一种尿液中巯基尿酸类物质的分离富集及检测方法

摘要

本发明涉及一种尿液中巯基尿酸类物质的分离富集和检测方法，利用与水相互不相容的离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐作为富集介质，通过在尿液中施加极少量的离子液体[C8mim][PF6]与乙腈，控制富集条件达到巯基尿酸类物质的富集；之后采用HPLC-MS/MS分析平台，完成7种巯基尿酸类物质即CEMA、DHBMA、MHBMA、PMA、HPMMA和PHEMA分析检测；本发明方法富集速度快，且通过优化整体色谱条件，实现了一次进样，同时分析，大大提高了工作效率。

权利要求

1.一种吸烟者尿液中巯基尿酸类物质的分离富集方法，包括以下步骤：(1)在吸烟者尿液中添加离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈，混合形成混合乳液；

(2)经离心分离即得到富集有巯基尿酸类物质的下层液体；

步骤(1)中，所述离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、乙腈和吸烟者尿液的混合配比为：30～100mg：0.5～2mL：2～10mL；所述巯基尿酸类物质包括：S-苯巯基尿酸(PMA)、N-乙酰基-S-(2-羟基-1-苯乙基)-L-半胱氨酸(PHEMA)、乙酰-S-(3-羟丙基-1-甲基)-L-2-氨基-3-巯基丙酸盐二环己基胺(HPMMA)、N-乙酰基-S-(4-羟基-2-丁烯-1-基)-L-半胱氨酸(MHBMA)、N-乙酰-S-(3-羟丙基)半胱氨酸二环乙基(3HPMA)、N-乙酰-S-(2-羧乙基)-L-半胱氨酸二(二环己胺)(CEMA)和N-乙酰-S-(3，4-二羟基丁基)-L-半胱氨酸(DHBMA)。

2.如权利要求1所述的一种吸烟者尿液中巯基尿酸类物质的分离富集方法，其特征在于，步骤(1)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声

1-3分钟。

3.如权利要求1所述的一种吸烟者尿液中巯基尿酸类物质的分离富集方法，其特征在于，步骤(2)中，采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心1-5分钟。

4.一种吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质的分析检测方法，具体包括以下步骤：(I)配制五级标准工作溶液，每级标准工作溶液均为含有PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、

13

3HPMA、CEMA和DHBMA的甲醇溶液；配制内标溶液，所述内标溶液为含有D5-PMA、C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的甲醇溶液；

(II)在每级标准工作溶液加入相同的内标溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙腈形成混合乳液；然后离心分离获得下层液体；采用液相色谱串联质谱对下层液体进行测定，获得7种巯基尿酸类物质的标准色谱分离图；

(III)取吸烟者尿液，加入内标溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙腈形成混合乳液；然后离心分离获得下层液体；采用液相色谱串联质谱对下层液体进行测定，获得吸烟者尿液中各巯基尿酸类物质的实际样品色谱分离图；

(IV)利用所制得标准色谱分离图和实际样品色谱分离图进行定性和定量分析；

步骤(Ⅱ)中，每级标准溶液、内标溶液、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈的相对加入量为1～5mL：20～100μL：30～100mg：0.5～2mL；

步骤(Ⅲ)中，所述吸烟者尿液、内标溶液、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈的相对加入量为1～5mL：20～100μL：30～100mg：0.5～2mL；

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中，所述液相色谱串联质谱测定时的色谱条件为：负离子模式EI源；色谱柱为：150mm×2.1mm i.d,3μm Sequant ZIC-cHILIC色谱柱；流动相A相为

0.2wt％的乙酸乙腈溶液，流动相B相为0.2wt％的乙酸水溶液；采用梯度洗脱程序：0-2min

95％vA+5v％B；5min 90v％A+10v％B；3min 60v％A+40v％B；14min 50v％A+50v％B；

14.5min 95v％A+5v％B；30min 95v％A+5v％B；液相色谱串联质谱进样量为10μL。

5.如权利要求4所述的一种吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质的分析检测方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，第一级至第五级标准工作溶液中PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的浓度均分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和500ng/mL；所述内标

13

溶液中D5-PMA、C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的浓度均为

50ng/mL。

6.如权利要求5所述的一种吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质的分析检测方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(a)步骤(Ⅱ)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟；

(b)步骤(Ⅱ)中，所述离心分离采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心

1-5分钟。

7.如权利要求5所述的一种吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质的分析检测方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(a)步骤(Ⅲ)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟；

