溶解存在于样品中的微生物、提取并提纯所述微生物的核酸以用于分析目的的自动化系统

摘要

本发明涉及用于从流体中收集微生物的装置和方法，其包括：包围珠子的反应模块；允许进入所述模块的至少一个流体入口导管；允许所述流体在穿过所述模块之后排出的至少一个流体出口导管；用于将珠子保持在所述模块中的装置；用于至少一种反应液体的至少一个入口通道；用于一种或多种液体的至少一个出口通道；流体入口和出口导管彼此面对并封闭所述模块，以便最大化流体与珠子之间的接触；用于一种或多种反应液体的通道被分别定位在模块的两个相反端处；并且，各反应液体通道被定位在一平面中，并且流体入口和出口导管被沿着一轴线定位，并且所述轴线大致垂直于所述平面。

权利要求

1.用于收集包含在流体(2)中的微生物(1)的装置，所述装置包括：·包含一组珠子(6)的反应模块(3)，

·至少一个流体(2)导入导管(40)，其允许流体流进入所述模块(3)，·至少一个流体(2)排出导管(41)，其允许已经通过所述模块(3)内部的所述流体流排出，·在所述模块(3)内的珠子(6)保持装置(9)，·至少一种反应液体(12)的至少一个导入通道(7)，·至少一种反应液体(12)的至少一个排出通道(8)，反应液体(12)的导入通道(7)和排出通道(8)与流体(2)的导入导管(40)和排出导管(41)在模块(3)水平处被定位如下：·用于导入和排出流体的导管(40和41)面对彼此并同时封闭模块(3)，以便最大化流体(2)和珠子(6)之间的接触，·用于一种或多种反应液体(12)的导入通道和排出通道分别被定位在模块(3)的两个相反端处，并且·用于一种或多种反应液体(12)的导入通道(7)和排出通道(8)被定位在一个平面中，且用于导入和排出流体的导管(40和41)被沿着一轴线定位，所述轴线粗略地垂直于所述平面。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，其包括将所述流体和所述反应液体与外部隔离的气密限制外壳(13)。

3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，如果所述流体为气体，那么所述一组珠子包括涂覆有甘油的珠子。

4.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，如果所述流体为液体，那么所述模块包含大体在由用于所述一种或多种反应液体的通道形成的平面中延伸的过滤器，导入导管被定位在过滤器的具有所述一组珠子的一侧上，同时排出导管被定位在所述过滤器的没有珠子的另一侧上。

5.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，如果按以下方式被切开的话，模块(3)具有“C”形状：·沿着由用于导入(7)和排出(8)反应液体的通道形成的平面，以及·垂直于由流体的导入导管和排出导管(40和41)形成的轴线。

6.如权利要求5所述的装置，其特征在于，如果沿着穿过所述“C”的中心并切穿所述“C”的半径被切开的话，所述模块具有四边形形状。

7.如权利要求5所述的装置，其特征在于，用于导入反应液体的一个或多个通道位于所述模块的形状“C”的一端处，并且用于排出反应液体的一个或多个通道位于所述“C”的另一端处。

8.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述珠子具有在200和600μm之间的直径，并且用于将所述珠子保持在所述模块内的装置包括栅格，所述栅格的孔具有小于所述珠子且在从100到500μm的范围内的直径。

9.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，其包括用于处理所收集的微生物的另一反应模块，所述模块包含：

1.用于分离不感兴趣的细胞残渣或抑制剂的装置，和/或

2.用于扩增所收集的并与所述抑制剂分离的核酸的装置，和/或

3.用于检测这样产生的扩增子的装置。

10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述细胞残渣是蛋白质或膜。

11.用于收集包含在流体中的微生物的方法，其特征在于，其包括：

1.经由至少一个流体导入导管引入被怀疑包含微生物的流体，

2.穿过珠子堆，微生物在所述珠子堆被固定住，

3.经由用于排出所述流体的至少一个流体排出导管排出已从中去除所述微生物的流体，

4.经由至少一个反应液体导入通道引入至少一种反应液体，

5.穿过微生物在那里被固定住的珠子堆，以便使所述微生物处于悬浮，以及

6.经由用于排出反应液体的至少一个通道排出运输微生物的该液体，流体导入导管和流体排出导管面对彼此并同时封闭所述珠子堆，用于导入和排出反应液体的通道被定位以便到达所有的珠子。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，当液体穿过所述珠子堆时，所述珠子通过外部搅动装置被搅动并形成接触，这使得溶解微生物的膜成为可能，从而使核酸可获取并易于被排出。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，对珠子的搅动利用超声波而实现。

