一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法及应用。采用二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管AgNPS@MnO2@MWCNTs作为检测抗体标记物制备的电化学免疫传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点，对癌胚抗原CEA和甲胎蛋白AFP的检测具有重要的科学意义和应用价值。

权利要求

1.一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述传感器包括固定有肿瘤标志物一抗Ab1的经β-环糊精/多壁碳纳米管β-CD/MWCNTs修饰的电极和检测抗体孵化物AgNPS@MnO2 @MWCNTs/Ab2，所述传感器的制备，包括以下步骤：（1）β-环糊精/多壁碳纳米管β-CD/MWCNTs的制备

将10 ~ 20 mg的多壁碳纳米管和300 ~ 600 mg β-环糊精混合，在研钵中研磨8 ~ 12 min，并在这过程中逐滴加入无水乙醇；然后，再继续研磨2 h，获得均匀的黑色粉末；置于80 oC 干燥箱内干燥，制得β-环糊精/多壁碳纳米管β-CD/MWCNTs；

（2）二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管AgNPS@MnO2@MWCNTs的制备①将多壁碳纳米管置于质量分数为65 % 的硝酸中，25 oC 下搅拌24 h；然后，超纯水清洗三次，100 oC 干燥；

②0.15 ~ 0.3g 经过上述酸化过的多壁碳纳米管和80 ~ 160 mL、0.1 mol/L的高锰酸钾溶液混合，40 oC 搅拌2 h；逐滴加入20 ~ 40 mL、0.2 mol/L的硫酸锰溶液，40 oC 下继续搅拌21 h；用超纯水和无水乙醇分别清洗三次，放入120 oC的干燥箱里干燥6 h，制得MnO2@MWCNTs；

③30 ~ 60 mg 的MnO2@MWCNTs和30 ~ 60 mg的硝酸银分散在30~ 60 mL 超纯水中，室温下搅拌24 h，离心去掉上清液，再分散在超纯水中，逐滴加入50 mmol/L的硼氢化钠溶液，直至颜色不再变化，离心，干燥，得到二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管AgNPS@MnO2@MWCNTs；

（3）检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备在2 mL、2 ~ 4 mg/mL的检测抗体标记物二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管AgNPS@MnO2@MWCNTs溶液中，加入1 ~ 3 mL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液，4 oC下保存备用；

（4）固定有肿瘤标志物一抗Ab1的经β-环糊精/多壁碳纳米管β-CD/MWCNTs修饰的电极的制备①将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

②将6µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的β-环糊精/多壁碳纳米管滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

③继续将6 µL、5 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，

4 oC冰箱中干燥；

④继续将3 µL、质量分数为0.5~2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭 o

电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4 C冰箱中晾干。

2.如权利要求1所述的一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，所述肿瘤标志物选自AFP或CEA，检测步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，以所述传感器中的电极为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.59 ~ 8.02磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

说明书

一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫

传感器的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 肿瘤的发病率高，生长和转移速度快，对人类的健康有极大的危害。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞内或宿主体液中，其在临床上对于随原发肿瘤的发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。

[0003] AFP、CEA等常见的肿瘤标志物，对于肝癌的诊断都能起到一定的作用。对于肿瘤标志物的检测方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。

[0004] 夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原、抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。

[0005] 多壁碳纳米管具有大的比表面积，β-环糊精/多壁碳纳米管具有良好的导电性能，以及大的比表面积，能够很好的固载抗体，能够加速电子传递，对于提高传感器灵敏度具有重要作用。

发明内容

[0006] 本发明提供了一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法及应用，实现了对癌胚抗原CEA和甲胎蛋白AFP的的灵敏检测。

[0007] 本发明的目的之一是提供一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法。

[0008] 本发明的目的之二是将所制备的一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器，用于检测肿瘤标志物。

[0009] 本发明的技术方案，包括以下步骤：

[0010] 1. 一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备方法，所述的免疫传感器的制备，步骤如下：

[0011] （1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

[0012] （2）将6µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的β-环糊精/多壁碳纳米管滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

[0013] （3）继续将6 µL、5 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0014] （4）继续将3 µL、质量分数为0.5 ~ 2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1pg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0015] （5）将6 µL、1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器。

[0016] 2.所述的一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器，传感材料的制备方法，包括以下步骤：