(b)步骤(Ⅲ)中，所述离心分离采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心

1-5分钟。

说明书

一种尿液中巯基尿酸类物质的分离富集及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种尿液中巯基尿酸类物质的分离富集和检测方法，具体涉及尿液中7种巯基尿酸类物质的快速分离富集方法，以及一种采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定吸烟者尿液中7种巯基尿酸物质含量的分析方法。

背景技术

[0002] 卷烟燃烧会产生大量的挥发性有机化合物，其中就包括丙烯醛、苯、1,3-丁二烯、苯乙烯、巴豆醛等，这些挥发性有机物具有较强的致癌或致突变作用，进入人体后会对人体的代谢物产生影响，主要形成巯基尿酸类物质。这类物质具有较好的特异性，是外源性亲电子化合物与谷胱甘肽结合后的分解产物，不再进一步发生反应，可以作为烟气暴露评定标志物。

[0003] 已有研究表明上述挥发性有机化合物所形成的7种巯基尿酸类物质分别：S-苯巯基尿酸(PMA)、N-乙酰基-S-(2-羟基-1-苯乙基)-L-半胱氨酸(PHEMA)、乙酰-S-(3-羟丙基-1-甲基)-L-2-氨基-3-巯基丙酸盐二环己基胺(HPMMA)、N-乙酰基-S-(4-羟基-2-丁烯-1-基)-L-半胱氨酸(MHBMA)、N-乙酰-S-(3-羟丙基)半胱氨酸二环乙基(3HPMA)、N-乙酰-S-(2-羧乙基)-L-半胱氨酸二(二环己胺)(CEMA)和N-乙酰-S-(3，4-二羟基丁基)-L-半胱氨酸(DHBMA)。由于这类物质含量较低，代谢物基质也较为复杂，因此分析吸烟者尿液中的巯基尿酸类物质具有相当高的难度。

[0004] 目前，富集巯基尿酸类物质主要依靠固相萃取(SPE)完成，之后配合HPLC-MS/MS分析检测。但是采用SPE实现样品富集，耗时长，成本高，且洗脱时有机溶剂使用量大，对环境不友好。这些问题极大影响了富集巯基尿酸的能力，同时影响了分析巯基尿酸类物质结果的准确性。

[0005] 离子液体是一种新型的绿色溶剂，是完全由离子组成的盐类，在室温呈液体状态，一般由含氮、磷的有机阳离子和无机阴离子组成。改变阴阳离子组成，可以组成不同性质的离子液体。目前，与广泛应用的有机溶剂相比，离子液体具有以下突出的优点：(1)蒸汽压极低，不易挥发；(2)对有机物、无机物都有良好的溶解性，可以作为良好的液体萃取剂；(3)具有结构可调控性；(4)离子液体有良好的导电性、热稳定性和极好的抗氧化性。因此，本发明利用离子液体的上述特性，在优化条件的基础上实现巯基尿酸类物质的富集。选择高灵敏度的HPLC-MS/MS分析平台，实现了吸烟者尿液中7种巯基尿酸物质快速准确分析。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种尿液中巯基尿酸类物质的分离富集和检测方法；利用与水相互不相容的离子液体(1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，[C8mim][PF6])作为富集介质，通过在尿液中施加极少量的离子液体[C8mim][PF6]与乙腈，控制富集条件达到巯基尿酸类物质的富集。之后采用HPLC-MS/MS分析平台，完成7种巯基尿酸类物质即CEMA、DHBMA、MHBMA、PMA、HPMMA和PHEMA分析。

[0007] 具体，所述一种尿液中巯基尿酸类物质的分离富集方法，包括以下步骤：

[0008] (1)在吸烟者尿液中添加离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8mim][PF6])和乙腈，混合形成混合乳液；

[0009] (2)离心分离即得到富集有巯基尿酸类物质的下层液体。

[0010] 本发明所述方法中尿液中巯基尿酸类物质富集原理在于：乳液一般是由水、油、助剂等组分以适当比例自发形成的低粘度且各向同性的热力学稳定体系。由于体系到达平衡的时间很短，因此极大加快富集的时间。本发明在吸烟者尿液中添加离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8mim][PF6])和乙腈后，能很快形成1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(离子液体)/乙腈/尿液所组成的乳液混合体系，从而实现快速萃取巯基尿酸的目的。

[0011] 优选的，步骤(1)中，所述离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8mim][PF6])、乙腈和吸烟者尿液的混合配比为：30～100mg：0.5～2mL：2～10mL。

[0012] 优选的，步骤(1)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟。

[0013] 涡旋(Vortex)有时也称旋涡。是指一种半径很小的圆柱在静止流体中旋转引起周围流体作圆周运动的流动现象。实验中涡旋的作用是将水相和离子液体相进行充分的物质交互，以提高萃取效率，同时使体系形成乳液。整个过程必须是先涡旋后超声。

