检测水稻高粒重等位基因的特异性PCR分子标记

摘要

本发明提供了检测水稻粒重QTLquantitative trait loci,数量性状座位）qTGW1.2a和qTGW1.2b上密阳46高千粒重等位基因的8个特异性PCR标记，其中，7个用于检测qTGW1.2a，分别为Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b和Wn33252，1个用于检测qTGW1.2b，为Wn34526，特征在于其PCR引物。利用这8个标记对水稻DNA进行鉴定，可以分别检测待测材料是否在2个目标座位上转入水稻品种密阳46的高千粒重等位基因，即是否具有提高水稻粒重的能力，整个检测过程操作简单且准确性高。

权利要求

1.检测水稻品种密阳46高千粒重等位基因qTGW1.2a的特异性PCR分子标记，包含7个特异性标记Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b和Wn33252的引物各1对：Wn32837的上游引物序列为5'-CGTCCTGCGTTTCGACATGACT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

Wn32837的下游引物序列为5'-TATTTCTACCACTCCAAGCACCA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

Wn32886的上游引物序列为5'-CGTGTTACTAACCCAGTCAACTCAGG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

Wn32886的下游引物序列为5'-CAATAGTAGCAGCTAAATTGGCGTTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

Wn32893的上游引物序列为5'-TTCCGATTTTGTTTTCTTGGTCCC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

Wn32893的下游引物序列为5'-GCCGCACATTTATTACCTTAATCCTG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

Wn33185的上游引物序列为5'-GGAGGATAACGCAAGCAAACTTGA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列；

Wn33185的下游引物序列为5'-CCATAGCTTGTAAAAGACAGTGCC-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列；

Wn33186的上游引物序列为5'-AGTTAGTGCAGCAATCTACGTCCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；

Wn33186的下游引物序列为5'-AGCTCCTCCAGTGACGATACGG-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列；

Wn33304b的上游引物序列为5'-AAGCAACATAACTTATTCTACTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:11的所示核苷酸序列；

Wn33304b的下游引物序列为5'-ACGACATCCACTTCGCACC-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列；

Wn33252的上游引物序列为5'-GCATGTATCAAAGATTCGATGAGA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:13的所示核苷酸序列；

Wn33252的下游引物序列为5'-TGAAAACTCATGGCTACGCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列。

2.检测水稻品种密阳46高千粒重等位基因qTGW1.2b的特异性PCR分子标记，包含1个特异性标记Wn34526的引物1对：Wn34526的上游引物序列为5'-TCATCATCTGTTCGTGGGTT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:15的所示核苷酸序列；

Wn34526的下游引物序列为5'-TTGAAATATAAACTCTATACAATCTGCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:16所示的核苷酸序列。

说明书

检测水稻高粒重等位基因的特异性PCR分子标记

技术领域

[0001] 本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，特别是检测水稻粒重QTL qTGW1.2a和qTGW1.2b上密阳46高千粒重等位基因的8个特异性PCR标记。

背景技术

[0002] 目前，世界人口的增长速率高于粮食增产速率，食物短缺已成为全球性安全问题。水稻作为世界上一半人口的主食，提高其产量对解决粮食安全问题具有重大意义。水稻的增产在经历了矮秆化和杂种优势利用之后，一直处于缓慢增长状态，近30年我国水稻新品种产量年提高幅度仅为1-2%，其中部分类型甚至低于1%。在该缓慢增产阶段，千粒重对产量提高发挥了至关重要的作用。因此，在水稻新品种的选育过程中，千粒重的高低是育种家们关注的焦点之一。高千粒重品种的培育常将需改良的品种和高千粒重的材料进行杂交而获得，千粒重的测定需等种子完全成熟后测量较为精确，且选育过程中待测样本数量庞大，阻碍了育种进程以及加大育种成本。随着分子标记的快速发展，借助分子标记辅助选择，利用合适的分子标记能在水稻全生育期鉴定对千粒重起增效作用的等位基因在受体品种中的导入，从而从后代中选育出高千粒重的水稻品种。目前，分子标记辅助选择技术已经在水稻抗病性，抗虫性以及耐盐等性状广泛应用。

