金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法

摘要

本发明公开了金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，步骤包括：供试品溶液的制备；含有松果菊苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、淫羊藿苷对照品溶液的制备；吸取供试品溶液、对照品溶液分别注入高效液相色谱仪得到指纹图谱。在本发明通过高效液相色谱法建立起金蓉消癖颗粒的HPLC指纹图谱，从色谱的整体面貌特征上把握金蓉消癖颗粒的质量情况，既可以作为金蓉消癖颗粒的质量控制标准，也可以全面控制产品的质量。

权利要求

1.金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

供试品溶液的制备：取金蓉消癖颗粒成品，研细，精密称定，加50％甲醇，加热回流，放冷，滤过，定容，过微孔滤膜，取续滤液，即得，其中金蓉消癖颗粒为中药制剂，包括淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、女贞子、制何首乌、鳖甲及牡蛎；

对照品溶液的制备：精密称取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品、丹酚酸B对照品、淫羊藿苷对照品，加甲醇制成含各对照品的混合溶液，过微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液；

测定：精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，以松果菊苷对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，得到指纹图谱，其中色谱条件：采用碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为320nm；所述的梯度洗脱程序为：

0min时，流动相A：流动相B＝26:74

10min时，流动相A：流动相B＝39:61

17min时，流动相A：流动相B＝43:57

25min时，流动相A：流动相B＝50:50

35min时，流动相A：流动相B＝58:42

40min时，流动相A：流动相B＝75:25。

2.根据权利要求1所述的金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的供试品溶液由金蓉消癖颗粒1g溶于100mL 50％甲醇中制得。

3.根据权利要求1所述的金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的对照品溶液中每1mL甲醇含松果菊苷对照品50μg、毛蕊花糖苷对照品30μg、丹酚酸B对照品50μg、淫羊藿苷对照品30μg。

4.根据权利要求1所述的金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述的指纹图谱标记出13个共有峰，其中2号峰为松果菊苷峰，记为参照峰(S)，4号峰为毛蕊花糖苷峰，7号峰为丹酚酸B，10号峰为淫羊藿苷峰。

说明书

金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药制剂检测技术领域，具体涉及以中药为主要原料制成的金蓉消癖颗粒的指纹图谱测定方法的建立。

背景技术

[0002] 金蓉消癖颗粒是由淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、女贞子、制何首乌、鳖甲及牡蛎为主要原料经适宜的提取、加工而制成，例如中国专利ZL200510034765.8。其具有补肾活血、化痰散结、调摄冲任的功效，用于治疗乳腺增生病痰瘀互结、冲任失调证，且疗效已得到临床试验的验证。药理实验表明，其能降低血清雌二醇、黄体生成素含量，升高孕酮、促卵泡激素含量，调节血液中雌孕激素的相对平衡，改善血液流变性，降低乳腺增生的乳腺小叶数、腺泡数、腺泡腔直径以及胞浆面积，改善乳腺结构，具有镇痛和抗炎作用。临床研究结果证实，金蓉消癖颗粒根据补益肝肾、调理冲任以治本，疏肝理气活血、化痰散结以治标的治疗原则组方，对治疗痰瘀互结、冲任失调型的乳腺增生病疗效确切，具有“标本兼治、病证合医”的效果。

[0003] 中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。美国FDA最近几年制定的植物药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。中国国家药品监督管理部门于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求》，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准。

[0004] 目前金蓉消癖颗粒采用的质量控制方法是参照《中国药典》2010年版一部颗粒剂的有关要求，主要是采用TLC鉴别，只有一个HPLC含量测定项目，用于测定本品中淫羊藿苷的含量，显然现有的质量控制方法未能达到全面控制产品质量的目的。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点，采用该方法可以有效控制金蓉消癖颗粒的质量。

[0006] 本发明的金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

[0007] 供试品溶液的制备：取金蓉消癖颗粒成品，研细，精密称定，加50%甲醇，加热回流，放冷，滤过，定容，过微孔滤膜，取续滤液，即得，其中金蓉消癖颗粒为中药制剂，包括淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、女贞子、制何首乌、鳖甲及牡蛎；

[0008] 对照品溶液的制备：精密称取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品、丹酚酸B对照品、淫羊藿苷对照品，加甲醇制成含各对照品的混合溶液，过微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液；

