高尔基体蛋白gp73乳胶增强免疫比浊检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明涉及高尔基体蛋白gp73乳胶增强免疫比浊检测试剂盒及其制备方法：提供了一种偶联有gp73抗体的乳胶微球，其制备方法为：a)用DCC催化N?羟基琥珀酰亚胺和粒径90?110nm的羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，24?26℃反应8?12min，离心去上清；b)取gp73抗体溶液预冷至4℃以下，加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，110?130瓦超声4?6min，3?5℃下反应25?35min；还提供了包含该乳胶微球的试剂盒。本发明制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球检测样本中gp73蛋白含量线性范围宽，灵敏度、精密度、准确度高，可重复性好，且操作简单，可用于临床相关疾病的诊断。

权利要求

1.一种偶联有gp73抗体的乳胶微球，其特征在于，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球为羧基聚苯乙烯乳胶微球，粒径为90-110nm；其制备方法为：a)用DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，所用的羧基聚苯乙烯乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、DCC的质量比为(0.09-0.12)∶(25-35)∶(55-65)，

24-26℃反应8-12min，然后离心去上清，得到活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球；

b)取gp73抗体溶液，预冷至4℃以下，然后加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，所述的gp73抗体溶液中含有的gp73抗体与所述的羧基聚苯乙烯乳胶微球的质量比为：(0.9-1.05)∶(0.09-0.12)，110-130瓦超声4-6min，3-5℃下反应25-35min。

2.根据权利要求1所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球，其特征在于，其制备方法为：a)用DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，所用的羧基聚苯乙烯乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、DCC的质量比为0.1∶30∶60，25℃反应10min，然后离心去上清，得到活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球；

b)取gp73抗体溶液，预冷至4℃以下，然后加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，所述的gp73抗体溶液中含有的gp73抗体与所述的羧基聚苯乙烯乳胶微球的质量比为：1∶0.1，120瓦超声5min，4℃下反应30min。

3.根据权利要求2所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球，其特征在于，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的粒径为100nm。

4.权利要求1-3任一所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球在制备检测样本中gp73蛋白含量的试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样本为血清、血浆、全血、组织裂解液或细胞裂解液。

6.权利要求1所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)用DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，所用的羧基聚苯乙烯乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、DCC的质量比为(0.09-0.12)∶(25-35)∶(55-65)，

24-26℃反应8-12min，然后离心去上清，得到活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球；

b)取gp73抗体溶液，预冷至4℃以下，然后加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，所述的gp73抗体溶液中含有的gp73抗体与所述的羧基聚苯乙烯乳胶微球的质量比为：(0.9-1.05)∶(0.09-0.12)，110-130瓦超声4-6min，3-5℃下反应25-35min。

7.一种gp73蛋白乳胶增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1-4任一所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球在试剂盒中以溶液形式存在，所述的溶液中偶联有gp73抗体的乳胶微球的固含量为0.1％-

0.3％，且所述的溶液中还含有200mM NaCl、5％体积浓度的甘油、0.05％体积浓度的ProClin 300、0.6％体积浓度的BSA和5％体积浓度的PEG6000。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含含有防腐剂、稳定剂的缓冲液，以及gp73蛋白标准品。

说明书

高尔基体蛋白gp73乳胶增强免疫比浊检测试剂盒及其制备

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医学免疫体外诊断技术领域，具体地说，涉及高尔基体蛋白gp73乳胶增强免疫比浊检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

[0002] 高尔基体蛋白gp73(gp73，Golm1，Golph2)是表观分子量73kD的高尔基体蛋白质。Furin蛋白酶能够识别gp73，切掉N端55个氨基酸(包含胞质区域、跨膜区和高尔基体内coiled-coil domain 10个氨基酸)，这使Golph2能够分泌到血液中(Traffic 2007；8:
1415-1423.)。

[0003] 急性和慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中的gp73含量较健康人显著增加。gp73对原发性肝癌的早期诊断的灵敏度、特异性和准确率分别达到72％、95％和86.2％(中国肿瘤临床,2013；v40,Issue(1)；29-31)，灵敏度、特异性和准确率皆高于常规肿瘤标志物AFP和CA199。gp73联合AFP和CA199可以大大提高肝癌早期诊断的临床意义。