[0003] 申请人前期在水稻第1染色体上定位到3个控制水稻千粒重的QTL（Wang L-L,et al. Dissection of qTGW1.2 to three QTLs for grain weight and grain size in rice (Oryza sativa L.). Euphytica, DOI 10.1007/s10681-014-1237-7）。在这3个QTL区间，来源于水稻品种密阳46的等位基因均具有提高千粒重的作用，而定位精度则以qTGW1.2a和qTGW1.2b为高。本发明在此基础上，根据水稻品种密阳46和珍汕97的重测序结果，针对qTGW1.2a和qTGW1.2b所在区间进行序列比对，设计序标位（STS）标记，并从中挑选出可特异性鉴定密阳46等位基因的标记。本发明提供的分子标记对水稻粒重QTL qTGW1.2a和qTGW1.2b上密阳46增效等位基因的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于qTGW1.2a和qTGW1.2b上密阳46增效等位基因的转育研究中。

发明内容

[0004] 本发明解决的技术问题是提供了检测qTGW1.2a和qTGW1.2b上密阳46高千粒重等位基因的特异性分子标记8个，其中，检测qTGW1.2a的7个，检测qTGW1.2b的1个。

[0005] 本发明采用以下技术方案：根据密阳46和珍汕97的重测序结果，对qTGW1.2a和qTGW1.2b所在区间及其紧密连锁区间的序列进行比对，根据插入和缺失情况，在该区段设计了12个STS标记，经实验室鉴定验证，筛选出8个在两个品种中具有多态性的标记。

[0006] 用于检测qTGW1.2a上密阳46高千粒重等位基因的标记有7个，分别命名为Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b和Wn33252，具体序列如下：

[0007] Wn32837的上游引物序列为5'- CGTCCTGCGTTTCGACATGACT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

[0008] Wn32837的下游引物序列为5'- TATTTCTACCACTCCAAGCACCA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0009] Wn32886的上游引物序列为5'- CGTGTTACTAACCCAGTCAACTCAGG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

[0010] Wn32886的下游引物序列为5'- CAATAGTAGCAGCTAAATTGGCGTTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

[0011] Wn32893的上游引物序列为5'- TTCCGATTTTGTTTTCTTGGTCCC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

[0012] Wn32893的下游引物序列为5'- GCCGCACATTTATTACCTTAATCCTG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

[0013] Wn33185的上游引物序列为5'- GGAGGATAACGCAAGCAAACTTGA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列；

[0014] Wn33185的下游引物序列为5'- CCATAGCTTGTAAAAGACAGTGCC-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列；

[0015] Wn33186的上游引物序列为5'- AGTTAGTGCAGCAATCTACGTCCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；

[0016] Wn33186的下游引物序列为5'- AGCTCCTCCAGTGACGATACGG-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列；

[0017] Wn33304b的上游引物序列为5'- AAGCAACATAACTTATTCTACTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:11的所示核苷酸序列；

[0018] Wn33304b的下游引物序列为5'- ACGACATCCACTTCGCACC-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列；

[0019] Wn33252的上游引物序列为5'- GCATGTATCAAAGATTCGATGAGA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:13的所示核苷酸序列；

[0020] Wn33252的下游引物序列为5'- TGAAAACTCATGGCTACGCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列。

[0021] 用于检测qTGW1.2b上密阳46高千粒重等位基因的标记有1个，命名为Wn34526，具体序列如下：

[0022] Wn34526的上游引物序列为5'- TCATCATCTGTTCGTGGGTT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:15的所示核苷酸序列；

[0023] Wn34526的下游引物序列为5'- TTGAAATATAAACTCTATACAATCTGCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:16所示的核苷酸序列。

[0024] 8个STS标记的PCR扩增体系一致。扩增体系为，Tris-HCL（pH 8.8）33.5 mM，(NH4)2SO4 8.0 mM，MgCl2 1.5 mM， TWEEN-20 0.05%， dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各3.3 ng/µl，Taq DNA聚合酶 2.0单位，模版DNA 50 ng；PCR反应条件除退火温度外其它一致，预变性温度94℃ 2分钟；变性温度94℃ 45秒、退火温度50-55℃(Wn33815、Wn33252和Wn34526为50℃，其余5个标记皆为55℃) 45秒、72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 8分钟。

