C21甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种C21甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述C21甾体皂苷苷元衍生物的结构如式IX所示，本发明具有更好的生物活性、更高的选择性以及更低的毒性等优点。对人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞有明显的抑制作用，其中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F。

权利要求

1.一种C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，

所述C21甾体皂苷苷元衍生物的结构如式IX所示，

其中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F；

其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、制备对肼基苯甲酸甲酯，向反应器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液和无水乙醇，反应后制得结构如式II所示的化合物；

步骤2、向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物和结构如式II所示的化合物，反应后获得结构如式III所示的化合物；

步骤3、向反应器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物和乙醇，制得结构如式V所示的化合物；

步骤4、将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，反应得到结构如式VI所示的化合物；

步骤5、将结构如式VI所示的化合物、KOH加入到甲醇、THF的混合溶液中，反应后获得结构如式VII所示的化合物；

步骤6、把结构如式VII所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应得到结构如式VIII所示的化合物；

步骤7、向反应器中加入结构如式VIII所示的化合物、二氯甲烷，并滴加三溴化硼，制取目标化合物；

式IV～VIII中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F。

2.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤1进一步为：在0±5℃下，依次向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜和对肼基苯甲酸，搅拌30～

40min后，在常温下继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯；

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液、无水乙醇，搅拌2-3h后，回流反应7-9h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到的固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的结构如式II所示的化合物。

3.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤2进一步为：在冰水浴搅拌作用下，依次向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、结构如式II所示的化合物，反应20～40min后，回流反应5-7h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式III所示的化合物。

4.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤3进一步为：在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物和乙醇，继续搅拌反应3～6h后，用盐酸酸化，调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥后得结构如式V所示的化合物。

5.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤4进一步为：依次将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应20～40min后，有部分固体不溶；回流反应5-8h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式VI所示的化合物。

6.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步为：将结构如式VI所示的化合物和KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，回流反应4～

8h，TLC跟踪反应，反应结束后，用盐酸酸化，调节pH至酸性，将溶液倒入饱和食盐水中，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式VII所示的化合物。

7.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤6进一步为：把结构如式VII所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，在0±5℃搅拌下滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应20～40min，在35±5℃搅拌下接着反应6～10h，TLC跟踪反应，反应结束后，将反应液倒入饱和食盐水中，过滤，固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯得到结构如式VIII所示的化合物。

8.如权利要求1所述的C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤7进一步为：在-20±5℃搅拌下，依次向反应器中加入结构如式VIII所示的化合物、二氯甲烷，并滴加三溴化硼，搅拌20～40min，室温继续反应8～12h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的目标化合物。

说明书

C21甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物

中的应用 

技术领域

[0001] 本发明属于药物化学领域，尤其是一种C21甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 从中药通关藤中经过提取分离纯化可以得到甾体皂苷类成分，其苷元是由21个C原子构成的独特甾体皂苷结构，因此称为C21甾体皂苷。现有研究表明，具有C21甾体皂苷母核的化合物具有免疫调节、平喘等药理活性，在临床上已经作为药物的指标性活性成分在临床上已经得到了较广泛的应用。

[0003] 发明人经研究发现：具有C21甾体皂苷母核的化合物具有良好的抗肿瘤的活性，对多种肿瘤具有较好的抑制作用，如对肝癌、肺癌、食道癌等均具有较好的抑制活性。目前对此类C21甾体皂苷的研究还不深入，主要是根据其理化性质对其进行分离纯化和分析检测研究、针对其母核进行结构修饰研究、以及针对其结构特征进行药理活性研究。

[0004] 如何使其具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性是当前的重要研究内容。

发明内容

[0005] 发明目的：一个目的是提供一种抗肿瘤化合物，以至少解决现有技术存在的部分问题。进一步的目的是提供一种抗肿瘤化合物的制备方法。更进一步的目的是提供一种抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0006] 技术方案：一种C21甾体皂苷苷元衍生物，结构如式IX所示，

[0007]

[0008] 其中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F。

[0009] 一种C21甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，

[0010] 所述C21甾体皂苷苷元衍生物的结构如式IX所示，

[0011]

[0012] 其中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F；

[0013] 包括如下步骤：

[0014] 步骤1、制备对肼基苯甲酸甲酯，向反应器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液和无水乙醇，反应后制得结构如式II所示的化合物；

[0015] 步骤2、向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物和结构如式II所示的化合物，反应后获得结构如式III所示的化合物；

