一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法

摘要

本发明涉及一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，包括：(1)取川芎挥发油包合物，精密称定，加入无水乙醇，超声提取，提取液用无水硫酸钠处理并离心，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；(2)取洋川芎内酯A对照品，精密称定，加入甲醇制成对照品溶液；(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入GC‑MS测定，即得川芎挥发油包合物指纹图谱。本发明对于指导在临床用药及生产过程中对于原料药有效的投料指导、确保质量的可靠具有积极作用；操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对中药材川芎挥发油包合物质量进行评价，结论较为客观、准确。

权利要求

1.一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，包括：

(1)取川芎挥发油包合物，精密称定，加入无水乙醇，超声提取40～60min，提取液用无水硫酸钠处理并离心，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

(2)取洋川芎内酯A对照品，精密称定，加入甲醇制成对照品溶液；

(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入GC-MS测定，即得川芎挥发油包合物指纹图谱；其中，质谱条件：电离方式为标准EI源，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃，数据采集扫描模式全扫描，质量范围为：30～400amu；溶剂延迟4min；色谱条件：Agilent HP-5MS色谱柱；进样口温度为270℃，载气为氦气，柱流量为

1.0ml·min-1，升温程序为初始温度为50℃，保持4min，以4℃·min-1的速度升温至130℃，保持20min，以20℃·min-1的速度升温至290℃，后运行300℃，保持3min，进样体积为1μl。

2.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的川芎挥发油包合物的获取方式为：川芎经过水蒸气蒸馏法提取挥发油后，采用β环糊精进行包合或者川芎采用二氧化碳超临界提取油后，采用β环糊精进行包合。

3.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的川芎挥发油包合物与无水乙醇的比例为0.4g:30ml。

4.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(2)中的甲醇的体积百分数为99.6％。

6.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(2)中的对照品溶液具体为：每1ml含洋川芎内酯A 0.4mg的混合溶液。

7.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Agilent HP-5MS色谱柱规格为0.25μm×250μm×30.0m。

8.根据权利要求1所述的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的川芎挥发油包合物指纹图谱中18个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定峰12为洋川芎内酯A。

说明书

一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药指纹图谱领域，特别涉及一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法。

背景技术

[0002] 川芎是中国药典收载的常用中药。川芎是伞形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong)的干燥根茎。川芎中含有多种化学成分：(1)生物碱，川芎嗪(四甲基吡嗪，Tetramethyl-pyrazine)、黑麦草灵(Perlolyrine)亮氨酰苯丙酸内酰胺(Leucylphenylalanine anhydri-de)、腺嘧啶(Adenine)、三甲胺(Trimethylamine)、胆碱(Choline)等；(2)挥发油，十五酸乙酯(Ethyl pentadecanoate)、十六酸乙酯(Ethyl palmitate)、十七酸乙酯(Ethyl heptadecanoate)、异十七酸乙酯(Ethyl 
isoheptadecanoate)、十八酸乙酯(Ethyl octadecanoate)等；(3)内酯类化合物，丁基酜内酯(Butylphtha-lide)、丁烯基酜内酯(Butylidene phthalide)、藁本内酯(Ligustilide)、新蛇床内酯(Neocnidilide).洋川芎内酯(senkyunolide)A、B、C、E、F、I等；(4)有机酸，如阿魏酸(Ferulic acid)、瑟丹酸(Sedanonic acid)、叶酸(Folic acid)、香草酸(Vanillic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、棕榈酸(Palmitic acid)、亚油酸(Linolenic acid)、4-羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid)等；亦含苯酞类化合物4-羟基-3-丁基苯酞(4-Hydroxy-3-butylphthalide)以及苯酞衍生物，如川芎内酯(Cnidiumlactone)、川芎酚(Chuanxingol)等以及双苯酞衍生物。

[0003] 川芎主要分布区域：四川、云南、贵州、广西、湖北、湖南、江西、浙江、江苏、陕西、甘肃等。功能与主治：活血行气，祛风止痛。用于胸痹心痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，月经不调，经闭痛经，癥瘕腹痛，头痛，风湿痹痛。

[0004] 中国药典2010年版一部川芎项下收载了薄层色谱的方法以川芎对照药材和欧当归内酯A为参照物鉴别川芎药材；采用液相色谱法测定了川芎中成分阿魏酸的含量；川芎中所含有的成分主要是极性较小的萜类化合物，如单萜、倍半萜等，挥发油中主要即是该类成分，建立一种有效分离检识极性小、分子量小成分测试方法，以全面地评价川芎药材及挥发油包合物的质量。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，该方法可有效地监控川芎挥发油包合物药材的质量，保证其在临床或生产应用时的有效、安全和稳定。

[0006] 本发明的一种川芎挥发油包合物指纹图谱的测定方法，包括：

[0007] (1)取川芎挥发油包合物，精密称定，加入无水乙醇，超声(40KHz～60KHz，250W)提取40～60min，提取液用无水硫酸钠处理并离心，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；供试品前处理采用无水硫酸钠处理去除供试品中残存的水分，以保证测试的准确性；