14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于，载有微生物中的一些或全部的液体被排出到一反应模块以允许对所收集的微生物进行处理，所述处理包括：

1.分离不感兴趣的细胞残渣或抑制剂，和/或

2.扩增所收集的核酸，和/或

3.检测这样产生的扩增子。

15.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于：

1.所测试的流体包括气体，

2.所述气体穿过所述珠子堆，所述珠子涂覆有甘油，微生物在所述珠子堆处被固定住，以及

3.至少一种反应液体被引入以便溶解甘油并使所述微生物处于悬浮。

16.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于：

1.所测试的流体包括液体，

2.所测试的液体穿过所述珠子堆并且然后在被排出之前、在去除其包含的微生物之后穿过过滤器；微生物被固定住，以及

3.至少一种反应液体被引入以便使所述微生物处于悬浮。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，液体在经由用于排出反应液体的至少一个通道的排出的部位和用于除去抑制剂和/或用于扩增和/或用于检测的模块之间被过滤。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，液体在经由用于排出反应液体的至少一个通道的排出的部位和用于除去抑制剂和/或用于扩增和/或用于检测的模块之间被过滤。

19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞残渣是蛋白质或膜。

说明书

溶解存在于样品中的微生物、提取并提纯所述微生物的核酸

以用于分析目的的自动化系统

技术领域

[0001] 本发明的技术领域是生物学分析领域。更特别地，本发明首先涉及用于溶解存在于环境或临床样品中的微生物、用于提取并用于提纯所述微生物的核酸的装置。本发明还涉及用于溶解微生物、用于提取和提纯所述微生物的核酸以用于分析目的的自动化系统。

背景技术

[0002] 若干年来，在医院中的院内感染的发生率已有了相当可观的增长。这些感染被解释为由于就医人员的污染(这些人员因此为限定免疫抑制)，并由于存在于医院环境中且不管如何始终谨慎地进行设备和表面的消毒以及空气调节也无法消灭的致病微生物所致。考虑到这些越来越频繁的环境微生物污染的情况，用于改善和便于环境控制的装置和方法的开发已成为保健专业医生的主要挑战。

[0003] 且不说院内感染的问题，对环境状况的监控在近些年来在工业环境、特别是在食品工业和制药或化妆品工业中已经成为周期性发生的关注点。在食品工业中，我们熟悉产品的、或甚至原材料的致病微生物污染对于消费者的健康可能具有的灾害性后果。事实上，由于细菌(诸如李斯特菌属或沙门氏菌属中的那些)导致的有毒食品感染现在是屡见不鲜。对空气质量的监控在制药或化妆品工业的质量方法中也是关键过程。

[0004] 此外，这种监控必须符合曾经的需求增长水平，由于日益严格的规障。

[0005] 在对保健专业医生或制造者而言可得到的以用于执行环境监控的工具中，空气生物取样器(biosampler)是用于检测空气中的微生物的选择方案。这些装置在我们希望测量空气生物污染的地方被放置在合适的点处。它们通常包括连接到培养介质的空气取样器。由空气取样器收集的空气与培养介质形成接触；收集到的任何空气传播的微生物将被沉积在所述培养介质上。培养介质然后被回收并被放在炉中以促进微生物的生长。于是便可以通过传统的微生物技术来检测和识别所述微生物。

[0006] 然而，这些装置具有与所采用的技术相关的主要缺点。该缺点是获得分析结果所花费的时间。事实上，传统的微生物技术、尤其是细菌学的使用，包含等待细胞生长、或甚至在特定的培养介质上的再播步骤所必需的培育次数以允许识别。结果，当我们希望检测和识别是院内感染或食物中毒的原由的致病生物体时，为获得结果所花费的时间相对很长，或甚至太长。

