与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结果表明酸枣枝叶粗提取物和酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物和酸枣枝叶提取物组对与睡眠有关的细胞因子的含量有明显的改善作用，提示酸枣枝叶粗提取物\酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组均具有镇静催眠的作用。

[0102] 实施例9酸枣枝叶提取物的抗抑郁作用研究

[0103] (1)悬尾实验

[0104] 昆明种小鼠随机分为6组：空白组、阳性药组(阿米替林，20mg·kg-1)及酸枣枝叶粗提物组、酸枣仁粗提取物组、酸枣枝叶粗提取物组、酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱液组(实施例5)、酸枣枝叶70％-90％乙醇洗脱液组(实施例5)、酸枣枝叶提取物组(实施例5)，每组8只。除空白组给予相应体积的生理盐水外，其余各组均分别灌胃给予相应的药物，剂量按折算的生药量8g/kg给药。每天1次，连续给药10天，空白组于末次给药30min后，立即用胶布将小鼠尾距尾尖2cm处粘在平衡支架上，使其呈倒挂状态，头部离桌面约15cm，两侧用木板隔断视线，适应2min后，测定小鼠在4min内的不动时间。实验结果显示：与空白组比较，阳性药组、酸枣枝叶粗提物组、70％-90％乙醇洗脱液组和酸枣枝叶提取物组均能显著减少小鼠悬尾时的不动时间(P<0.001)，40％-60％乙醇洗脱物组接近空白组水平。结果见表6。

[0105] (2)强迫游泳实验

[0106] 动物分组同悬尾实验，将小鼠放入直径20cm，水深10cm的水桶中，水温保持(23±1)℃，适应2min后，测定小鼠在4min内的不动时间(不动时间为在水中停止挣扎、呈漂浮状态、仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间)。FST实验结果显示：与空白组比较，阳性药组、酸枣枝叶粗提取物组、酸枣枝叶70％-90％乙醇洗脱物组和酸枣枝叶提取物组均能显著减少小鼠强迫游泳时的不动时间(P＜0.001)，40％-60％乙醇洗脱物组接近空白组水平，与悬尾实验结果相一致。结果见表6。

[0107] 表6悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间的测定

[0108]

[0109] 表6中悬尾实验和强迫游泳实验结果显示除酸枣枝叶40％-60％乙醇洗脱物组无显著缩短小鼠的悬尾不动时间和强迫游泳不动时间外，其余各组均能显著缩短小鼠的不动时间(P＜0.001)，提示70％-90％乙醇洗脱物为酸枣叶抗抑郁部位。

[0110] 实施例10含酸枣枝叶提取物的颗粒剂及其制备

[0111]处方： 成分 ％(重量)
酸枣枝叶粗提取物 15
蔗糖 65
预胶化淀粉 10
糊精 10

[0112] 制法：将酸枣枝叶提取物、蔗糖、预胶化淀粉和糊精混合均匀，加入适量75％乙醇制成软材，18目筛制湿颗粒，50℃烘箱干燥30min，取出后过18目筛整粒，分装，即得酸枣枝叶提取物颗粒剂。

[0113] 实施例11含酸枣枝叶粗提取物的片剂及其制备

[0114]处方： 成分 ％(重量)
酸枣枝叶提取物 15
微晶纤维素 77
羧甲基淀粉钠 7.5
硬脂酸镁 0.5

[0115] 制法：将酸枣枝叶提取物、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量75％乙醇制成软材，软材过18目筛制湿粒，湿粒于50℃烘箱中干燥30min，取出后过18目筛整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，即得酸枣枝叶提取物片剂。

[0116] 实施例12含酸枣枝叶提取物的胶囊剂及其制备

[0117]处方： 成分 ％(重量)
酸枣枝叶提取物 15
糊精 45
淀粉 40

[0118] 制法：取处方量的酸枣枝叶提取物粉碎过80目筛，加入淀粉、糊精、混合均匀，装入胶囊，即得酸枣枝叶提取物胶囊。

[0119] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。