一种基于阿司匹林的碳量子点及其生物应用

摘要

基于阿司匹林的碳量子点及细胞成像及抗炎治疗方面的应用，属于纳米药物技术领域。具体涉及在水合肼溶液促进阿司匹林溶解的情形下，利用微波加热法将其制备成具有强荧光性质的碳量子点。该方法制备的碳量子点在高盐浓度和生理pH条件下非常稳定，保持了蓝色荧光，并可进入细胞核，对细胞进行有效示踪；同时还保留了阿司匹林原有的抗炎功效，在利用角叉菜胶构建的急性炎症模型中，可有效抑制炎细胞产生；此外，所制备的阿司匹林碳量子点毒性较小，在体内应用不会对肝功、肾功以及心、肝、脾、肾等脏器产生影响，可实现纳米材料具有诊治双重功效的目标。

权利要求

1.一种基于阿司匹林的碳量子点，其特征在于：其由如下步骤制备得到，(1)基于阿司匹林的碳量子点的制备：将1.0～2.5g阿司匹林加入到含有0.5～2mL、质量浓度98％水合肼的水溶液中，整个体系的总体积控制在10～20mL；而后将该溶液放入微波炉中，在80～100W下加热6～10分钟，从而得到具有蓝色荧光的碳量子点；

(2)碳量子点的分离提纯：向步骤(1)所制备的碳量子点加入50～100mL去离子水，超声分散产物，然后用分子量为1800～10000的渗析袋分离提纯所制备的碳量子点，渗析3～7天后，再用孔径为0.22～0.45μm的水系滤头过滤所得产物，经过旋转蒸发后浓缩至10～20mL，最后冻干浓缩液，得到棕黄色的基于阿司匹林的碳量子点粉末。

2.权利要求1所述的一种基于阿司匹林的碳量子点在制备细胞成像或抗炎治疗药物方面的应用。

说明书

一种基于阿司匹林的碳量子点及其生物应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米药物技术领域，具体涉及制备一种基于阿司匹林的碳量子点，该碳量子点通过微波加热阿司匹林和水合肼即可获得，具有强荧光性质，且保留了阿司匹林的药物活性，因而可以应用于细胞成像及抗炎治疗方面。

背景技术

[0002] 近些年来，纳米技术用于基因/药物的转运和治疗，或用作诊断探针在医学中得以应用，这种纳米技术与医学的结合称为纳米医学。而这一领域面临的核心问题是如何设计一种多功能的纳米材料，既能够用于疾病的诊断，又可用作疾病的治疗。具有荧光性质的碳量子点作为碳纳米材料家族的新成员，在纳米技术领域引起了学者的广泛关注。这些表面钝化的碳量子点尺寸通常小于10nm，由于具有稳定的荧光性质，宽激发谱和可调的发射峰位等优势被应用于生物标记。与传统的有机染料和半导体量子点相比，碳量子点具有良好的生物相容性和低毒性，因此，在纳米医学中具有良好的应用前景。

[0003] 作为非甾体抗炎药主要代表，阿司匹林(乙酰水杨酸)已经有上百年的历史，其作用虽已得到认可，但尚存在损伤胃肠道、水溶性差等问题。尽管对于阿司匹林的改性从未停止，但真正能被实际应用的却很少。因此，找到一种既能提高阿司匹林的水溶性，又能减轻其对胃肠道的损伤是解决这一问题的关键。

[0004] 目前，碳量子点在生物医学中主要用于生物成像或药物/基因的转运，而将药物直接做成碳量子点的研究却未见报道，对于药物做成碳量子点后生物学活性是否保留更未见研究。如能将阿司匹林制备成碳量子点，既能改善其水溶性，又能在示踪、抗炎及防治心脑血管疾病方面具有应用前景。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种基于阿司匹林的多功能碳量子点及生物应用。通过对传统药物阿司匹林的改性，水溶性得到提高。本发明制备的碳量子点在高盐浓度和生理pH条件下非常稳定，保持了蓝色荧光，并可进入细胞核，对细胞进行有效示踪；同时还保留了阿司匹林原有的抗炎功效，在利用角叉菜胶构建的急性炎症模型中，可有效抑制炎细胞产生；此外，所制备的阿司匹林碳量子点毒性较小，在体内应用不会对肝功、肾功以及心、肝、脾、肾等脏器产生影响，可实现纳米材料具有诊治双重功效的目标。