[0007] 该类装置的另一个缺点是，尽管培养介质的使用使得在细菌的属和种之间进行区分成为可能，但其通常不能在同一个细菌种的菌株之间进行区分。现在，已知的是微生物的致病性可能取决于上述的菌株而显著改变。

[0008] 此外，该类装置具有其不允许检测能存活但不可栽培的空气传播的微生物的缺点。

[0009] 这些装置还具有养分表面随着收集的继续而干燥的缺点。

[0010] 此外，存在目的在于回收空气传播的粒子、尤其是微生物的装置。因而，文献GB-2254024描述了基于旋风效应原理的用于收集存在于空气中的粒子的装置。尽管这种装置证明适合于收集存在于空气中的粒子，包括微生物，但其还从未针对处理这样获得的样品进行调查，特别是针对执行意在被用于分析的遗传物质的提取方面。

[0011] 更一般地，在识别微生物和/或传送结果的速度方面最相关的技术，无论是对于临床样品还是环境样品而言，毫无疑问是分子诊断技术。这些技术，基于对微生物的遗传物质的分析，并且特别是对感兴趣的某些特定的序列的分析，使得能够在记录时间中获得对微生物的非常精确的识别，因为它们使得能够省略培养步骤。

[0012] 然而，这些技术的使用具有一定数量的限制，其中最重要的是存在于空气中的并因此可回收以用于执行分析的微生物的潜在有限的量。事实上，已知的是，环境样品，而且还有某些临床样品，在微生物方面是相对贫乏的。结果，从该原材料中获得的遗传物质的量很小。用来提取核酸的技术在产量方面的性能于是就成了至关重要的参数。

[0013] 此外，大部分用于溶解的微生物的现存的技术相对于所有微生物而言是不通用的和/或需要有资质的人员的干预以便执行手动步骤。

[0014] 文献WO-A-2005/038025描述了用于从特别是自空气中采样的微生物中提取核酸的方法。该方法包括采用三个不同的溶解方法，即化学溶解、热冲击溶解和机械溶解。如果这种方法使得能够毫无疑问地优化提取核酸的效率并因此增加可用的遗传物质的量以用于分析，那么情况仍然是该效率依然依赖于回收的微生物的量。现在，针对优化所述微生物的回收该文献中什么都没有描述。

[0015] 文献US-A-5,707,861描述了用于破坏活细胞诸如微生物的装置。该装置允许细胞利用玻璃珠子和由于在包含微生物的管与承载所述管的支撑件的孔之间的空间所致的振动效应两者被溶解。因此，这种装置使得能够优化细胞的溶解并因此优化遗传物质的提取。这种装置及其采用的方法具有与上面所述的那些装置同样的限制，即它们仍依赖于回收的微生物的量。此外，它们具有另外的缺点：需要随后的浓缩核酸的步骤以便使它们与细胞碎片分离。最后它们需要在浓缩步骤结束时手动地回收核酸。

[0016] 这些问题也出现在文献US-5,567,050中所描述的装置上。

[0017] 具有较高集成的系统也已被描述。因而，文献WO-A-2004/018704描述了一种用于收集空气中的微生物并识别它们装置，以及使用PCR(聚合酶链反应)扩增技术的相关的方法。该系统被特别地设计用于在邮件分类中心防止通过生物污染的暗杀企图。该系统包括沿着用于运输邮件的回路放置的空气采样装置，用于通过旋风效应筛选/分离粒子的装置，用于从液体样品中浓缩/回收粒子的装置，用于将样品的片段传递至来自加利福尼亚的Cepheid公司的GeneXpertTM PCR分析盒中的装置。该盒然后被手动地传递到一独立的自动化生物分析仪以用于识别从空气中收集的一种或多种微生物。

[0018] 尽管该系统解决了与上述的装置和方法有关的许多技术问题，然而其仍具有较多缺点。这些缺点中的第一个是用于在传递到分析盒之前进行样品处理(收集、分离、浓缩/回收)的系统相对复杂和昂贵。第二个缺点是所收集的微生物在液体样品中被回收，仅其一小部分被分析。这意味着存在没有回收所有的微生物并因此没有回收所有的核酸的相当大的风险，这极大地限制了分析的适用性。此外，不管其复杂性如何，该系统需要将该盒手动传递至GeneXpertTM自动化分析仪中。