附图说明

[0025] 图1 STS标记Wn32886的检测结果。

[0026] M：分子量对照；P1：珍汕97；P2：密阳46；1~16：待测样品

[0027] 图2 两套近等基因系两地种植的千粒重分布。

[0028] A．2014年春海南陵水qTGW1.2a

[0029] B．2014年春海南陵水qTGW1.2b

[0030] C．2014年夏浙江富阳qTGW1.2a

[0031] D．2014年夏浙江富阳qTGW1.2b。

具体实施方式

[0032] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0033] 实施例1 水稻千粒重QTL qTGW1.2a和qTGW1.2b上密阳46特异性分子标记的开发[0034] 利用序列比对软件DNASTAR MegAlign模块（Lasergene）对QTL定位群体的亲本珍汕97和密阳46在千粒重QTL qTGW1.2a和qTGW1.2b所在区间的碱基序列进行比对，根据2个品种在比对中表现出的插入或缺失位点，应用引物设计软件Oligo 7.0开发了12个分别用于检测qTGW1.2a和qTGW1.2b增效等位基因密阳46特异片段的STS标记。通过下述步骤鉴定这些开发的标记是否在珍汕97和密阳46之间存在特异性，且在分离群体中是否能准确的鉴定出携带密阳46等位基因。本发明以STS标记Wn32886为例详细介绍检测方法：

[0035] 1．DNA微量提取

[0036] （1）将珍汕97、密阳46以及16个在分离群体中随机挑选的单株种子分别置于预先标号的培养皿，30℃发芽7天。

[0037] （2）剪取各培养皿幼苗叶片2～3 cm，剪成0.5 cm长的碎片，放入2.0 mL离心管中。

[0038] （3）加入450μl DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。

[0039] （4）加入450μl氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。

[0040] （5）11,000 rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400μl，转入新的1.5 ml离心管中，弃枪头

[0041] （6）加入800μl预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。

[0042] （7）11,000 rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。

[0043] （8）用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5 ml离心管倒置于纸上，自然干燥。

[0044] （9）加入100μl的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。

[0045] （10） 取2μl进行PCR扩增。

[0046] 2． PCR扩增及检测

[0047] 扩增体系为，Tris-HCL（pH 8.8）33.5 mM，(NH4)2SO4 8.0 mM，MgCl2 1.5 mM， TWEEN-20 0.05%， dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各3.3 ng/µl， Taq DNA聚合酶 2.0单位，模版DNA 50 ng；PCR反应条件除退火温度外其它一致，预变性温度94℃ 2分钟；变性温度94℃ 45秒、退火温度50-55℃(Wn33815、Wn33252和Wn34526为50℃，其余4个标记皆为55℃) 45秒、72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 8分钟。

[0048] 取2μl PCR产物上样于6%非变性聚丙烯酰胺胶（PAGE）；接通电极，在100V恒定电压下电泳3小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色。

[0049] 如图1所示，在Wn32886座位上，珍汕97和密阳46表现出多态性，在分离群体中，样品3、4、7、8、10、11、12和14呈密阳46纯合型，13和16呈杂合型，其余个体呈珍汕97纯合型，说明该STS标记能作为检测密阳46控制水稻千粒重QTL qTGW1.2a的特异标记。通过该方法最终筛选出8个具有特异性的分子标记，其中，7个用于检测密阳46控制水稻千粒重QTL qTGW1.2a，1个检测密阳46控制水稻千粒重QTL qTGW1.2b。

[0050] 实施例2 应用特异性分子标记鉴定密阳46高千粒重等位基因的验证

[0051] 1 近等基因系构建

[0052] 采用实施例1建立的分子标记，从水稻籼籼交组合珍汕97///珍汕97//珍汕97/密阳46的高代群体中筛选个体，建立了2套近等基因系群体，分别在qTGW1.2a和qTGW1.2b区间分离，其余背景区间一致。第1套在qTGW1.2a分离，含珍汕97型和密阳46型近等基因系各39个；第2套在qTGW1.2b分离，含珍汕97型和密阳46型近等基因系各42个。

[0053] 2 表型鉴定

[0054] 2013年冬—2014年春和2014年夏季分别在海南省陵水县和浙江省富阳市中国水稻研究所试验基地种植近等基因系，每个株系按随机区组设计种植，设置2个重复，每个株系种8个单株，成熟后取中间5株测定千粒重。

[0055] 3 结果和分析

[0056] 统计分析结果表明，在qTGW1.2a区间，与珍汕97型株系相比，携带密阳46型等位基因的株系在陵水平均可提高千粒重0.52 g、在富阳平均可提高0.44 g；在qTGW1.2b区间，与珍汕97型株系相比，携带密阳46型等位基因的株系在陵水平均可提高千粒重0.30 g、在富阳平均可提高0.31 g（图2）。两地试验都证实了密阳46等位基因的导入可以提高千粒重，且效应大小两地高度一致。

[0057] 实施例2证实了本发明提供的分子标记对水稻粒重QTL qTGW1.2a和qTGW1.2b中密阳46增效等位基因的检测可靠性高，可以应用于千粒重QTL qTGW1.2a和qTGW1.2b中增效等位基因密阳46的转育研究中。