[0006] 本发明利用微波加热方法，前期将阿司匹林在水合肼的辅助作用下溶于去离子水中，微波加热后即可得到强荧光、具有药物活性的碳量子点，其尺寸分布在2～6nm。经过分离提纯后，这种碳量子点可以应用于细胞成像及抗炎治疗方面。

[0007] 本发明采用的原料都是商业上可以直接买到的物质，不需要进一步处理，按照一定比例直接混合即可，因此实验操作简便，危险性小，并且具有良好的实验重复性，可以批量生产，同时得到的碳量子点具有高荧光量子效率。

[0008] 本发明所述的基于阿司匹林的碳量子点的制备，包括如下步骤：(1)通过微波法制备基于阿司匹林的碳量子点；(2)对所制备的碳量子点进行分离提纯。

[0009] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备：将1.0～2.5g阿司匹林加入到含有0.5～2mL、质量浓度98％水合肼的水溶液中，整个体系的总体积控制在10～20mL；而后将该溶液放入微波炉中，在80～100W下加热6～10分钟，从而得到具有蓝色荧光的碳量子点；

[0010] (2)碳量子点的分离提纯：向步骤(1)所制备的碳量子点中加入50～100mL去离子水中，超声分散产物，然后用分子量为1800～10000的渗析袋分离提纯所制备的碳量子点，渗析3～7天后，将渗析袋内产物用孔径为0.22～0.45μm的水系滤头过滤，所得产物经过旋转蒸发后浓缩至10～20mL，最后冻干浓缩液，得到棕黄色的基于阿司匹林的碳量子点粉末。

附图说明

[0011] 图1：利用微波法制备的基于阿司匹林的碳量子点的透射电镜照片(a)，粒径尺寸分布图(b)，高分辨透射电镜照片(c)，以及粉末衍射谱图(d)，说明所制备的碳量子点尺寸分布较窄、单分散性好，具有明显的晶格；

[0012] 图2：利用微波法制备的基于阿司匹林的碳量子点的紫外吸收谱图(a)，荧光激发谱(b中实线)和发射谱(b中虚线)，以及碳量子点在室光下(b中左插图)和紫外光下(b中右插图)的照片，说明所制备的碳量子点具有很强的蓝色荧光；

[0013] 图3：利用微波法制备的基于阿司匹林的碳量子点的红外谱图，说明所制备的碳量子点保留了阿司匹林中的乙酰基基团；

[0014] 图4：利用微波法制备的基于阿司匹林的碳量子点在不同浓度KCl盐溶液中的稳定性曲线(a)，以及在不同pH溶液中的稳定性曲线(b)，说明碳量子点具有很好的稳定性，可以应用于生物体系；

[0015] 图5：利用所制备的基于阿司匹林的碳量子点与子宫颈癌细胞共培养后的共聚焦显微镜图片。波长为400nm的光激发下的暗场图片(a)，明场图片(b)，以及明场暗场叠加后图片(c)，说明碳量子点可以用于细胞成像；

[0016] 图6：利用所制备的碳量子点在大鼠体内抗炎效果组织学切片结果。空白对照组(a，b，c)炎细胞层较厚，有大量炎细胞，而阿司匹林组(d，e，f)和基于阿司匹林的碳量子点组(g，h，i)炎症明显减轻，炎细胞相对减少；

[0017] 图7：阿司匹林与基于阿司匹林的碳量子点对血清生化指标的影响。基于阿司匹林的碳量子点对肝脏功能指标谷丙转氨酶(a)，和谷草转氨酶(b)无明显影响，对肾功能指标尿素氮(c)和肌酐(d)也无明显影响；

[0018] 图8：阿司匹林与基于阿司匹林的碳量子点对脏器的影响。腹腔注射碳量子点组大鼠的心(i)，肝(j)，脾(k)，肾(l)与空白对照组(a，b，c，d)和阿司匹林组(e，f，g，h)中的相应器官无明显组织学差异。