[0009] 测定：精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，以松果菊苷对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，得到指纹图谱，其中色谱条件：采用碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为320nm，。

[0010] 所述的梯度洗脱程序为：

[0011] 0min时，流动相A：流动相B=26:74

[0012] 10min时，流动相A：流动相B=39:61

[0013] 17min时，流动相A：流动相B=43:57

[0014] 25min时，流动相A：流动相B=50:50

[0015] 35min时，流动相A：流动相B=58:42

[0016] 40min时，流动相A：流动相B=75:25。

[0017] 所述的供试品溶液由金蓉消癖颗粒1g溶于100ml50％甲醇中制得。

[0018] 所述的对照品溶液中每1ml甲醇含松果菊苷对照品50μg、毛蕊花糖苷对照品30μg、丹酚酸B对照品50μg、淫羊藿苷对照品30μg。

[0019] 所述的指纹图谱标记出13个共有峰，其中2号峰为松果菊苷峰，记为参照峰（S），4号峰为毛蕊花糖苷峰，7号峰为丹酚酸B，10号峰为淫羊藿苷峰。

[0020] 为了建立金蓉消癖颗粒全面有效的质量评价方法，确保金蓉消癖颗粒质量稳定，使其质量控制技术更完善，本发明提供了一种金蓉消癖颗粒的指纹图谱测定方法。在本发明中，通过高效液相色谱法建立起金蓉消癖颗粒的HPLC指纹图谱，从色谱的整体面貌特征上把握金蓉消癖颗粒的质量情况。本发明是在大量实验基础上所得到的切实可行的方法，可以作为金蓉消癖颗粒的质量控制标准，可以全面控制产品的质量。本发明具有如下优点：

[0021] 1.本发明以金蓉消癖颗粒中主要有效成分松果菊苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、淫羊藿苷为指标建立指纹图谱，代表了金蓉消癖颗粒的药效活性，能有效控制金蓉消癖颗粒的质量，并实现对金蓉消癖颗粒各批成品中各化学成分的相似度评价，可以从整体上控制金蓉消癖颗粒的质量。

[0022] 2.本发明对松果菊苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、淫羊藿苷等化学成分同时进行检测，把各成分指纹图谱作为一个整体看待，注重图谱的“整体特征”，并可根据图谱进行各有效成分的含量测定，避免了只测定某一种化学成分来判断金蓉消癖颗粒质量的片面性。本发明为完整、准确评价金蓉消癖颗粒的质量提供了新的标准，将为提高金蓉消癖颗粒的质量及疗效控制提供参考依据。

[0023] 3.本发明的指纹图谱检测方法，具有简便、稳定、精密度好、重现性好、易于操作等优点，能从色谱的整体特征上把握金蓉消癖颗粒的质量情况。

附图说明

[0024] 图1是含有松果菊苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的对照品的色谱图；

[0025] 图2是本发明的金蓉消癖颗粒的标准指纹图谱；

[0026] 图3是11批金蓉消癖颗粒的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

[0027] 本发明的金蓉消癖颗粒指纹图谱的建立方法包括以下步骤：

[0028] 供试品溶液的制备：取金蓉消癖颗粒成品，研细，精密称定，加50%甲醇，加热回流，放冷，滤过，定容，过微孔滤膜，取续滤液，即得，其中金蓉消癖颗粒为中药制剂，包括淫羊藿、肉苁蓉、郁金、丹参、莪术、益母草、女贞子、制何首乌、鳖甲及牡蛎。优选的，取金蓉消癖颗粒1g定容于100ml50％甲醇中制得供试品溶液。

[0029] 对照品溶液的制备：精密称取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品、丹酚酸B对照品、淫羊藿苷对照品，加甲醇制成含各对照品的混合溶液，过微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。优选的，对照品溶液中每1ml甲醇含松果菊苷对照品50μg、毛蕊花糖苷对照品30μg、丹酚酸B对照品50μg、淫羊藿苷对照品30μg。

[0030] 测定：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相法测定，以松果菊苷对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得指纹图谱，标记出13个共有峰，其中2号峰为松果菊苷峰，记为参照峰（S），4号峰为毛蕊花糖苷峰，7号峰为丹酚酸B，10号峰为淫羊藿苷峰。色谱条件：采用碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（例如安捷伦C18柱（4.6mm*150mm，5μm）、依利特hypersil BDS-C18(4.6mm×150mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为320nm。优选的，所述的梯度洗脱程序为：