[0019] 申请人已经提交了一项主要涉及盒的专利申请WO-A-2009/001010，所述盒合适于放置在空气采样装置内并适合于接纳用于回收核酸的装置，具有粗略的圆柱形状的所述盒包括微生物的保持区域，所述保持区域包括用于溶解微生物的装置。该发明还涉及用于收集空气传播的微生物的装置和用于溶解微生物的装置。

[0020] 申请人还提交了一项专利申请WO-A-2010/067019，该申请除了其它方面以外涉及用于收集空气传播的微生物的装置，所述装置包括：

[0021] ·空气采样模块，其包括：

[0022] i.包括空气导入导管的上部元件，所述空气导入导管允许空气流进入所述模块，所述导管在其基部处具有用于干扰空气流的装置，

[0023] ii.包括用于排出空气的装置的下部元件，其允许所产生的空气流排出，[0024] 所述上部和下部元件与彼此集成使得空气流能够在所述空气采样模块内被产生是可能的；

[0025] ·盒，其具有粗略的圆柱形状，其包括微生物的保持区域，所述保持区域包括用于溶解微生物的装置，所述盒被定位在所述空气采样模块内部。

[0026] 通过这两个新颖的方案，不可否认的是，该过程被改善为对于任选地处于植物性状态或呈孢子形式的大量的微生物而言(不论它们是细菌、病毒还是或真菌)具有通用的溶解、并对于环境样品和临床样品都有效。

[0027] 此外，有着相当高的微生物浓度，该系统与各种下游分析(诸如PCR，皿上划线，等)相容，并且机械溶解被集成。

[0028] 然而，当可能找到更优的方案时，满足于运行良好的系统并不是人类的本性。因此，在这两个例子中，收集仍受限于气态或液态流体的体积，该流体与回收介质(通常为培养介质)形成接触。流体流将始终在同一点上撞击该介质，这将导致：

[0029] ·要么所述介质在精确的点处饱和而其余部分未被使用，

[0030] ·要么该介质老化，因为其始终在同一个(些)点处被气体或液体撞击，这在气体的情况下导致介质表面的干燥并且在液体的情况下导致介质表面的液化。在这两种情况下并且特别是在琼脂干燥的情况下，捕获效率随着时间将会有非常明显的下降。

[0031] 此外，通过撞击的捕获方式对于具有小于1μm的直径的小粒子来说非常低效。另一个问题是存在一部分回收介质(具有甘油的珠子)被空气流挟带的风险。因此，流体的这种投射及其在所述介质上的反弹可能产生弹着点，这又是另一个污染的风险。

发明内容

[0032] 本发明的目的是提出一种解决了上述的缺点的设备。

[0033] 为此，本发明提出一种用于收集包含在流体中的微生物的装置，所述装置包括：

[0034] ·包含一组珠子的反应模块，

[0035] ·至少一个流体导入导管，其允许流体流进入所述模块，

[0036] ·至少一个用于排出流体的导管，其允许已经通过所述模块内部的所述流体流排出，

[0037] ·在所述模块内的珠子保持装置，

[0038] ·用于导入至少一种反应液体的至少一个通道，

[0039] ·用于排出至少一种反应液体的至少一个通道，

[0040] 用于导入和排出反应液体的通道与用于导入和排出流体的导管在模块水平处被定位如下：

[0041] ·用于导入和排出流体的导管面对彼此并同时封闭模块，以便最大化流体和珠子之间的接触，

[0042] ·用于一种或多种反应液体的通道分别被定位在模块的两个相反端处，并且[0043] ·用于一种或多种反应液体的通道被定位在一个平面中，且用于导入和排出流体的导管被沿着一轴线定位，所述轴线粗略地垂直于所述平面。