具体实施方式

[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。

[0020] 实施例1

[0021] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备：将2g乙酰水杨酸加入到含有1.08mL质量浓度为98％的水合肼水溶液中，整个体系的总体积为10mL。微波功率为100W，时间为8分钟。得到具有蓝色荧光的基于阿司匹林的碳量子点。

[0022] (2)碳量子点的分离提纯：向步骤(1)所制备的碳量子点中加入80mL去离子水，超声分散产物，用分子量为3500的渗析袋分离提纯所制备的碳量子点，渗析7天后，用粒径为0.22μm的水系滤头过滤所得产物，经过旋转蒸发后浓缩至10mL后，冻干得到基于阿司匹林的碳量子点粉末(棕黄色)，产量约为50mg。

[0023] 透射电镜下观察可见所得到的基于阿司匹林的碳量子点尺寸分布在2～6nm，如图1所示。

[0024] 实施例2

[0025] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备：将1g乙酰水杨酸加入到含有1.08mL的98％水合肼的水溶液中，整个体系的总体积为10mL。微波功率为100W，时间为7分钟。得到具有蓝色荧光的基于阿司匹林的碳量子点。

[0026] (2)碳量子点的分离提纯：向步骤(1)所制备的碳量子点中加入50mL去离子水，超声分散产物，用分子量为3500的渗析袋分离提纯所制备的碳量子点，渗析7天后，用粒径为0.22μm的水系滤头过滤所得产物，经过旋转蒸发后浓缩至5mL，冻干得到基于阿司匹林的碳量子点粉末(棕黄色)，产量约为30mg。所得碳量子点具有强荧光性质，如图2b所示。

[0027] 实施例3

[0028] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备：将2g乙酰水杨酸加入到含有0.54mL的98％水合肼的水溶液中，整个体系的总体积为10mL。微波功率为100W，时间为8分钟。得到具有蓝色荧光的基于阿司匹林的碳量子点。

[0029] (2)碳量子点的分离提纯：向步骤(1)所制备的碳量子点中加入60mL去离子水，超声分散产物，用分子量为3500的渗析袋分离提纯所制备的碳量子点，渗析7天后，用粒径为0.45μm的水系滤头过滤所得产物，经过旋转蒸发后浓缩至5mL后，冻干得到基于阿司匹林的碳量子点粉末(棕黄色)，产量约为40mg。经过红外测试，可知碳量子点保留了阿司匹林中的乙酰基，如图3所示

[0030] 实施例4

[0031] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备：将2g乙酰水杨酸加入到含有2.16mL的98％水合肼的水溶液中，整个体系的总体积为10mL。微波功率为100W，时间为8分钟。得到具有蓝色荧光的基于阿司匹林的碳量子点。

[0032] (2)碳量子点的分离提纯：向步骤(1)所制备的碳量子点中加入80mL去离子水，超声分散产物，用分子量为3500的渗析袋分离提纯所制备的碳量子点，渗析7天后，用粒径为0.22μm的水系滤头过滤所得产物，经过旋转蒸发后浓缩至10mL后，冻干得到基于阿司匹林的碳量子点粉末(棕黄色)，产量约为50mg。而后配制浓度为0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、
1.5、1.75和2.0mol/L的KCl盐溶液，以及利用盐酸和氢氧化钠调节去离子水得到的pH为
1.8、2.3、3.2、4.2、4.9、6.1、7.2、8.1、8.9、9.8、10.8和12.5的水溶液，随后在上述每种溶液(3mL)中加入0.1g的碳量子点，最后检测溶液荧光强度，如图4所示。

[0033] 实施例5

[0034] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备和提纯如实施例1所述。

[0035] (2)由于所制备的基于阿司匹林的碳量子点具有荧光性质，考虑其可用于细胞标记。将人子宫颈癌细胞以20万/孔接种于共聚焦显微镜专用平皿中，在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养。过夜细胞贴壁后，更换培养基，加入碳量子点，终浓度为20μg/mL。共培养6小时后，弃培养基，磷酸缓冲盐溶液冲洗2遍，4％多聚甲醛固定10分钟，磷酸缓冲盐溶液冲洗2遍。当激发波长为400nm时，激光共聚焦显微镜下观察可见，整个细胞呈蓝色(图5)，说明碳量子点进入细胞浆，并可穿过核膜，进入细胞核，对细胞进行有效标记。