[0014] 优选的，步骤(2)中，采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心1-5分钟。

[0015] 优选的，所述巯基尿酸类物质包括：S-苯巯基尿酸(PMA)、N-乙酰基-S-(2-羟基-1-苯乙基)-L-半胱氨酸(PHEMA)、乙酰-S-(3-羟丙基-1-甲基)-L-2-氨基-3-巯基丙酸盐二环己基胺(HPMMA)、N-乙酰基-S-(4-羟基-2-丁烯-1-基)-L-半胱氨酸(MHBMA)、N-乙酰-S-(3-羟丙基)半胱氨酸二环乙基(3HPMA)、N-乙酰-S-(2-羧乙基)-L-半胱氨酸二(二环己胺)(CEMA)和N-乙酰-S-(3，4-二羟基丁基)-L-半胱氨酸(DHBMA)等。

[0016] 优选的，本发明进一步提供一种吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质的分析检测方法，具体包括以下步骤：

[0017] (I)配制五级标准工作溶液，每级标准工作溶液均为含有PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的甲醇溶液；配制内标溶液，所述内标溶液为含有D5-PMA、13
C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的甲醇溶液；

[0018] (II)在每级标准工作溶液中加入相同的内标溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙腈形成混合乳液；然后离心分离获得下层液体；采用液相色谱串联质谱对下层液体进行测定，获得7种巯基尿酸类物质的标准色谱分离图；

[0019] (III)取吸烟者尿液，加入内标溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙腈形成混合乳液；然后离心分离获得下层液体；采用液相色谱串联质谱对下层液体进行测定，获得吸烟者尿液中各巯基尿酸类物质的实际样品色谱分离图；

[0020] (IV)利用所制得标准色谱分离图和实际样品色谱分离图进行定性和定量分析。

[0021] 其中，

[0022] 优选的，步骤(Ⅰ)中，所述第一级至第五级标准工作溶液中PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的浓度均分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和500ng/mL。

[0023] 优选的，步骤(Ⅰ)中，所述内标溶液中D5-PMA、13C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的浓度均为50ng/mL。

[0024] 优选的，步骤(Ⅱ)中，每级标准溶液、内标溶液、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈的相对加入量为2～10mL：20～100μL：30～100mg：0.5～2mL。

[0025] 优选的，步骤(Ⅱ)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟。

[0026] 优选的，步骤(Ⅱ)中，所述离心分离采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心1-5分钟。

[0027] 优选的，步骤(Ⅲ)中，所述吸烟者尿液、内标溶液、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈的相对加入量为2～10mL：20～100μL：30～100mg：0.5～2mL。

[0028] 优选的，步骤(Ⅲ)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟。

[0029] 优选的，步骤(Ⅲ)中，所述离心分离采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心1-3分钟。

[0030] 优选的，步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中，所述液相色谱串联质谱测定时的色谱条件为：负离子模式EI源；色谱柱为：150mm×2.1mm i.d,3μm Sequant ZIC-cHILIC色谱柱；流动相A相为0.2wt％的乙酸乙腈溶液，流动相B相为0.2wt％的乙酸水溶液；梯度洗脱程序：0-2min95％vA+5v％B；5min 90v％A+10v％B；3min 60v％A+40v％B；14min 50v％A+50v％B；
14.5min 95v％A+5v％B；30min 95v％A+5v％B；液相色谱串联质谱进样量为10μL。

[0031] 步骤(Ⅳ)的中：通过保留时间和质量数进行定性分析。以各巯基尿酸类物质的峰面积与相应内标物的峰面积之比、相应内标物的质量和相应的标准工作曲线计算，获得7种巯基尿酸类物质的含量(mx)，具体计算公式如下：

[0032] mx＝f×Ax/(As/ms)；

[0033] 其中，f为响应因子，Ax和As分别为待测物和内标物的峰面积，ms为内标物的量。

[0034] 上述检测方法可用于吸烟者尿液测定后吸烟暴露标志物含量测定的应用。

[0035] 本发明的技术效果及优点在于：

[0036] 1、尿液中巯基尿酸类物质含量较低，前处理多采用固相萃取(SPE)完成富集。但整体操作耗时长，成本高，且使用挥发性较高的有机溶剂，对环境造成一定影响。本发明则利用不易挥发，稳定性好，达到热力学稳定快的离子液体乳液实现了快速富集尿液中巯基尿酸。