[0044] 根据第一实施方式，根据本发明的装置包括将所述流体和所述反应液体与外部隔离的气密限制外壳。

[0045] 根据该装置的第一实施方式，如果所述流体为气体，那么所述一组珠子包括涂覆有甘油的珠子。

[0046] 根据该装置的第二实施方式，如果所述流体为液体，那么所述模块包含大体在由用于所述一种或多种反应液体的通道形成的平面中延伸的过滤器，导入通道(一个或多个)被定位在过滤器的具有所述一组珠子的一侧上，并且排出通道(一个或多个)被定位在所述过滤器的没有珠子的另一侧上。这种布置因此允许流体与珠子形成接触并且然后循环通过过滤器，以便分离例如不感兴趣的任何细胞残渣或抑制剂，诸如蛋白质、膜。

[0047] 在特别的实施方式中，如果按以下方式被切开的话：

[0048] ·沿着由用于导入和排出反应液体的通道形成的平面，以及

[0049] ·垂直于由用于导入和排出流体的导管形成的轴线，

[0050] 所述模块的形状包括至少一个直线的部分和/或至少一个弧形的部分，它们被包括在两个端部之间。用于导入反应液体的通道(一个或多个)位于模块的一个端部处并且用于排出反应液体的通道(一个或多个)位于模块的另一个端部处，使得反应液体在当其被导入至反应液体导入通道(一个或多个)中的时刻和当其经由反应液体排出通道(一个或多个)被排出的时刻之间完全通过该珠子堆。根据该最后提到的实施方式或变型，模块具有四边形截面，如果其沿着以下平面被切开的话：所述平面与由用于导入和排出反应液体的通道形成的平面垂直、并沿着由用于导入和排出流体的导管形成的轴线经过。

[0051] 在特别的实施方式中，如果按以下方式被切开的话，所述模块具有“C”形状：

[0052] ·沿着由用于导入和排出反应液体的通道形成的平面，以及

[0053] ·垂直于由用于导入和排出流体的导管形成的轴线。

[0054] “C”形状包括至少一个弧形的部分，其对应于圆的圆周的一部分或连接两个点的抛物线的一部分。所述“C”的端部是所述模块的两个端部区域，使得用于导入反应液体的通道(一个或多个)位于模块的一个端部处并且用于排出反应液体的通道(一个或多个)位于模块的另一个端部处，反应液体在当其被导入至反应液体导入通道(一个或多个)中的时刻和当其经由反应液体排出通道(一个或多个)被排出的时刻之间完全通过该珠子堆。

[0055] 根据该最后提到的实施方式或变型，如果沿着穿过所述“C”的中心并切穿所述“C”的半径被切开的话，所述模块具有四边形形状。

[0056] 仍根据该最后提到的实施方式或变型，反应液体的导入通道(一个或多个)位于所述模块的形状“C”的一个端部处，并且反应液体的排出通道(一个或多个)位于所述“C”的另一端处。

[0057] 不管该实施方式或变型如何，所述珠子具有在200和600μm之间的直径，并且用于将所述珠子保持在所述模块内的装置包括栅格，所述栅格的孔具有小于所述珠子且在从100到500μm的范围内的直径。

[0058] 不管该实施方式或变型如何，其包括用于处理所收集的微生物的另一反应模块，所述模块包含：

[0059] ·用于分离不感兴趣的细胞残渣或抑制剂诸如蛋白质、膜的装置，和/或[0060] ·用于扩增所收集的并与所述抑制剂分离的核酸的装置，和/或

[0061] ·用于检测这样产生的扩增子的装置。

[0062] 本发明还涉及用于收集包含在流体中的微生物的方法，其包括：

[0063] ·经由至少一个流体导入导管引入被怀疑包含微生物的流体，

[0064] ·穿过珠子堆，微生物在所述珠子堆被固定住，

[0065] ·经由用于排出所述流体的至少一个导管排出已从中去除所述微生物的流体，[0066] ·经由至少一个反应液体导入通道引入至少一种反应液体，

[0067] ·穿过微生物在那里被固定住的珠子堆，以便使所述微生物处于悬浮，以及[0068] ·经由用于排出反应液体(一种或多种)的至少一个通道排出运输微生物的该液体，