[0016] 步骤3、向反应器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物和乙醇，制得结构如式V所示的化合物；

[0017] 步骤4、将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，反应得到结构如式VI所示的化合物；

[0018] 步骤5、将结构如式VI所示的化合物、KOH加入到甲醇、THF的混合溶液中，反应后获得结构如式VII所示的化合物；

[0019] 步骤6、把结构如式VII所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应得到结构如式VIII所示的化合物。

[0020] 步骤7、向反应器中加入结构如式VIII所示的化合物、二氯甲烷，并滴加三溴化硼，制取目标化合物；

[0021]

[0022]

[0023] 式IV～VIII中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F。

[0024] 在优选的实施例中，其特征在于，所述步骤1进一步为：

[0025] 在0±5℃下，依次向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜和对肼基苯甲酸，搅拌30～40min后，常温继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯；

[0026] 在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液、无水乙醇，搅拌2～3h后，回流反应7-9h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到的固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的结构如式II所示的化合物。

[0027] 更优选的，将I 10mmol溶于无水乙醇50ml.滴加1mol/L的盐酸5ml。

[0028] 在优选的实施例中，所述步骤2进一步为：

[0029] 在冰水浴搅拌作用下，依次向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、结构如式II所示的化合物，反应20～40min后，再回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式III所示的化合物。

[0030] 更优选的，各反应物摩尔比：II：重氮甲烷：三溴化硼＝1:1.2～1.5:1.5～2.0。进一步优选的，比例为1:1.2:2.0、1:1.4:1.5。

[0031] 在优选的实施例中，所述步骤3进一步为：

[0032] 在室温(本文中，室温指15℃～25℃)搅拌下，依次向反应器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物和乙醇，继续搅拌反应3～6h后，用盐酸酸化，调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥后得结构如式V所示的化合物。

[0033] 更优选的，各反应物摩尔比：IV：III：三溴化硼＝1:1:1～1.5。进一步优选的，比例为1:1:1.5、1:1:1。

[0034] 在优选的实施例中，所述步骤4进一步为：

[0035] 依次将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应20～40min后，仍有部分固体不溶；回流反应5～8h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式VI所示的化合物。

[0036] 更优选的，摩尔比：V:对肼基苯磺酰胺:乙酸＝1：1.2～1.5：0.5。进一步优选的，比例为1:1.2:0.5、1:1.5:0.5。

[0037] 在优选的实施例中，所述步骤5进一步为：将结构如式VI所示的化合物和KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，回流反应4～8h，TLC跟踪反应，反应结束后，用盐酸酸化，调节pH至酸性，将溶液倒入饱和食盐水中，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式VII所示的化合物。

[0038] 更优选的，体积比：甲醇：THF:水＝1:1:1。10mmol的结构如式VI所示的化合物溶于50ml甲醇THF水混合液中摩尔比：VI：KOH＝1：2。

[0039] 在优选的实施例中，所述步骤6进一步为：

[0040] 把结构如式VII所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，在0±5℃℃搅拌下滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应20～40min，在35±5℃搅拌下接着反应6～10h，TLC跟踪反应，反应结束后，将反应液倒入饱和食盐水中，过滤，固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯得到结构如式VIII所示的化合物。

[0041] 更优选的，上述步骤中，各反应物的摩尔比：VII：N-甲基哌嗪：DCC：DMAP＝1:1:1.2:1.44。

[0042] 在优选的实施例中，所述步骤7进一步为：

[0043] 在-20±5℃搅拌下，依次向反应器中加入结构如式VIII所示的化合物、二氯甲烷，并滴加三溴化硼，搅拌20～40min，室温继续反应8～12h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的目标化合物。

[0044] 更优选的，上述步骤中，各反应物的摩尔比：VIII：三溴化硼＝1:0.5。

[0045] 本方法针对皂苷苷元进行改造，有效整合了哌嗪骨架，二氢吡唑骨架，实验可重复性强，稳定性好，实验反应所需条件较简单，且实验环境温和，产率较好，可在较小投入情况下进行大量生产。

[0046] 一种C21甾体皂苷苷元衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，

[0047] 所述C21甾体皂苷苷元衍生物的结构如式IX所示，

[0048]

[0049] 其中，R1选自H、F，R2选自H、F，R3选自H、F。

[0050] 有益效果：本发明具有更好的生物活性、更高的选择性以及更低的毒性等优点。对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，同时对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性。

具体实施方式

[0051] 本发明的技术方案如下：

[0052] 一类新颖的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物的合成，其特征是它有如下通式：

