一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法

摘要

本发明公开了一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法。该方法包括如下内容：（1）将用于生物发酵的液态烷烃进行微波处理，剥离烷烃中的结合水，静置分层，上层为烷烃相，下层为水相；（2）将有机改性粘土与纯烷烃的混合物直接通入到水相中，进行微波或超声混合，静置分层，上层为烷烃相，下层为未被吸附的水相，吸水后的有机改性粘土吸附于两相界面，得到预处理的液态烷烃。该方法通过添加改性粘土，对夹带水进行处理，降低了液态烷烃染菌的可能，从而省略了液态烷烃的实消操作，利于大规模生产应用。

权利要求

1.一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法，其特征在于包括如下内容：（1）将用于生物发酵的液态烷烃进行微波处理，剥离烷烃中的结合水，静置分层，上层为烷烃相，下层为水相；（2）将有机改性粘土与纯烷烃的混合物直接通入到水相中，进行微波或超声混合，静置分层，上层为烷烃相，下层为未被吸附的水相，吸水后的有机改性粘土吸附于两相界面，得到预处理的液态烷烃。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：用于生物发酵的液态烷烃的含水量体积百分比1%～5%。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的有机改性粘土为有机改性的高岭石、伊利石、蒙脱石或海泡石中的一种或几种，其中粘土为100～300目。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的有机改性粘土与液态烷烃中水的质量比为1:10～1:100。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的有机改性粘土的制备过程为：将有机改性剂进行酸溶，加入预处理的粘土，充分混合，收集固相，洗涤，烘干备用。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的有机改性剂为季铵盐类、卵磷脂类、氨基酸类或甜菜碱类离子型表面活性剂。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的有机改性剂为具有10～16个碳原子的烷基表面活性剂，选自十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基二甲基烯丙基氯化铵、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、十五烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲胺或氯化十六烷基吡啶中的一种或几种。

8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：粘土的预处理过程如下：经磁选机除去磁性杂质，然后在110～300℃进行烘焙10～30小时。

9.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的酸溶采用的是中强性无机酸，浓度为1～10 mol/L；预处理粘土的质量与无机酸的体积的比例为1:1～1:10。

10.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：混合时间为15～20小时，用纯水洗涤3～6次，烘干条件为：70～90℃烘干15～25小时。

11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：有机改性粘土与纯烷烃的混合质量比为

1:1～1:10。

12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的有机改性粘土通过烘焙的方式循环利用，烘焙条件为：110～300℃烘焙10～30小时。

13.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的微波处理条件为：微波频率300～3000MHz，微波功率为50～200W/L，时间为3～10分钟。

14.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的微波混合条件为：微波频率300～3000MHz，微波功率为10～100W/L，时间为10～20分钟。

15.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的超声混合条件为：超声波频率为25～40kHz，超声功率密度为10～100W/L，时间为10～30分钟。

说明书

一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工领域，具体涉及一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法。

背景技术

[0002] 烷烃，即饱和烃（Saturated group）是只有碳碳单键和碳氢键的链烃，是最简单的一类有机化合物。烷烃性质相对稳定，不易发生反应，在工业上一般直接作为燃料使用。液态烷烃指含有5～16个碳原子的烷烃，在室温条件下通常呈现液态。随着生物技术的发展，液态烷烃作为碳源被广泛应用于发酵领域，如以十二碳正构烷烃生产十二碳二元酸的发酵工艺。

[0003] 在发酵生产过程中，培养基成分需要经过灭菌操作，从而保证发酵体系的菌种单一、稳定。液态烷烃通常作为碳源及发酵底物使用，相对用量较大，通常采用批次补加的形式加入发酵体系中，因此液态烷烃的灭菌一般需要进行批量灭菌。例如在长链二元酸生产中，专门准备了液态烷烃储罐，将整个发酵周期所需要的烷烃预先存储，并进行灭菌处理。

[0004] 液态烷烃由于是非极性的，纯品液态烷烃不易染菌，但是由于液态烷烃通常会夹带大量水分，因此成为杂菌滋生的隐患。目前对液态烷烃的灭菌方案都是针对这部分夹带水设计的。液态烷烃的灭菌主要采用蒸汽加热的方式将温度升至121℃，并恒温保压30分钟。在灭菌操作中，通常采用夹套加热的方式进行升温操作，但是夹套升温速度较慢，因此一般会在升温过程中，以通蒸汽的方式进行升温加热。这样的操作会在灭菌的前中期形成较大的蒸发量，从而在蒸汽中夹带大量的烷烃，统计表明这种烷烃损失约占烷烃使用量的10%～20%。同时，底部通蒸汽的方式使蒸汽与烷烃直接接触，因此会形成大量的冷凝水参杂在烷烃中，形成乳化层，为杂菌的侵入提供了水环境，提高了染菌风险。现有条件下，无论对这种灭菌方式进行怎样的优化，都会造成烷烃损失以及形成水相乳化层，从而对发酵造成一定影响。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法。该方法通过添加改性粘土，对夹带水进行处理，降低了液态烷烃染菌的可能，从而省略了液态烷烃的实消操作，利于大规模生产应用。