[0008] (2)取洋川芎内酯A对照品，精密称定，加入甲醇制成对照品溶液；

[0009] (3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入GC-MS测定，即得川芎挥发油包合物指纹图谱；其中，质谱条件：电离方式为标准EI源，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃，数据采集扫描模式全扫描，质量范围为：30～400amu；溶剂延迟4min；色谱条件：Agilent HP-5MS色谱柱；进样口温度为270℃，载气为氦气，柱流量为1.0ml·min-1，升温程序为初始温度为50℃，保持4min，以4℃·min-1的速度升温至130℃，保持20min，以20℃·min-1的速度升温至290℃，后运行300℃，保持3min，进样体积为1μl。

[0010] 所述步骤(1)中的川芎挥发油包合物的获取方式为：川芎经过水蒸气蒸馏法提取挥发油后，采用β环糊精进行包合或者川芎采用二氧化碳超临界提取油后，采用β环糊精进行包合。

[0011] 所述步骤(1)中的川芎挥发油包合物与无水乙醇的比例为0.4g:30ml。

[0012] 所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔径为0.22μm。

[0013] 所述步骤(2)中的甲醇的体积百分数为99.6％。

[0014] 所述步骤(2)中的对照品溶液具体为：每1ml含洋川芎内酯A 0.4mg的混合溶液。

[0015] 所述步骤(3)中的Kromasil 100-5C18色谱柱规格为0.25μm×250μm×30.0m。

[0016] 所述步骤(3)中的川芎挥发油包合物指纹图谱中18个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定峰12为洋川芎内酯A。

[0017] 所述步骤(3)中的指纹图谱测试条件进样分流比为5:1。

[0018] 有益效果

[0019] 本发明特对药材指纹图谱进行了研究，建立了液相指纹图谱测定条件，并进行了方法学考察，根据多批大生产样品，制订了川芎挥发油包合物液相指纹图谱标准，在生产过程中可有效的指导投料、规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠，对所测得的指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对药材指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

附图说明

[0020] 图1为10个批次川芎挥发油包合物指纹图谱；其中，a-j分别为S10-S1；图2为川芎挥发油包合物标准指纹图谱；其中，12为洋川芎内酯A。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0022] 实施例1

[0023] 1.供试品溶液提取方法的筛选：

[0024] 供试品溶液1的制备：取挥发油包合物包合前的挥发油，用无水乙醇稀释100倍，用无水硫酸钠除去水分，取1.5ml在12000r/min下离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

[0025] 供试品溶液2的制备：取挥发油包合物约0.8g，加无水乙醇25ml，超声提取30min，用无水硫酸钠除去水分，取1.5ml在12000r/min下离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

[0026] 供试品溶液3的制备：取挥发油包合物5g，加水500ml，用挥发油提取器提取4h，得挥发油，用无水硫酸钠除水并用无水乙醇稀释100倍，稀释液取1.5ml在12000r/min下离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

[0027] 色谱条件1：进样分流比为50:1，进样体积为1μl，升温程序：初始温度为60℃，保持5min，以5℃·min-1的速度升温至130℃，以2℃·min-1的速度升温至140℃，保持15min，后运行300℃，保持2min。

[0028] 色谱条件2：进样分流比为10:1，进样体积为1μl，升温程序：初始温度为60℃，保持-1 -15min，以5℃·min 的速度升温至120℃，以2℃·min 的速度升温至140℃，保持13min，后运行300℃，保持2min。

[0029] 色谱条件3：进样分流比为5:1，进样体积为1μl，升温程序：初始温度为60℃，保持5min，以5℃·min-1的速度升温至95℃，保持5min，以5℃·min-1的速度升温至120℃，保持-1
30min，以5℃·min 的速度升温至240℃，后运行300℃，保持2min。

[0030] 结果表明，供试品溶液1与供试品溶液2的色谱图中色谱峰数量对应较好，而供试品溶液3的色谱图与两者均相差较大，说明经过挥发油提取器的提取，川芎挥发油中的部分成分发生了较大变化，故为保证其原有入药成分的质量得到保证，应该采用超声提取法提取包合物的挥发油进行质量控制。

[0031] 2.供试品溶液制备提取溶剂的筛选

[0032] 供试品溶液的制备：称取挥发油包合物0.8g三份，精密称定，分别加入乙醚、无水乙醇和乙腈，各25ml，超声提取30min，放冷，补足减失的溶剂重量，用无水硫酸钠除去水分，各取1ml在12000r/min下离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

[0033] 色谱条件1：进样分流比为5:1，进样体积为为1μl，升温程序：初始温度为50℃，以5℃·min-1的速度升温至240℃，保持3min，再以5℃·min-1的速度升温至290℃，保持3min，后运行300℃，保持2min。

[0034] 色谱条件2：进样分流比为5:1，进样体积为1μl，升温程序：初始温度为50℃，以5℃·min-1的速度升温至300℃，后运行300℃，保持2min。

