一种基于SSR标记的京红3号萝卜杂交种纯度鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种用于检测京红3号萝卜杂交种纯度的引物序列及方法。该引物序列是序列表SEQ ID1～2所述的核苷酸序列，该引物在杂交种中的扩增带型为双亲的互补带型，经过对制种基地10家农户随机抽样检测发现，SSR标记检测与田间结果相吻合。本发明具有快捷、简便、稳定、可靠、成本低等优点，可在3‑4h之内可完成对京红3号萝卜杂交种纯度鉴定工作，有很大的应用价值。

权利要求

1.一种用于京红3号萝卜杂交种纯度鉴定的引物序列，其特征在于，所述引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～2所示。

2.利用权利要求1中所述引物检测京红3号萝卜杂交种纯度的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)快速提取京红3号萝卜杂交种基因组DNA：种子发芽72小时后，取下胚轴置于2.0mL离心管中；加入0.4mol·L-1NaOH溶液100μl，钢珠2个；在48孔研磨器上研磨1min；轻甩离心后，放于沸水中温浴1min；10000rmp离心1min；取上清液10μl放入96孔PCR板中，加200μl pH＝

8.0的Tris缓冲液，混匀备用；

(2)采用如序列表SEQ ID No.1～2所示引物进行PCR扩增：反应体系为：1μl含Mg2+的10×Buffer，0.8μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，10μM SSR上下游引物各加0.5μl，模板DNA 2μl，ddH2O补足至10μl；PCR反应程序为94℃预变性5min；35个扩增循环，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存；

(3)将步骤(2)的扩增产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，比较京红3号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型的为京红3号杂交种，只有亲本之一带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种；

(4)利用步骤(3)的统计结果计算供试京红3号萝卜杂交种纯度：送检测京红3号杂交种纯度％＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂种数)/总检测种子粒数×100％。

说明书

一种基于SSR标记的京红3号萝卜杂交种纯度鉴定的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种京红3号萝卜杂交种纯度鉴定的引物序列及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 萝卜在中国栽培历史悠久，分布广泛，品种类型十分丰富，在我国蔬菜生产供应中占有重要地位。但是，目前萝卜种子经营单位越来越多，种子质量参差不齐，严重干扰了萝卜种业的健康发展。在萝卜F1代杂交种制种过程中由于生物学混杂和机械混杂等原因造成杂交种纯度降低现象时有发生，给种子生产者和经营者造成巨大经济损失。传统的种子纯度鉴定方法都是在田间进行，观察主要发育阶段品种的特征特性及一致性，存在周期长、工作量大等缺陷。此外由于田间纯度检测周期长，造成当年生产的杂交种往往要等到次年才能销售，不但会造成库存压力，还会错失商机。

[0003] 近年来随着分子生物学的发展，基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有力工具，因其具有不受环境影响、测试周期短、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析的优势，已经大规模用于种子纯度鉴定及品种真伪性的检测。尤其是微卫星(SSR)标记技术具有共显性、多态性好、重复性好、实验操作简单等优点被广泛应用。

[0004] “京红3号”是北京市农林科学院蔬菜研究中心育成的红皮系列萝卜品种之一，具有肉质根皮色鲜红、根形圆正、抗病性强、熟食品质佳等优点，适于华北、东北地区秋季种植。该品种种植面积不断扩大，种子需求量和制种面积也相应增加，快速鉴定杂交种纯度将有利于该品种的进一步推广应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测京红3号萝卜杂交种纯度的引物序列。

[0006] 本发明的再一目的在于提供一种利用上述引物进行京红3号萝卜杂交种纯度鉴定的方法。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一对用于检测京红3号萝卜杂交种纯度的引物序列，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1～2所示序列。

[0009] 利用上述引物进行京红3号萝卜杂交种纯度鉴定，方法包括如下步骤：

[0010] (1)提取待测样品京红3号杂交种基因组DNA；

[0011] (2)采用序列表SEQ ID No.1～2所示引物进行PCR扩增；

[0012] (3)将步骤(2)中的扩增产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果；

[0013] (4)利用步骤(3)的统计结果计算京红3号萝卜杂交种的纯度。

[0014] 所述步骤(1)是采用碱裂解法快速提取待测京红3号萝卜杂交种基因组DNA：取种子下胚轴(发芽72小时)置于2.0mL离心管中；加入0.4mol L-1NaOH溶液100μl，钢珠2个；在48孔研磨器上研磨1min；轻甩离心后，放于沸水中温浴1min；10000rmp离心1min；取上清液10μl放入96孔PCR板中，加200μl Tris缓冲液(PH＝8.0)，混匀备用。