[0006] 本发明的用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法，包括如下内容：

[0007] （1）将用于生物发酵的液态烷烃进行微波处理，剥离烷烃中的结合水，静置分层，上层为烷烃相，下层为水相；

[0008] （2）将有机改性粘土与纯烷烃的混合物直接通入到水相中，进行微波或超声混合，静置分层，上层为烷烃相，下层为未被吸附的水相，吸水后的有机改性粘土吸附于两相界面，得到预处理的液态烷烃。

[0009] 本发明方法中，用于生物发酵的液态烷烃的含水量为1%～5%（体积）。

[0010] 本发明方法中，所述的有机改性粘土为有机改性的高岭石、伊利石、蒙脱石或海泡石等粘土，其中有机改性粘土为100～300目。

[0011] 本发明方法中，所述的有机改性粘土的制备过程为：将有机改性剂进行酸溶，加入预处理的粘土，充分混合，收集固相，洗涤，烘干备用；所述的酸溶采用的是中强性无机酸，优选盐酸或磷酸，浓度为1～10 mol/L；粘土与表面活性剂酸溶液的添加比例为1:1～1:10（g：mL）；混合时间为15～20小时，用水洗涤中性，烘干条件为：70～90℃烘干15～25小时。

[0012] 其中，所述的有机改性剂为季铵盐类、卵磷脂类、氨基酸类、甜菜碱类等离子表面活性剂，其中优选具有10～16个碳原子的烷基表面活性剂，如十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基二甲基烯丙基氯化铵、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、十五烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲胺、氯化十六烷基吡啶等。

[0013] 所述的粘土的预处理过程如下：经磁选机除去磁性杂质，然后在110～300℃进行烘焙10～30小时。

[0014] 本发明方法中，有机改性粘土与液态烷烃中水的质量比为1:10～1:100。

[0015] 本发明方法中，有机改性粘土与纯烷烃的混合质量比为1:1～1:10。

[0016] 本发明方法中，所述的有机改性粘土可以通过烘焙的方式循环利用，具体烘焙条件为：110～300℃烘焙10～30小时。

[0017] 本发明方法中，步骤（1）所述的微波处理条件为：微波频率300～3000MHz，微波功率为50～200W/L（体积为液态烷烃总体积），时间为3～10分钟。

[0018] 本发明方法中，步骤（2）所述的微波混合条件为：微波频率300～3000MHz，微波功率为10～100W/L，时间为10～20分钟；超声混合条件为：超声波频率为25～40kHz，超声功率密度为10～100W/L（体积为液态烷烃总体积），时间为10～30分钟。

[0019] 与现有技术相比，本发明一种用于生物发酵的液态烷烃的预处理方法通过物理吸附的方式对液态烷烃结合水进行处理，从而省略了传统工艺中烷烃蒸汽加热灭菌的工艺，从而解决了烷烃损失及染菌风险高的两大技术难题，具有如下优点：

[0020] （1）液态烷烃为非极性，纯品不容易出现染菌情况，但是实际的液态烷烃中经常会夹带一定的水分，从而为细菌滋生带来了一定的可能性，因此所有的烷烃灭菌方案不是针对液态烷烃，而是针对这部分夹带水。本发明方法引入了烷烃结合水剥离及结合水吸附两种技术手段，对液态烷烃体系中的自由水进行处理，削弱了杂菌滋生的可能；

[0021] （2）粘土矿物本身呈负电性、具有离子交换吸附能力，从而能够对菌体细胞具有吸附絮凝作用，同时经有机改性的粘土，通过优化粘土颗粒的目数，从而使改性粘土分散在烷烃—水的界面，在形成抑菌屏障，隔离水中的菌体进入到烷烃中。

[0022] （3）通过微波的方式能够对烷烃结合水进行高效剥离，微波处理后，有利于烷烃—水乳化层的形成，在添加有机改性粘土后使用微波处理，一方面有利于改性粘土在乳化层中的分散，另一方面能够提高对杂菌的吸附效率。；同时粘土微环境呈碱性，吸附其上的杂菌细胞处于受抑制状态，结合微波对细胞杀伤作用，能够起到很好的抑菌效果。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例对本发明方法的具体过程及效果进行说明，但不局限于以下实施例。

[0024] 本实施例以十二碳烷烃发酵生产十二碳二元酸实验为例，对本发明方法及效果进行说明。选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56作为发酵菌株，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0356。采用卡尔费休水分测量仪对烷烃体系中的含水量进行测量，从而确定灭菌各参数控制。