[0069] 用于导入和排出流体的导管面对彼此并同时封闭所述珠子堆，用于导入和去除反应液体(一种或多种)的通道被定位以便到达所有的珠子。

[0070] 根据一个实施方式，当流体为气体时，珠子被涂覆有甘油。

[0071] 根据一个实施方式，当流体为液体时，珠子被涂覆有聚合物涂层。

[0072] 根据一个实施方式，当反应液体通过珠子堆时，所述珠子通过外部搅动装置被搅动并形成接触，这使得毁掉或破坏微生物的膜成为可能，从而使核酸可获取并易于被排出。

[0073] 根据一个实施方式，在溶解期间规定的量的反应液体被导入至反应液体导入通道(一个或多个)中并且未经由反应液体排出通道(一个或多个)被排出，使得微生物在规定的量的反应液体存在的情况下被溶解持续规定的时间。该时间优选在5和30分钟之间并且液体的该量优选在100μl和1ml之间，并且更优选为500μl。

[0074] 根据该实施方式的变型，珠子被利用超声波进行搅动。

[0075] 不管该实施方式或变型如何，载有微生物中的一些或全部的液体被排出到所述装置的另一反应模块，以允许对所收集的微生物进行处理，所述处理包括：

[0076] ·分离不感兴趣的细胞残渣或抑制剂，诸如蛋白质、膜，和/或

[0077] ·扩增所收集的核酸，和/或

[0078] ·检测这样产生的扩增子。

[0079] 不管该实施方式或变型如何，该方法的第一可能性的特征在于：

[0080] ·所测试的流体包括气体(例如空气)，

[0081] ·气体穿过珠子堆，所述珠子被涂覆有甘油，在该珠子堆处微生物被固定住，并且[0082] ·至少一种反应液体被引入以便溶解甘油并使所述微生物处于悬浮。

[0083] 不管该实施方式或变型如何，该方法的第二可能性的特征在于：

[0084] ·所测试的流体包括液体，

[0085] ·所测试的液体穿过珠子堆并且然后在被排出之前、在去除其包含的微生物之后穿过过滤器；微生物被固定住，以及

[0086] ·至少一种反应液体被引入以便使所述微生物处于悬浮。

[0087] 根据这两个可能性中的任一个，液体在经由用于排出反应液体的至少一个通道的排出的部位和用于除去抑制剂和/或用于扩增和/或用于检测的模块之间被过滤。

[0088] 流体样品意思是可能包含微生物的任何气态或液态样品。其可以是人类或动物来源的样品。该样品可以是，例如，尿，全血，血浆或任何其它体液或呼出的空气。该样品可以是食物来源，诸如饮料。其还可以是环境来源，诸如水或受限制的空气。此外，液体样品还可以是所谓的传递液体，其中包含在拭子型的(诸如由COPAN公司以“flocked SWABS”为名称销售的那些)表面采样装置上的任何微生物通过在所述传递液体中搅动所述拭子而被再悬浮。

[0089] 微生物来自包括细菌、病毒、酵母、霉菌、寄生虫的群。

[0090] 从中隔离出微生物的样品为环境来源的。因此，其可以是空气的或液体(诸如水)的样品；表面样品。样品也可以是临床来源的(即人类或动物来源的任何样品)，适合作为用于检测其并识别微生物(任选为致病的)的分析的目标。

[0091] 目标核酸的存在可以通过杂交反应的可视化而被检测到。杂交反应意思是在捕获的核酸和通过转录、逆转录或扩增步骤，例如NASBA型(为核酸序列依赖性扩增)或PCR，隔离的或产生的目标核酸之间的任何反应。

[0092] 核酸意思是寡核苷酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸、以及它们的衍生物。术语寡核苷酸表示至少两个核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它们两者)、优选至少五个、优选至少八个、以及甚至更优选至少十四个的序列，而无论它们是天然的还是改性的，其在合适的杂交条件下能够与至少部分互补的另一种寡核苷酸杂交。

[0093] 改性的核苷酸意思是例如包括改性基和/或包括在核苷酸间键的水平上和/或在骨架的水平上的改性的核苷酸。作为改性基的实例，我们可以提到肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤以及溴基-5-脱氧尿苷。