[0031] 0min时，流动相A：流动相B=26:74

[0032] 10min时，流动相A：流动相B=39:61

[0033] 17min时，流动相A：流动相B=43:57

[0034] 25min时，流动相A：流动相B=50:50

[0035] 35min时，流动相A：流动相B=58:42

[0036] 40min时，流动相A：流动相B=75:25。

[0037] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非本对发明的限制。

[0038] 实施例

[0039] 1.仪器与试药

[0040] Agilent1100高效液相色谱仪；DAD（二极管阵列）检测器；安捷伦色谱工作站数据处理系统；松果菊苷对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用）、毛蕊花糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，纯度≥94.8%）、丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所，纯度≥98.2%）、淫羊藿苷对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用）；甲醇、乙腈均为色谱纯；0.1%甲酸为色谱纯；屈臣氏纯净水；11批金蓉消癖颗粒成品。

[0041] 2.色谱条件

[0042] 色谱柱为安捷伦C18柱（4.6mm*150mm，5μm）；以甲醇为流动相A，0.1%甲酸为流动相B进行梯度洗脱；柱温28℃；流速1ml/min；检测波长320nm，理论塔板数按松果菊苷计算，应不低于4000。梯度洗脱程序为：

[0043] 0min时，流动相A：流动相B=26:74

[0044] 10min时，流动相A：流动相B=39:61

[0045] 17min时，流动相A：流动相B=43:57

[0046] 25min时，流动相A：流动相B=50:50

[0047] 35min时，流动相A：流动相B=58:42

[0048] 40min时，流动相A：流动相B=75:25

[0049] 3.指纹图谱测定方法建立

[0050] 3.1供试品溶液制备：取金蓉消癖颗粒1g，精密称定，置250ml圆底烧瓶中，加50％甲醇约90ml，加热回流提取2小时，取出，放冷，滤过，置100ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

[0051] 3.2对照品溶液的制备：精密称取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品、丹酚酸B对照品、淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解制成每1ml含松果菊苷对照品50μg、毛蕊花糖苷对照品30μg、丹酚酸B对照品50μg、淫羊藿苷对照品30μg，即得。

[0052] 3.3测定方法：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，记录50min的色谱图，分别见图1、图2。

[0053] 3.3共有峰确定：通过11批金蓉消癖颗粒指纹图谱测定，比较其色谱图，标记出13个共有峰，共有峰面积总和占所有峰总面积90%以上。其中2号峰为松果菊苷峰，记为参照峰（S），4号峰为毛蕊花糖苷峰，7号峰为丹酚酸B，10号峰为淫羊藿苷峰。如图2所示。

[0054] 3.4方法学考察

[0055] 3.4.1精密度考察：分别以同一批金蓉消癖颗粒供试液，按上述色谱条件连续进样6次，考察仪器的精密度，分别计算共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD），结果RSD(%)未超过4%，表明仪器精密度良好。

[0056] 3.4.2稳定性考察：分别以同一批金蓉消癖颗粒供试液，按上述色谱条件于0、2.5、7.5、11、15.5、22h进样分析，计算共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD），结果RSD(%)未超过4%，表明供试液较为稳定。

[0057] 3.4.3重现性考察：取同一批次的金蓉消癖颗粒成品6份，按3.1项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行色谱分析，分别计算共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD），结果RSD(%)未超过4%，表明此方法重复性好。

[0058] 4.金蓉消癖颗粒样品的测定：按照所述检测方法和条件分别测定11批金蓉消癖颗粒，采集50min色谱图，即为这11批金蓉消癖颗粒的指纹图谱，如图3所示。

[0059] 5.测定结果：

[0060] 采用国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”对11批金蓉消癖颗粒的色谱指纹图谱进行分析，计算整体相似度，结果同一时间段同批药材生产的不同批次金蓉消癖颗粒指纹图貌较为相似。6批样品的指纹图谱全貌相似度在0.9以上，4批样品的指纹图谱全貌相似度在0.8～0.9之间，1批样品的指纹图谱全貌相似度为0.6。
表明最近几批生产的样品的指纹图谱较为相似，提示生产工艺越趋稳定，原药材来源与质量控制趋于稳定。