[0025] 实施例1

[0026] （1）选择高岭石矿石，经粉碎、研磨至200目；将高岭石粉通过磁选机进行磁性金属脱除处理；将脱磁处理后的高岭石粉末于150℃进行烘焙10小时。

[0027] （2）取40g十二烷基二甲基苄基氯化铵加入400mL3mol/L盐酸中，配制十二烷基二甲基苄基氯化铵盐酸溶液，加入200g高岭石，充分浸泡、混匀后，静置15小时，取固相，用清水冲洗至pH为中性，于80℃干燥20h，得到有机改性高岭石。

[0028] （3）对十二碳正构烷烃10L，含水量2%（V:V）进行微波破乳，微波频率2450MHz，微波功率为500W，处理3分钟。

[0029] （4）将有机改性高岭石粉100g与经脱水处理的十二碳正构烷烃100g混均后，加入步骤（3）的水相中，进行超声混合（频率40KHz，超声功率200W）15分钟，得到预处理的液态烷烃。该烷烃记为A1，降温备用。

[0030] 实施例2

[0031] （1）选择蒙脱石矿石，经粉碎、研磨至300目；将蒙脱石粉通过磁选机进行磁性金属脱除处理；将脱磁处理后的蒙脱石粉末于150℃进行烘焙30小时。

[0032] （2）以1mol/L盐酸作为溶剂，配制100mg/L十二烷基二甲基甜菜碱盐酸溶液400mL，加入40g蒙脱石，充分浸泡、混匀后，静置20小时，取固相，用清水冲洗至pH为中性，于90℃干燥15h，得到有机改性蒙脱石。

[0033] （3）对十二碳正构烷烃10L，含水量1%（V:V）进行微波破乳，微波频率915MHz，微波功率为1000W，处理10分钟，

[0034] （4）将有机改性蒙脱石粉50g与经脱水处理的十二碳正构烷烃100g混均后，加入步骤（3）的水相中，进行微波混合（频率915KHz，功率200W）15分钟，得到预处理的液态烷烃。该烷烃记为A2，降温备用。

[0035] 实施例3

[0036] （1）选择伊利石矿石，经粉碎、研磨至300目；将伊利石粉通过磁选机进行磁性金属脱除处理；将脱磁处理后的蒙脱石粉末于150℃进行烘焙30小时。

[0037] （2）以3mol/L盐酸作为溶剂，配制100mg/L十二烷基二甲基烯丙基氯化铵盐酸溶液400mL，加入80g伊利石，充分浸泡、混匀后，静置25小时，取固相，用清水冲洗至pH为中性，于
70℃干燥25h，得到有机改性伊利石。

[0038] （3）对十二碳正构烷烃10L，含水量3%（V:V）进行微波破乳，微波频率896MHz，微波功率为1500W，处理5分钟。

[0039] （4）将有机改性伊利石粉20g与经脱水处理的十二碳正构烷烃100g混均后，加入步骤（3）的水相中，进行微波混合（频率896KHz，功率500W）10分钟，得到预处理的液态烷烃。该烷烃记为A3，降温备用。

[0040] 对比例1

[0041] 将10L十二碳正构烷烃，含水量2%（V:V），加入15L补料储罐中。夹套加热至90℃，随后罐底通入0.4MPa蒸汽，升温至121℃，维持温度30分钟后，自然冷却至37℃。灭菌后的烷烃记为A4。

[0042] 对比例2

[0043] 将10L十二碳正构烷烃，含水量3%（V:V），加入15L补料储罐中，微波破乳处理，微波频率500MHz，微波功率为1KW，微波加热升温至90℃，然后自然降温至50℃，重复升温-降温过程两次，灭菌后的烷烃标记为A5。

[0044] 实施例4

[0045] 以热带假丝酵母为发酵菌株，分别以灭菌后的十二碳正构烷烃A1 A5为底物，采用~批次补加、梯度调节pH的方式进行好氧发酵，直至144h时反应结束。最终发酵结果见表1。

[0046] 表1十二碳二元酸发酵试验的结果。

[0047]  灭菌前含水量（%） 灭菌后含水量（%） 发酵批次 平均产酸浓度（g/L） 保藏周期（天）A1 2 2 4 142.6 90
A2 1 1 4 140.6 90
A3 3 3 4 145.7 90
A4 2 6.5 3 127.5 78
A5 3 3 4 134.4 72

[0048] 以本发明方法进行灭菌处理的十二碳正构烷烃储液（A1、A2、A3），其灭菌后含水量要明显低于传统湿热灭菌方法（A4），同时烷烃的损失较少，发酵批次高于对照组；由于本发明方法中添加了改性的粘土矿物，配合微波的灭菌效应，抑菌效果明显，相对于单纯微波灭菌方法（A5）保藏周期较长。