[0037] 2、目前报道的巯基尿酸类物质多是针对单位物质的测试方法，本发明通过优化整体色谱条件，实现了一次进样，同时分析，大大提高了工作效率。

附图说明

[0038] 图1：离子液体[C8mim][PF6]富集尿液中巯基尿酸过程示意图；

[0039] 图2：离子液体[C8mim][PF6]添加量与待测物萃取回收率示意图；

[0040] 图3：乙腈添加量与待测物萃取回收率示意图；

[0041] 图4：7种标准巯基尿酸类物质的HPLC-MS/MS色谱分离检测图(1，PMA；2，PHEMA；3，HPMMA；4，MHBMA；5，3HPMA；6，CEMA和7，DHBMA)

[0042] 图5：尿液中HPMMA的HPLC-MS/MS分离色谱图；

[0043] 图6：尿液中3HPMA的HPLC-MS/MS分离色谱图；

[0044] 图7：尿液中CEMA的HPLC-MS/MS分离色谱图；

[0045] 图8：尿液中DHBMA的HPLC-MS/MS分离色谱图；

[0046] 图9：尿液中MHBMA的HPLC-MS/MS分离色谱图。

具体实施方式

[0047] 以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

[0048] 本发明提供一种尿液中7种巯基尿酸类物质的分离富集以及分析检测，在吸烟者尿液中添加离子液体1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8mim][PF6])和乙腈，混合形成混合乳液；离心分离获得富集有巯基尿酸类物质的下层液体；即如图1所示：借助[C8mim][PF6]离子液体与乙腈与吸烟者尿液形成乳浊体系，通过物质交换以及高速离心方式，实现7种巯基尿酸物质的富集与分离；然后采用HPLC-MS/MS即可实现吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质的分析检测。

[0049] 所述7种巯基尿酸类物质分别是：S-苯巯基尿酸(PMA)、N-乙酰基-S-(2-羟基-1-苯乙基)-L-半胱氨酸(PHEMA)、乙酰-S-(3-羟丙基-1-甲基)-L-2-氨基-3-巯基丙酸盐二环己基胺(HPMMA)、N-乙酰基-S-(4-羟基-2-丁烯-1-基)-L-半胱氨酸(MHBMA)、N-乙酰-S-(3-羟丙基)半胱氨酸二环乙基(3HPMA)、N-乙酰-S-(2-羧乙基)-L-半胱氨酸二(二环己胺)(CEMA)和N-乙酰-S-(3，4-二羟基丁基)-L-半胱氨酸(DHBMA)。

[0050] 分析检测过程包括以下步骤：

[0051] (Ⅰ)配制五级标准工作溶液，每级标准工作溶液均为含有PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的甲醇溶液；配制内标溶液，所述内标溶液为含有D5-PMA、13
C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的甲醇溶液；

[0052] 作为优选的实施情况：所述第一级至第五级标准工作溶液中PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的浓度均分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和500ng/mL；

[0053] 作为优选的实施情况：所述内标溶液中D5-PMA、13C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的浓度均为50ng/mL；

[0054] (Ⅱ)在每级标准工作溶液中加入相同的内标溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙腈形成混合乳液；然后离心分离获得下层液体；采用液相色谱串联质谱对下层液体进行测定，获得7种巯基尿酸类物质的标准色谱分离图；

[0055] 作为优选的实施情况，步骤(Ⅱ)中，每级标准溶液、内标溶液、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈的相对加入量为2～10mL：20～100μL：30～100mg：0.5～2mL；

[0056] 作为优选的实施情况，步骤(Ⅱ)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟；步骤(Ⅱ)中，所述离心分离采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心1-5分钟。

[0057] (Ⅲ)取吸烟者尿液，加入内标溶液，并加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙腈形成混合乳液；然后离心分离获得下层液体；采用液相色谱串联质谱对下层液体进行测定，获得吸烟者尿液中各巯基尿酸类物质的实际样品色谱分离图；

[0058] 作为优选的实施情况，步骤(Ⅲ)中，所述吸烟者尿液、内标溶液、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和乙腈的相对加入量为2～10mL：20～100μL：30～100mg：0.5～2mL；

[0059] 作为优选的实施情况，步骤(Ⅲ)中，所述形成混合乳液过程为，先涡旋30-120秒，然后再于20-50℃条件下超声1-3分钟；步骤(Ⅲ)中，所述离心分离采用高速离心机，在3000-8000转/分的转速下，离心1-3分钟