[0004] 血清中gp73的含量还和肝硬化程度、肝纤维化程度、肝功能转氨酶、乙肝病毒载量存在一定程度上的正相关。所以gp73除了可以作为原发性肝癌的早期诊断指标，还可以辅助检测肝硬化和肝纤维化等疾病。

[0005] 除了和肝癌密切相关外，gp73在肾癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等癌症组织和癌旁组织中都有高表达。gp73是潜在的上述癌症尤其是前列腺癌的诊断指标。

[0006] 体液标志蛋白的检测方法主要采用免疫学方法，以酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、放射免疫测定(Radioimmunoassay，RIA)和胶体金层析法(俗称“金标”)这几种方法为主。ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。RIA灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。金标方法虽然稳定性较好，但灵敏度较低，只能定性，不能定量。特别是重复性差这一缺点限制了这些检测技术在临床上的应用，尤其不适合用于需要通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。因此，寻找更加稳定、准确的血浆蛋白定量检测方法一直是国际上近十年来的研究热点。

[0007] 胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种，一种是散射比浊检测法，另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。

[0008] 目前，PETIA检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。

[0009] 目前还未见利用PETIA法检测人体血清中高尔基体蛋白gp73的报道。

发明内容

[0010] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种偶联有gp73抗体的乳胶微球。

[0011] 本发明的再一的目的是，提供所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的用途。

[0012] 本发明的另一的目的是，提供所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备方法。

[0013] 本发明的第四个目的是，提供一种gp73蛋白乳胶增强免疫比浊检测试剂盒。

[0014] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

[0015] 一种偶联有gp73抗体的乳胶微球，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球为羧基聚苯乙烯乳胶微球，粒径为90-110nm。

[0016] 优选地，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备方法为：

[0017] a)用DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，所用的羧基聚苯乙烯乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、DCC的质量比为(0.09-0.12)∶(25-35)∶(55-65)，24-26℃反应8-12min，然后离心去上清，得到活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球；

[0018] b)取gp73抗体溶液，预冷至4℃以下，然后加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，所述的gp73抗体溶液中含有的gp73抗体与所述的羧基聚苯乙烯乳胶微球的质量比为：(0.9-1.05)∶(0.09-0.12)，110-130瓦超声4-6min，3-5℃下反应25-35min。

[0019] 更优选地，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备方法为：

[0020] a)用DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，所用的羧基聚苯乙烯乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、DCC的质量比为0.1∶30∶60，25℃反应10min，然后离心去上清，得到活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球；

[0021] b)取gp73抗体溶液，预冷至4℃以下，然后加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，所述的gp73抗体溶液中含有的gp73抗体与所述的羧基聚苯乙烯乳胶微球的质量比为：1∶0.1，120瓦超声5min，4℃下反应30min。

[0022] 优选地，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的粒径为100nm。

[0023] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

[0024] 如上任一所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球在制备检测样本中gp73蛋白含量的试剂中的应用。

[0025] 所述的样本为血清、血浆、全血、组织裂解液或细胞裂解液。

[0026] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

[0027] 如上所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：

[0028] a)用DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，所用的羧基聚苯乙烯乳胶微球、N-羟基琥珀酰亚胺、DCC的质量比为(0.09-0.12)∶(25-35)∶(55-65)，24-26℃反应8-12min，然后离心去上清，得到活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球；

[0029] b)取gp73抗体溶液，预冷至4℃以下，然后加入到步骤a)制备的活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，所述的gp73抗体溶液中含有的gp73抗体与所述的羧基聚苯乙烯乳胶微球的质量比为：(0.9-1.05)∶(0.09-0.12)，110-130瓦超声4-6min，3-5℃下反应25-35min。

[0030] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

[0031] 一种gp73蛋白乳胶增强免疫比浊检测试剂盒，所述的试剂盒包含如上任一所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球。