[0015] 所述步骤(2)为PCR扩增：采用如序列表SEQ IDNo.1～2所示引物，反应体系为：1μl 10×Buffer(含Mg2+)，0.8μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，10μM SSR上下游引物各加0.5μl，模板DNA 2μl，ddH2O补足10μl；PCR反应程序为94℃预变性5min； 35个扩增循环，94℃
30sec，60℃30sec，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存。

[0016] 所述步骤(3)扩增产物的检测：在步骤(2)的扩增产物中加入2μl上样缓冲液，经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1×TBE，每个点样孔加2μl样品，120V恒压下电泳60分钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液(450mLH2O+50mL无水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液(500ml H2O+1g硝酸银)，轻摇12min；倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H2O+7.5gNaOH+1500μl甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分钟；照相并统计带型。比较京红3号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型的京红3号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种；

[0017] (4)利用步骤(3)的统计结果计算供试京红3号萝卜杂交种纯度：送检测京红3号杂交种纯度(％)＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数)/总检测种子粒数×100％。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 本发明筛选获得了一对能够用于京红3号萝卜杂交种纯度鉴定的引物，并提供了京红3号杂交种纯度鉴定的方法。该检测方法快捷、简便、稳定、可靠、成本低，可在3-4h之内完成京红3号种子纯度鉴定工作，有利于京红3号种子高效准确的质量控制。

附图说明

[0020] 图1、SSR085在京红3号杂交种及其双亲中的扩增图。

[0021] 图2、SSR085在100粒京红3号杂交种中的扩增图(1～50个单株)。

[0022] 图3、SSR085在100粒京红3号杂交种中的扩增图(51～100个单株)

具体实施方式

[0023] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。具体实施方式如下：

[0024] 一、材料和方法

[0025] 1.1材料

[0026] 引物筛选所用材料包括京红3号杂交种、母本P1、父本P2各8个单株。

[0027] 京红3号杂交种纯度鉴定所用材料为，制种基地10家农户生产的京红3号萝卜杂交种，每户随机取100粒种子。

[0028] 1.2研究方法

[0029] 1.2.1基因组DNA的提取

[0030] 种子发芽72小时后，取下胚轴置于2.0mL离心管中；加入0.4mol L-1NaOH溶液100μl，钢珠2个；在48孔研磨器上研磨1min；轻甩离心后，放于沸水中温浴1min；10000rmp离心1min；取上清液10μl放入96孔PCR板中，加200μl Tris缓冲液(PH＝8.0)，混匀备用。

[0031] 1.2.2PCR扩增与检测

[0032] 筛选获得一对能够用于京红3号杂交种纯度鉴定的特异引物。

[0033] 表1 可用于京红3号杂交种纯度检测的引物序列

[0034]SEQ ID No. 引物名称 序列5’-3’
1 SSR085F AAGACAGAAAAGGACAAGGT
2 SSR085R TCACATCTATTCGCTTTGTA

[0035] PCR反应体系为：1μl10×Buffer(含Mg2+)，0.8μl2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，10μM SSR上下游引物各加0.5μl，模板DNA 2μl，ddH2O补足10μl；PCR反应程序为94℃预变性
5min； 35个扩增循环，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存。

[0036] 扩增产物的检测：在扩增产物中加入2μl上样缓冲液，经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1×TBE，每个点样孔加2μl样品，120V恒压下电泳60分钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液(450mL H2O+50mL无水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液(500ml H2O+1g硝酸银)，轻摇12min；倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H2O+7.5gNaOH+1500μl甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分钟；照相并统计带型。

[0037] 1.2.3数据统计

[0038] 选择在京红3号杂交种及其双亲中表现共显性互补带型的引物用于杂交种纯度鉴定。供试京红3号萝卜杂交种纯度：送检测京红3号杂交种纯度(％)＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数)/总检测种子粒数×100％。

[0039] 二、结果与分析

[0040] 2.1引物筛选

[0041] 利用合成的300对引物对京红3号杂交种、母本P1、父本P2各8个单株进行筛选，其中引物SSR085在京红3号杂交种、母本P1、父本P2不同单株间表现一致，并且京红3号杂交种及其双亲表现共显性互补带型，如图1所示。

[0042] 2.2京红3号杂交种种子纯度的鉴定

[0043] 利用引物SSR085对来自制种基地10家农户生产的各100粒京红3号萝卜杂交种进行PCR检测。结果见表2，7家农户生产的京红3号杂交种纯度为100％，2家农户生产的杂交种纯度为99％，1家农户生产的杂交种纯度为98％。如图2和图3中显示，在所有100粒种子中，具有互补带型的种子数为99个为杂交种，具有父本带型的种子数有1个(箭头所示的条带)为非杂交种。

[0044] 表2 各农户生产的京红3号萝卜杂交种纯度检测情况

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