[0053]

[0054] 本发明二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物的合成，包括下列步骤：

[0055] 步骤1.在0±5℃下，依次向圆底烧瓶中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸 1，搅拌1h左右后，常温继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯2。

[0056] 步骤2.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入Tenacissoside A(一种C21甾体皂苷)3、盐酸水溶液、无水乙醇，搅拌1h后，回流反应7-9h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到部分还原化的晶体状C21甾体皂苷苷元4。

[0057] 步骤3.在冰水浴搅拌作用下，依次向圆底烧瓶中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、C21甾体皂苷苷元4，反应0.5h左右后，再回流反应5-7h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物5。

[0058] 步骤4.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入中间物5、KOH水溶液、不同取代基的苯甲醛、乙醇，继续搅拌反应4h后，稀盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×100mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥得中间体6-9。

[0059] 步骤5.依次将不同的化合物6-9、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯2、冰醋酸加入到圆底烧瓶中，室温搅拌反应1h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物10-13。

[0060] 步骤6.将化合物10-13、KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，回流反应5h左右后。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，稀盐酸酸化调节pH至酸性，将溶液倒入饱和食盐水中，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状化合物14-17。

[0061] 步骤7.把化合物14-17和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，在0℃左右搅拌下滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应0.5h左右后，在35±5℃搅拌下接着反应8h左右。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，将反应液 倒入饱和食盐水中，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×
100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物18-21。

[0062] 步骤8.在-20±5℃搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入对应的中间物18-21、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌1h左右后，室温继续反应12h左右。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:V正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物22-25。

[0063] 实施例一：

[0064] N-甲基-4-(5-苯基-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物22)的制备

[0065]

[0066] 在-20℃搅拌下，依次向50mL的圆底烧瓶中加入步骤7得到的相应中间物18(10.0mmol)、二氯甲烷(25mL)，并逐步滴加三溴化硼(5.0mmol)继续搅拌反应1h后，将反应烧瓶转移至室温，继续反应12h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:V正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物22。

[0067] 得白色晶体，产率47.3％。m.p.221～223℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.98(d,J＝8.1Hz,2H,ArH),7.68(d,J＝7.7Hz,2H,ArH),7.36～7.25(m,5H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.58～3.42(m,6H,CH and CH2),3.34(d,J＝
6.8Hz,1H,CH),,2.95～2.73(m,2H,CH2),2.31(t,J＝7.7Hz,4H,CH2),2.18(s,3H,CH3),2.01(t,J＝5.8Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH2),1.14(dd,J1＝7.1Hz,J2＝7.8Hz,
1H, CH),0.89(s,3H,CH3),0.84(s,3H,CH3).ESI-MS:669.9[M+H]+.Anal.Calcd for C40H52N4O5:C,H,N.

[0068] 实施例二：

[0069] N-甲基-4-(5-(4-氟-苯基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物23)的制备

[0070]

[0071] 制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率45.5％。m.p.226～227℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:8.03(d,J＝8.3Hz,2H,ArH),7.73(d,J＝8.1Hz,2H,ArH),7.35～7.18(m,4H,ArH),5.35(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.1Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.56～3.41(m,6H,CH and CH2),3.32(d,J＝6.8Hz,1H,CH),2.97～2.71(m,2H,CH2),2.28(t,J＝7.7Hz,4H,CH2),2.15(s,3H,CH3),2.04(t,J＝5.7Hz,1H,CH),1.81～1.20(m,15H,CH and CH2),1.14(dd,J1＝7.0Hz,J2＝7.6Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH3),0.78(s,3H,CH3).ESI-MS:687.9[M+H]+.Anal.Calcd for C40H51FN4O5:C,H,N.

[0072] 实施例三：

[0073] N-甲基-4-(5-(2-氟-苯基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物24)的制备。

[0074]

[0075] 制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率44.9％。m.p.212～213℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.56(s,1H,OH),8.03(d,J＝8.1Hz,2H,ArH),7.74～7.55(m,5H,ArH and NH),7.29～7.23(m,1H,ArH),7.15～7.07(m,1H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55～3.42(m,6H,CH and CH2),3.34(d,J＝6.8Hz,1H,CH),2.95～2.73(m,2H,CH2),2.32(t,J＝7.7Hz,4H,CH2),2.01(t,J＝5.4Hz,1H,CH),1.79～
1.21(m,15H,CH and CH2),1.14(dd,J1＝7.1Hz,J2＝7.9Hz,1H,CH),0.84(s,3H,CH3),0.81(s,3H,CH3).ESI-MS:687.9[M+H]+.Anal.Calcd for C40H51FN4O5:C,H,N.