[0036] 实施例6

[0037] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备和提纯如实施例1所述。

[0038] (2)由于阿司匹林发挥抗炎作用的机制是其酯键通过与环氧合酶的丝氨酸残基发生乙酰化反应，从而抑制前列腺素E2形成，发挥抗炎作用，而我们在反应中并没有破坏阿司匹林的酯键，因此理论上说明其生物学作用应该保留。为考察所制备的基于阿司匹林的碳量子点的生物学活性，我们选取雄性Wistar大鼠(160～180g)，分别腹腔注射等体积的磷酸缓冲盐溶液，阿司匹林和基于阿司匹林的碳量子点(20mg/kg)溶液。半小时后，将尺寸为2.0×1.0×0.5cm的聚酯纤维海绵浸润在质量浓度为1％的角叉菜胶溶液后，取出，植入大鼠背部皮下，最后用3/0手术缝合线缝合。术后5小时，质量浓度为4％的多聚甲醛心脏灌流固定处死，取皮下组织，固定，逐级脱水，进行组织学染色。

[0039] 显微镜下观察可见，空白对照组(注射磷酸缓冲盐溶液)炎细胞层较厚，有大量炎细胞，如中性粒细胞、淋巴细胞浸润(图6)；而注射阿司匹林和基于阿司匹林的碳量子点组(图6)，炎症明显减轻，炎细胞相对减少。说明基于阿司匹林的碳量子点仍保留了原有的抗炎活性，且效果要优于单纯药物阿司匹林。分析原因，一方面由于纳米材料比表面积相对较大，因为单位体积中其表面结合位点相对较多；另一方面，碳量子点比单纯药物阿司匹林水溶性有所提高，且略带正电，可促进其在体内循环和进入细胞中。

[0040] 实施例7

[0041] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备和提纯如实施例1所述。

[0042] (2)为考察所制备的基于阿司匹林的碳量子点的生物毒性。我们通过体内动物实验，观察了其对血清生化中肝功、肾功等指标的影响。雄性Wistar大鼠(160～180g)分别腹腔注射等体积的磷酸缓冲盐溶液，阿司匹林和基于阿司匹林的碳量子点(20mg/kg)溶液。分别于1，3和7天取眼球血，收集于不含肝素的采血管中，静置1～2小时，3000rpm离心5分钟，取上清用于生化指标检测。

[0043] 谷丙转氨酶和谷草转氨酶是肝脏功能的重要检测指标，与空白对照组(注射磷酸缓冲盐溶液)相比，阿司匹林组和基于阿司匹林的碳量子点组虽略有差异(图7)，但该差异没有统计学意义，且各组指标均在正常范围内，说明对肝脏功能无明显影响。尿素氮和肌酐是肾功能的重要评价指标，与空白对照组相比，阿司匹林组和基于阿司匹林的碳量子点组均在正常范围内(图7)，无明显差异。以上血清生化检测，初步说明所制备的基于阿司匹林的碳量子点生物安全性较好，对肝脏和肾脏功能无明显影响。

[0044] 实施例8

[0045] (1)基于阿司匹林的碳量子点的制备和提纯如实施例1所述。

[0046] (2)关于对基于阿司匹林的碳量子点的生物毒性考察，除取眼球血进行血清生化分析外，同时4％多聚甲醛对大鼠(实施例7中)灌流固定，取心、肝、脾和肾等器官进行固定、逐级脱水和组织学染色，以明确基于阿司匹林的碳量子点是否会引起脏器的损伤、炎症或其它病变。

[0047] 显微镜下观察可见，与空白对照组相比，阿司匹林组和基于阿司匹林的碳量子点组没有明显的组织学变化(图8)，说明生物安全性较好，不会引起脏器损伤、炎症或其它病变。