[0035] 色谱条件3：进样分流比为5:1，进样体积为1μl，升温程序：初始温度为60℃，保持5min，以5℃·min-1的速度升温至120℃，以2℃·min-1的速度升温至140℃，保持8min，后运行300℃，保持2min。

[0036] 结果表明，与无水乙醇提取溶液相比，乙醚和乙腈提取制得的供试品溶液谱图5～15min内色谱峰数量较少，故提取溶剂选择无水乙醇。

[0037] 3.供试品溶液制备提取时间的筛选

[0038] 质谱条件：同上。

[0039] 供试品溶液的制备：取挥发油包合物约0.4g三份，精密称定，分别加无水乙醇30ml，分别超声(40KHz，250W)提取20min、40min、60min，提取液用无水硫酸钠除水并在
12000r/min下离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

[0040] 色谱条件：进样分流比为5:1，进样体积为1μl，升温程序：初始温度为50℃，保持4min，以4℃·min-1的速度升温至130℃，保持20min，以20℃·min-1的速度升温至290℃，后运行300℃，保持3min。

[0041] 结果表明，超声提取40min比20min好，但与60min基本无差别，故选择超声提取时间为40min。

[0042] 4.具体检测：

[0043] (1)取川芎挥发油包合物，精密称定，加入无水乙醇，超声(40KHz～60KHz，250W)提取40～60min，提取液用无水硫酸钠处理并在12000r/min下离心，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；

[0044] (2)用甲醇制成每1ml约含洋川芎内酯A 0.4mg的溶液，即得对照品溶液；

[0045] (3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入GC-MS测定，即得川芎挥发油包合物指纹图谱；其中，质谱条件：电离方式为标准EI源，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃，数据采集扫描模式全扫描，质量范围为：30～400amu；溶剂延迟4min；色谱条件：Agilent HP-5MS色谱柱(0.25μm×250μm×30.0m)；进样口温度为270℃，载气为氦气，柱流量为1.0ml·min-1，升温程序为初始温度为50℃，保持-1 -1
4min，以4℃·min 的速度升温至130℃，保持20min，以20℃·min 的速度升温至290℃，后运行300℃，保持3min，进样体积为1μl。

[0046] 所得样品指纹图谱与标准指纹图谱比较，经计算，相似度不低于0.90。所得供试品指纹图谱至少包含17个特征峰和1个参照峰，各特征峰相对于参照峰(S)的相对保留时间的波动范围符合表1的规定：

[0047] 表1川芎挥发油包合物标准指纹图谱相对保留时间波动范围

[0048]

[0049] 注：S为参照峰

[0050] 5.方法学考察

[0051] (1)精密度试验

[0052] 取供试品溶液，连续进样6次，计算谱图的相似度，以考察仪器的精密度，测定结果经过计算相似度分别为0.992,0.997,0.994,0.982,0.976,0.989，RSD为0.80％，表明仪器的精密度良好。

[0053] (2)重现性试验

[0054] 取川芎挥发油包合物供试品6份，分别制备供试品溶液并按照选定的色谱条件进行检测，计算相似度，以考察制备方法的重复性，测定结果经过相似度计算分别为0.997,0.998,0.997,0.975,0.979,0.983，RSD为1.05％，表明重复性良好。

[0055] (3)稳定性试验

[0056] 取川芎挥发油包合物供试品溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h，24h进行检测，计算谱图相似度，以考察供试品的稳定性，结果表明，各供试品指纹图谱的相似度分别为0.976,0.985,0.987,0.982,0.991,0.972，RSD为0.72％，表明本供试品溶液在24h内稳定。

[0057] 6.10个批次川芎挥发油包合物供试品指纹图谱相似度评价

[0058] 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)对10个批次川芎挥发油包合物指纹图谱进行相似度计算，结果见表2。通过对10个不同批次川芎挥发油包合物的GC-MS图谱进行系统考察，发现各谱图峰12色谱峰的分离度好、含量高且稳定，理论塔板数不低于800000，因此选取峰12作为参照色谱峰(S)。

[0059] 表2川芎挥发油包合物供试品指纹图谱相似度计算结果

[0060]  S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 R
S1 1.000                    
S2 0.987 1.000                  
S3 0.789 0.797 1.000                
S4 0.665 0.677 0.859 1.000              
S5 0.704 0.709 0.866 0.984 1.000            
S6 0.982 0.988 0.740 0.945 0.996 1.000          
S7 0.796 0.801 0.995 0.844 0.841 0.738 1.000        
S8 0.261 0.267 0.407 0.393 0.966 0.304 0.345 1.000      
S9 0.425 0.422 0.599 0.406 0.997 0.445 0.546 0.793 1.000    
S10 0.959 0.976 0.818 0.729 0.767 0.972 0.808 0.927 0.963 1.000  
R* 0.925 0.931 0.928 0.937 0976 0.917 0.914 0.948 0.937 0.964 1.000

[0061] 表注：*R为标准指纹图谱；时间窗宽度0.2；全谱匹配参数为默认值。