[0076] 实施例四：

[0077] N-甲基-4-(5-(3-氟-苯基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物25)的制备。

[0078]

[0079] 制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率37.8％。m.p.215～216℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.49(s,1H,OH),7.99(d,J＝8.1Hz,2H,ArH),7.72(d,J＝7.3Hz,2H,ArH),7.66(s,1H,NH),7.39～7.31(m,1H,ArH),7.15～7.07(m,2H,ArH),6.97(d,J＝3.9Hz,1H,ArH),5.35(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.2Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54～3.41(m,6H,CH and CH2),3.34(d,J＝6.5Hz,1H,CH),,2.95～2.73(m,2H,CH2),2.30(t,J＝7.7Hz,4H,CH2),
2.01(t,J＝5.5Hz,1H,CH),1.75～1.20(m,15H,CH and CH2),1.13(dd,J1＝6.6Hz, J2＝
7.2Hz,1H,CH),0.85(s,3H,CH3),0.83(s,3H,CH3).ESI-MS:687.9[M+H]+.Anal.Calcd for C40H51FN4O5:C,H,N.

[0080] 实施例五：

[0081] 采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)及肝癌细胞(HepG2)的半数抑制浓度(IC50)。

[0082] (1)培养液(/L)的配制：①悬浮细胞：DMEM培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(2×10-5U/mL)0.5mL，链霉素溶液(2×10-5U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO3溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO3 2.00g，HEPES 2.38g。

[0083] (2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·12H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g。高压灭菌。

[0084] (3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

[0085] (4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，即按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

[0086] (5)人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于DMEM培养液内(含10％小牛血清、100U/mL链霉素)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔3～4d传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

[0087] (6)细胞孵育：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×105个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

[0088] (7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和 细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，
5％CO2培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

[0089] (8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μL DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

[0090] 半数抑制浓度(IC50)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

[0091] 测得的IC50见表1所示。

[0092] 表1本发明所列新颖的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物对肿瘤细胞的抑制IC50值(μmol/mL)

[0093]

[0094] a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

[0095] 从上可知：本发明的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，尤其是对A549细胞最好，对比Tenacissoside A的抑制活性有明显提高，对比阳性对照药则表现出了相当或者优于阳性对照药物的抑制活性。因此本发明的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0096] 实施例六：

[0097] 本发明测试了新合成化合物18-21对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性，细胞毒性结果如表2，以Celecoxib和Tenacissoside A作为阳性对照。每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50％时的浓度(CC50)来表示。

[0098] 实验方法：

[0099] (1)培养人肾上皮细胞(293T)直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。

[0100] (2)置于含5％CO2细胞培养箱中，在37±2℃温度下培养24h。弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。采用0.9％氯化钠注射液浸提时，在稀释浸提时使用浓缩的2倍培养基。

[0101] (3)置于含5％CO2培养箱中，在37±2℃温度下进行培养。培养48h。

[0102] (4)每个培养间期后，每孔加入MTT溶液20μL，置于含5％CO2培养箱中，在37±2℃温度下培养5h。

[0103] (5)弃去孔内液体，每孔分别加入200μL DMSO，将培养板放置10min，水平摇晃使孔内溶液颜色均匀。

[0104] (6)用酶标仪测定吸光度，波长采用570nm。

[0105] 测得的CC50见表2所示。

[0106] 表2本发明所列新颖的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物对293T细胞的抑制CC50值(μmol/mL)

[0107]

[0108] a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间。

[0109] 本发明的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物对对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物的细胞毒性，同Tenacissoside A相比，细胞毒性也几乎持平。因此本发明的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

[0110] 发明人认为：六氢吡嗪是分子中含2个氮原子的六元杂环，其生成焓高、热稳定性 好，是富氮杂环化合物的理想结构单元，具有很好的氮平衡对称结构。在本发明中引入哌嗪环，作为药物的增效基团，可以改善药物的药代动力学性质，提高药物的生物活性。而且它还具有作用起效快、副反应小、毒性低、无成瘾性等特点。吡唑是一类重要的杂环化合物，具有高效、低毒，以及其环上取代基的多方位变换的性质。

[0111] 总之，本发明将哌嗪骨架引入到二氢吡唑衍生物中，同时结合了具有很好活性的