[0032] 优选地，所述的偶联有gp73抗体的乳胶微球在试剂盒中以溶液形式存在，所述的溶液中偶联有gp73抗体的乳胶微球的固含量为0.1％-0.3％，且所述的溶液中还含有200mM NaCl、5％体积浓度的甘油、0.05％体积浓度的ProClin 300、0.6％体积浓度的BSA和5％体积浓度的PEG6000。

[0033] 优选地，所述的试剂盒还包含含有防腐剂、稳定剂的缓冲液，以及gp73蛋白标准品。

[0034] 本发明优点在于：

[0035] 1、灵敏度高，检测限低至25ng/mL，且仍处在较好的线性范围内；

[0036] 2、准确度和精密度高，线性范围达到实际应用的要求；

[0037] 3、稳定性高，实验重复性好；

[0038] 4、可以应用于全自动生化仪，使用简单方便。

[0039] 由此可见，本发明的gp73乳胶增强免疫比浊检测试剂盒具有非常大的临床实用价值，可应用于急性、慢性肝炎诊断，肝癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等癌症辅助诊断，还可应用于肝癌、前列腺癌等术后评价或者肝移植、肾移植等器官移植术后病人身体状况监测。

附图说明

[0040] 图1是gp73标准品中gp73含量的数据拟合曲线。

[0041] 图2是26例人群样本的血清gp73含量检测结果。

具体实施方式

[0042] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0043] 实施例1 本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备(一)

[0044] 1、试剂制备及标准

[0045] 重组蛋白gp73制备：为采用无血清培养基，由CHO细胞分泌表达，表达的重组蛋白gp73(氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示)经过镍亲和层析和离子交换层析，目的蛋白在SDS-PAGE胶上为单一条带，纯度98％以上。

[0046] gp73抗体制备：为纯化的重组蛋白gp73免疫新西兰大白兔得到的多抗，血清效价经过琼脂糖扩散实验检测达到1:16，抗血清经过gp73抗原纯化。

[0047] 100nm羧基聚苯乙烯乳胶微球(SWA04)：购自浙江天科高新技术发展有限公司。

[0048] 其他试剂皆为国产分析纯或者达到生物级别。

[0049] 2、gp73抗体共价偶联到羧基聚苯乙烯乳胶微球上

[0050] 2.1羧基聚苯乙烯乳胶微球活化

[0051] 取1mg 100nm羧基聚苯乙烯乳胶微球(固含量10％)，4℃，20000rpm离心60min，去上清，加无水甲醇超声清洗，再20000rpm离心60min，去上清，重复3次。30mg N-羟基琥珀酰亚胺和60mg DCC溶于1mL甲醇中，然后加入到清洗后的0.1mg羧基聚苯乙烯乳胶微球中，25℃反应10min，DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，生成NHS活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球。4℃，20000rpm离心120min，去上清，重复2次。

[0052] 2.2抗体偶联

[0053] gp73抗体溶于PBS缓冲液，浓度为1mg/mL，冰水浴预冷至4℃以下。取1mL预冷的抗体溶液加入到步骤2.1活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，120瓦超声5min打散乳胶微球后，在4℃下，震荡反应30min，得到本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球。

[0054] 2.3偶联有gp73抗体的乳胶微球保存

[0055] 将制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球于4℃，20000rpm离心60min，去上清，加入含0.02％NaN3的PBS缓冲液。4℃保存。

[0056] 实施例2 本发明的gp73乳胶增强免疫比浊检测试剂盒

[0057] 试剂盒包括：试剂R1、试剂R2和gp73蛋白标准品。试剂R1为包含有防腐剂、稳定剂的缓冲液，主要用来稀释待检测的样品；试剂R2主要为偶联gp73抗体的乳胶微球；gp73蛋白标准品为重组蛋白gp73。样品或者标准品中的gp73蛋白经过试剂R1稀释，与试剂R2混合，gp73蛋白和gp73抗体作用，引起乳胶微球凝聚，从而导致溶液的光透射或者光散射强度发生改变，在一定范围内光透射强度或者光散射强度与gp73蛋白浓度线性相关。