[0017] （1）β-环糊精/多壁碳纳米管的制备，步骤如下：

[0018] 将10 ~ 20 mg的多壁碳纳米管和300 ~ 600 mg β-环糊精混合，在研钵中研磨8~12 min，并在这过程中逐滴加入无水乙醇；然后，再继续研磨2 h，获得均匀的黑色粉末；置o
于80 C 干燥箱内干燥，制得β-环糊精/多壁碳纳米管；

[0019] （2）检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0020] ① 二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管AgNPS@MnO2@MWCNTs的制备，步骤如下：

[0021] 将多壁碳纳米管置于质量分数为65 % 的硝酸中，25 oC 下搅拌24 h；然后，超纯水清洗三次，100 oC 干燥；

[0022] 0.15 ~ 0.3g 经过上述酸化过的多壁碳纳米管和80 ~ 160 mL、0.1 mol/L的高锰酸钾溶液混合，40 oC 搅拌2 h；逐滴加入20 ~ 40 mL、0.2 mol/L的硫酸锰溶液，40 oC 下继续搅拌21 h；用超纯水和无水乙醇分别清洗三次，放入120 oC的干燥箱里干燥6 h，制得MnO2@MWCNTs；

[0023] 30 ~ 60 mg 的MnO2@MWCNTs和30 ~ 60 mg的硝酸银分散在30~ 60 mL 超纯水中，室温下搅拌24 h，离心去掉上清液，在分散在超纯水中，逐滴加入50 mmol/L的硼氢化钠溶液，直至颜色不再变化，离心，干燥，得到AgNPS@MnO2@MWCNTs；

[0024] ② 检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0025] 在2 mL、2 ~ 4 mg/mL的检测抗体标记物AgNPS@MnO2@MWCNTs溶液中，加入1 ~ 3 mL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液，4℃下保存备用。

[0026] 一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：

[0027] （1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.59~ 8.02磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

[0028] （2）用计时电流法对肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；

[0029] （3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

[0030] 上述肿瘤标志物选自下列之一： AFP、CEA。

[0031] 本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

[0032] 本发明的有益成果

[0033] （1）本发明使用了β-环糊精/多壁碳纳米管为基底材料，β-环糊精/多壁碳纳米管具有大的比表面积，以及良好的导电能力，能够很好的固载一抗，并能加速电子的传递，对于实现传感器的高灵敏度以及低检测限具有重要意义；

[0034] （2）采用AgNPS@MnO2@MWCNTs作为检测抗体标记物，多壁碳纳米管具有大的比表面积以及良好的导电能力， MnO2和Ag NPS对过氧化氢有催化作用，AgNPS@MnO2@MWCNTs实现了信号的多重协同放大，因此提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；

[0035] （3）一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器对肿瘤标志物的检测，其线性范围1 pg/mL～10 ng/mL，检测限最低0.3 pg/mL，表明一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器可以达到准确测定的目的。

具体实施方式

[0036] 实施例1一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备，步骤如下：

[0037] （1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

[0038] （2）将6µL、1.0 mg/mL的β-环糊精/多壁碳纳米管滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

[0039] （3）继续将6 µL、5 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0040] （4）继续将3 µL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1pg/mL~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0041] （5）将6 µL、1 mg/mL的检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器。

[0042] 实施例2一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备，步骤如下：

[0043] （1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

[0044] （2）将6µL、2.0 mg/mL的β-环糊精/多壁碳纳米管滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

[0045] （3）继续将6 µL、8 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0046] （4）继续将3 µL、质量分数为1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1pg/mL~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0047] （5）将6 µL、2 mg/mL的检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器。

[0048] 实施例3一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器的制备，步骤如下：

[0049] （1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

[0050] （2）将6µL、3.0 mg/mL的β-环糊精/多壁碳纳米管滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

[0051] （3）继续将6 µL、12 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0052] （4）继续将3 µL、质量分数为2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、1pg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

[0053] （5）将6 µL、3 mg/mL的检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器。

[0054] 实施例4 β-环糊精/多壁碳纳米管的制备，步骤如下：

[0055] 将10 mg的多壁碳纳米管和600 mg β-环糊精混合，在研钵中研磨8 min，并在这过程中逐滴加入无水乙醇。然后，再继续研磨2 h，获得均匀的黑色粉末；置于80 oC 干燥箱内干燥，制得β-环糊精/多壁碳纳米管。

[0056] 实施例5 β-环糊精/多壁碳纳米管的制备，步骤如下：

[0057] 将15 mg的多壁碳纳米管和450 mg β-环糊精混合，在研钵中研磨10 min，并在这过程中逐滴加入无水乙醇。然后，再继续研磨2 h，获得均匀的黑色粉末；置于80 oC 干燥箱内干燥，制得β-环糊精/多壁碳纳米管。