[0060] (Ⅳ)利用所制得标准色谱分离图和实际样品色谱分离图进行定性和定量分析；即，通过保留时间和质量数进行定性；以各巯基尿酸类物质的峰面积与相应内标物的峰面积之比、相应内标物的质量和相应的标准工作曲线计算，获得7种巯基尿酸类物质的含量(mx)，具体计算公式如下：

[0061] mx＝f×Ax/(As/ms)；

[0062] 其中，f为响应因子，Ax和As分别为待测物和内标物的峰面积，ms为内标物的量。

[0063] 相关仪器及色谱柱配置如下：

[0064] 安捷伦1200液相色谱仪，配有G1329A自动进样器、G1311A四元混合泵以及G1316A柱温箱(美国安捷伦公司)；

[0065] Eppendorf 5810R高速离心机(德国Eppendorf公司)；

[0066] API4000三重四级杆串联质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)和Analyst1.6软件数据处理系统(美国应用生物系统公司)。

[0067] HPLC-MS/MS仪器分析条件为：负离子模式EI源；色谱柱为：150mm×2.1mm i.d,3μm Sequant ZIC-cHILIC色谱柱；流动相A相为0.2wt％的乙酸乙腈溶液，流动相B相为0.2％的乙酸水溶液。梯度洗脱程序：0-2min 95％vA+5v％B；5min 90v％A+10v％B；3min 60v％A+40v％B；14min 50v％A+50v％B；14.5min 95v％A+5v％B；30min 95v％A+5v％B；液相色谱串联质谱进样量为10μL。

[0068] 如图2所示：通过固定尿液体积，乙腈体积，逐步改变离子液体[C8mim][PF6]加入量，考察7种巯基尿酸类物质萃取回收率的实验过程，确定了乳浊体系中离子液体[C8mim][PF6]的最优加入量与萃取回收率的关系；即5ml尿液，500μL乙腈体系中加入60mg离子液体[C8mim][PF6]，7种巯基尿酸类物质的萃取回收率最高。

[0069] 如图3所示：通过固定尿液体积与离子液体[C8mim][PF6]加入量，改变乙腈体积，考察7种巯基尿酸类物质回收率的实验过程，确定了乳浊体系中乙腈的最优加入量与萃取回收率的关系，即5ml尿液，60mg离子液体[C8mim][PF6]体系中加入500μL乙腈，7种巯基尿酸类物质的萃取回收率最高。

[0070] 以下通过具体实施例对本发明的技术方案做详细的说明：

[0071] 具体实验方法与参数如下：

[0072] 步骤一：配制五级均含有PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的甲醇溶液，作为标准工作溶液；第一级至第五级标准工作溶液中PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的浓度均分别为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和500ng/mL；

[0073] 配制含有D5-PMA、13C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA13
的甲醇溶液作为内标溶液，其中D5-PMA、C6-PHEMA、D4-HPMMA、D6-MHBMA、D3-3HPMA、D3-CEMA和D7-DHBMA的浓度均为50ng/mL。

[0074] 步骤二：取每级标准溶液5ml，加入50μL内标溶液、60mg[C8mim][PF6]离子液体与500μL乙腈，涡旋30秒后，置于室温超声2分钟形成混合乳液。然后置于高速离心机(5000转/分)，离心3分钟获得下层液体，利用液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)对下层液体进行测定(检测条件同上)，获得7种巯基尿酸标准色谱分离图，如图4所示；

[0075] 步骤三：取吸烟者尿样5ml，加入50μL内标溶液，60mg[C8mim][PF6]离子液体与500μL乙腈，涡旋30秒后，置于室温超声2分钟形成混合乳液。然后置于高速离心机(5000转/分)，离心3分钟获得下层液体，利用HPLC-MS/MS对下层液体进行测定(检测条件同上)，获得所述尿样中各巯基尿酸实际样品色谱分离图，如图5-9及表1所示；

[0076] 表1吸烟者尿液中7种巯基尿酸物质的平均含量(ND：未检出)

[0077]物质 平均含量(μg/L)
CEMA 477.4
3HPMA 1568
PMA ND
DHBMA 325.3
MHBMA 48.77
HPMMA 1555
PHEMA ND

[0078] 可以看出，吸烟者尿液中HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA的平均含量分别为1555μg/L,48.77μg/L,1568μg/L,477.4μg/L，325.3μg/L，而PMA与PHEMA两种代谢物未检出。

[0079] 以上仅为本发明检测方法用于检测吸烟者尿液中7种巯基尿酸类物质(PMA、PHEMA、HPMMA、MHBMA、3HPMA、CEMA和DHBMA)的分析检测的实例，本发明检测方法还可以实现其它巯基尿酸类物质的富集以及分析检测。