[0058] 试剂R1、试剂R2和gp73标准品优选为：

[0059] 试剂R1的制备

[0060] 配置50mM，pH7.2的Tris-HCl缓冲液。补加NaCl、NaN3、Triton X-100、PEG6000至终浓度分别为：200mM、0.02％(w/v)、0.1％(v/v)、5％(w/v)。搅拌充分混匀后，用0.22μm的滤膜过滤。

[0061] 试剂R2的制备

[0062] 配置50mM，pH7.2的Tris-HCl缓冲液。补加NaCl、甘油、ProClin 300、BSA、PEG6000至终浓度分别为：200mM、5％(v/v)、0.05％(v/v)、0.6％(w/v)、5％(w/v)。搅拌充分混匀后，用0.22μm的滤膜过滤。最后添加实施例1制备的偶联gp73的乳胶微球至固含量0.2％。

[0063] gp73蛋白标准品的制备：

[0064] gp73蛋白标准品稀释液配置：在PBS缓冲液中添加BSA、NaN3、Triton X-100使其终浓度分别为：0.6％(w/v)、0.05％(v/v)、0.1％(v/v)。哺乳动物细胞重组表达的重组蛋白gp73用稀释液分别梯度稀释到625、125、25、5、1ng/mL。

[0065] 实施例3 本发明方法的灵敏度、精密度检测

[0066] 1、仪器

[0067] 日立全自动生化分析仪7080。

[0068] 2、操作方法

[0069] 设置取50μL标准品、100μL R1溶液和150μL R2溶液。检测波长设定为500nm，仪器用蒸馏水调零后，测定标准品5个梯度的吸光值，3次重复。3、结果

[0070] 数据拟合曲线见图1。从图中可以看出，本发明方法的灵敏度高，最低检出限低至25ng/mL，且仍处在较好的线性范围内；线性范围宽。

[0071] 实施例4 本发明方法的稳定性检测

[0072] 按照实施例1的方法重复制备5个批次的偶联有gp73抗体的乳胶微球，然后用于检测25ng/mL gp73蛋白标准品中的gp73含量。计算5个批次的偶联有gp73抗体的乳胶微球检测得到的gp73含量的方差，结果为0.67，表明本发明的方法其重复性好。

[0073] 实施例5 血清样本检测验证本发明方法的准确性

[0074] 收集健康人群26例样本，原发肝癌患者21例样本。检测条件同实施例3，数据分析结果见图2。从图中可以看出，检测结果与实际结果相符合，表明本发明方法的准确度高。

[0075]

[0076] 实施例6 本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备(二)

[0077] 1、试剂制备及标准

[0078] 重组蛋白gp73制备：同实施例1。

[0079] gp73抗体制备：同实施例1。

[0080] 90nm羧基聚苯乙烯乳胶微球：购自浙江天科高新技术发展有限公司。

[0081] 其他试剂皆为国产分析纯或者达到生物级别。

[0082] 2、gp73抗体共价偶联到羧基聚苯乙烯乳胶微球上

[0083] 2.1羧基聚苯乙烯乳胶微球活化

[0084] 取1mg 90nm羧基聚苯乙烯乳胶微球(固含量10％)，4℃，20000rpm离心60min，去上清，加无水甲醇超声清洗，再20000rpm离心60min，去上清，重复3次。25mg N-羟基琥珀酰亚胺和65mg DCC溶于1mL甲醇中，然后加入到清洗后的0.09mg羧基聚苯乙烯乳胶微球中，24℃反应12min，DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，生成NHS活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球。4℃，20000rpm离心120min，去上清，重复2次。

[0085] 2.2抗体偶联

[0086] gp73抗体溶于PBS缓冲液，浓度为0.9mg/mL，冰水浴预冷至4℃以下。取1mL预冷的抗体溶液加入到步骤2.1活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，110瓦超声6min打散乳胶微球后，在5℃下，震荡反应25min，得到本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球。

[0087] 2.3偶联有gp73抗体的乳胶微球保存

[0088] 将制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球于4℃，20000rpm离心60min，去上清，加入含0.02％NaN3的PBS缓冲液。4℃保存。

[0089] 实施例7 本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球的制备(三)