[0058] 实施例6 β-环糊精/多壁碳纳米管的制备，步骤如下：

[0059] 将20 mg的多壁碳纳米管和300 mg β-环糊精混合，在研钵中研磨12 min，并在这过程中逐滴加入无水乙醇。然后，再继续研磨2 h，获得均匀的黑色粉末；置于80 oC 干燥箱内干燥，制得β-环糊精/多壁碳纳米管。

[0060] 实施例7检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0061] ①AgNPS@MnO2@MWCNTs的制备，步骤如下：

[0062] 将多壁碳纳米管置于质量分数为65 % 的硝酸中，25 oC 下搅拌24 h；然后，超纯水清洗三次，100 oC 干燥；

[0063] 0.15 g 经过上述酸化过的多壁碳纳米管和160 mL、0.1 mol/L的高锰酸钾溶液混合，40 oC 搅拌2 h；逐滴加入20 mL、0.2mol/L的硫酸锰溶液，40 oC 下继续搅拌21 h；用超纯水和无水乙醇分别清洗三次，放入120 oC的干燥箱里干燥6 h，制得MnO2@MWCNTs；

[0064] 30 mg 的MnO2@MWCNTs和30 mg的硝酸银分散在30 mL 超纯水中，室温下搅拌24 h，离心去掉上清液，在分散在超纯水中，逐滴加入50 mmol/L的硼氢化钠溶液，直至颜色不再变化，离心，干燥，得到AgNPS@MnO2@MWCNTs；

[0065] ②检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0066] 在2 mL、2 mg/mL的检测抗体标记物AgNPS@MnO2@MWCNTs溶液中，加入1 mL、8µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液，4℃下保存备用。

[0067] 实施例8检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0068] ①AgNPS@MnO2@MWCNTs的制备，步骤如下：

[0069] 将多壁碳纳米管置于质量分数为65 % 的硝酸中，25 oC 下搅拌24 h；然后，超纯o水清洗三次，100 C 干燥；

[0070] 0.2 g 经过上述酸化过的多壁碳纳米管和120 mL、0.1mol/L的高锰酸钾溶液混合，40 oC 搅拌2 h；逐滴加入30mL、0.2 mol/L的硫酸锰溶液，40 oC 下继续搅拌21 h；用超纯水和无水乙醇分别清洗三次，放入120 oC的干燥箱里干燥6 h，制得MnO2@MWCNTs；

[0071] 40 mg 的MnO2@MWCNTs和50 mg的硝酸银分散在40 mL 超纯水中，室温下搅拌24 h，离心去掉上清液，在分散在超纯水中，逐滴加入50 mmol/L的硼氢化钠溶液，直至颜色不再变化，离心，干燥，得到AgNPS@MnO2@MWCNTs；

[0072] ②检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0073] 在2 mL、3 mg/mL的检测抗体标记物AgNPS@MnO2@MWCNTs溶液中，加入2 mL、10 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液，4℃下保存备用。

[0074] 实施例9检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0075] ①AgNPS@MnO2@MWCNTs的制备，步骤如下：

[0076] 将多壁碳纳米管置于质量分数为65 % 的硝酸中，25 oC 下搅拌24 h；然后，超纯水清洗三次，100 oC 干燥；

[0077] 0.3g 经过上述酸化过的多壁碳纳米管和80 mL、0.1 mol/L的高锰酸钾溶液混合，40 oC 搅拌2 h；逐滴加入40 mL、0.2 mol/L的硫酸锰溶液，40 oC 下继续搅拌21 h；用超纯水和无水乙醇分别清洗三次，放入120 oC的干燥箱里干燥6 h，制得MnO2@MWCNTs；

[0078] 60 mg 的MnO2@MWCNTs和60 mg的硝酸银分散在60 mL 超纯水中，室温下搅拌24 h，离心去掉上清液，在分散在超纯水中，逐滴加入50 mmol/L的硼氢化钠溶液，直至颜色不再变化，离心，干燥，得到AgNPS@MnO2@MWCNTs；

[0079] ②检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液的制备，步骤如下：

[0080] 在2 mL、4 mg/mL的检测抗体标记物AgNPS@MnO2@MWCNTs溶液中，加入3 mL、12 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物AgNPS@MnO2@MWCNTs /Ab2溶液，4℃下保存备用。

[0081] 实施例10一种基于二氧化锰负载银纳米粒子多壁碳纳米管构建的免疫传感器用