[0090] 1、试剂制备及标准

[0091] 重组蛋白gp73制备：同实施例1。

[0092] gp73抗体制备：同实施例1。

[0093] 110nm羧基聚苯乙烯乳胶微球：购自浙江天科高新技术发展有限公司。

[0094] 其他试剂皆为国产分析纯或者达到生物级别。

[0095] 2、gp73抗体共价偶联到羧基聚苯乙烯乳胶微球上

[0096] 2.1羧基聚苯乙烯乳胶微球活化

[0097] 取1mg 110nm羧基聚苯乙烯乳胶微球(固含量10％)，4℃，20000rpm离心60min，去上清，加无水甲醇超声清洗，再20000rpm离心60min，去上清，重复3次。35mg N-羟基琥珀酰亚胺和55mg DCC溶于1mL甲醇中，然后加入到清洗后的0.12mg羧基聚苯乙烯乳胶微球中，26℃反应8min，DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，生成NHS活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球。4℃，20000rpm离心120min，去上清，重复2次。

[0098] 2.2抗体偶联

[0099] gp73抗体溶于PBS缓冲液，浓度为1.05mg/mL，冰水浴预冷至4℃以下。取1mL预冷的抗体溶液加入到步骤2.1活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，130瓦超声4min打散乳胶微球后，在3℃下，震荡反应35min，得到本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球。

[0100] 2.3偶联有gp73抗体的乳胶微球保存

[0101] 将制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球于4℃，20000rpm离心60min，去上清，加入含0.02％NaN3的PBS缓冲液。4℃保存。

[0102] 对比例1

[0103] 按照实施例1的方法制备偶联有gp73抗体的乳胶微球，不同之处仅在于使用的是羧基聚甲基丙烯酸甲酯乳胶微球。

[0104] 对比例2

[0105] 1、试剂制备及标准

[0106] 重组蛋白gp73制备：同实施例1。

[0107] gp73抗体制备：同实施例1。

[0108] 110nm羧基聚苯乙烯乳胶微球：购自浙江天科高新技术发展有限公司。

[0109] 其他试剂皆为国产分析纯或者达到生物级别。

[0110] 2、gp73抗体共价偶联到羧基聚苯乙烯乳胶微球上

[0111] 2.1羧基聚苯乙烯乳胶微球活化

[0112] 取1mg 110nm羧基聚苯乙烯乳胶微球(固含量10％)，4℃，20 000rpm离心60min，去上清，加无水甲醇超声清洗，再20000rpm离心60min，去上清，重复3次。35mg N-羟基琥珀酰亚胺和55mg DCC溶于1mL甲醇中，然后加入到清洗后的0.12mg羧基聚苯乙烯乳胶微球中，26℃反应8min，DCC催化N-羟基琥珀酰亚胺和羧基聚苯乙烯乳胶微球上的羧基反应，生成NHS活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球。4℃，20 000rpm离心120min，去上清，重复2次。

[0113] 2.2抗体偶联

[0114] gp73抗体溶于PBS缓冲液，浓度为0.85mg/mL，冰水浴预冷至4℃以下。取1mL预冷的抗体溶液加入到步骤2.1活化的羧基聚苯乙烯乳胶微球中，130瓦超声4min打散乳胶微球后，在3℃下，震荡反应35min，得到本发明的偶联有gp73抗体的乳胶微球。

[0115] 2.3偶联有gp73抗体的乳胶微球保存

[0116] 将制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球于4℃，20 000rpm离心60min，去上清，加入含0.02％NaN3的PBS缓冲液。4℃保存。

[0117] 实施例8

[0118] 按照实施例3的方法检验实施例6-7、对比例1-2制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球用于检测标准品(gp73蛋白浓度分别为25、50、100、150、200、300、400ng/mL)gp73蛋白含量的灵敏度和精密度。

[0119] 结果显示：实施例6和7制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球最低检出限均为25ng/mL，处在较好的线性范围内，且线性范围宽，与实施例3结果基本一致。对比例1制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球最低检出限为100ng/mL，且所处的线性范围显著较差，整体线性范围较窄。对比例2制备的偶联有gp73抗体的乳胶微球最低检出限为50ng/mL，但所处的线性范围也显著较差，整体线性范围较窄。

[0120] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。