[0094] 为说明改性的核苷酸间键，我们可以提到硫代磷酸、N-氨基烷基磷酸酯、膦酸烷基酯以及烷基磷酸二酯键。

[0095] 阿尔法-寡核苷酸诸如在专利申请FR-A-2,607,507中描述的那些，LNA诸如在“Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，第8卷，第16期，1998年8月18日，第2219-2222页”中描述的硫代磷酸-LNA和2’-硫醇-LNA，以及作为“J.Am.Chem.Soc.(1992)，114，
1895-1897”M.Egholm等的论文的主题的PNA，都是包括骨架已被改性的核苷酸的寡核苷酸的实例。

[0096] 杂交反应的可视化可以通过任何检测装置(诸如直接或间接装置)而进行。

[0097] 在直接检测的情况下，即没有中间物标记，杂交反应通过细胞质基因共振或通过承载着导电性聚合物的电极上的循环伏安法而被观察到。

[0098] 在间接检测的情况下，即经由标记，该标记要么可以在目标核酸上直接进行，要么可以经由所述先前标记的核酸的特定结合伴侣进行。

[0099] 目标核酸的特定结合伴侣意思是能够结合到目标核酸的任何伴侣，并且作为实例我们可以提到核酸、寡核苷酸或多核苷酸和酶基底。

[0100] 标记意思是能够直接地或间接地产生可检测的信号的标志的定影。这些标志的非穷尽列表包括：通过例如电化学、比色法、荧光、发光而产生可检测的信号的酶，酶诸如辣根过氧化酶(HRP)，碱性磷酸酶(ALP)，贝塔-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；酶抑制剂；酶辅助因子；粒子诸如金粒子，磁性胶乳，脂质体；发色团诸如发光化合物，染料，放射性分子诸如32P，35S或125I，荧光分子诸如荧光素，罗丹明， 伞形酮，鲁米诺或藻青蛋白。在荧光的情况下，其可以是酶-基底反应的荧光产品，荧光团-猝灭剂组合，荧光的熄灭或基于荧光特性的任何其它系统。

[0101] 间接系统也可以被使用，例如经由另一个配位体/抗配位体对。配位体/抗配位体对是本领域的技术人员所公知的，并且我们可以提到例如下列对：生物素/抗生蛋白链菌素，糖/凝集素，多核苷酸/互补多核苷酸。在这种情况下，是配位体承载着结合剂。抗配位体可以是通过前面段落中所描述的标志可直接检测的或者可以本身是通过配位体/抗配位体可检测的。

[0102] 这些间接检测系统在某些条件下可以导致信号的放大。这种用于信号放大的技术是本领域的技术人员所公知的，并且可以参考申请人的早期专利申请FR-A-2781802和WO-A-95/08000或者参考论文“J.Histochem.Cytochem.45：481-491，1997”。

[0103] 对目标核酸的初步标记可以如下地进行：通过在末端处，随机地或特定地，由聚合酶、由激酶直接或间接并入标志或通过并入分子“内部”。

[0104] 目标分析物的特定结合伴侣的标记是本领域的技术人员所公知的，并且例如由Greg T.Hermanson在“Bioconjugate Techniques，1996，Academic Press Inc，525B Street，San Diego，CA92101USA”中进行描述。

[0105] 取决于所用成对物的标记的类型，例如利用酶，本领域的技术人员将增加试剂以用于标记的可视化。该步骤对应于开发。其被清洗缓冲剂的使用所领先，该清洗缓冲剂的使用使得能够去除分析物的或在反应中没有用的要素的片段(或者弱束缚地或者非特定地)，以便限制背景噪声。

附图说明

[0106] 根据本发明的装置的目的和优点将参照附图依据下列不以任何方式进行限制的实施例被更好地理解，图中：

[0107] 图1示出了根据本发明的特别实施方式的具有允许其起作用的所有元件的、用于收集和溶解微生物的卡或盒的分解顶视图。

[0108] 图2示出了形成根据图1中所示的本发明的实施方式的装置的核心的主卡的透视顶视图。

[0109] 图3示出了仍根据图1中所示的本发明的实施方式的主卡的透视仰视图。

[0110] 图4示出了图2的在珠子堆和栅格的水平上的细节，所述栅格将各珠子保持在与至少一个流体导入导管接触的平面中并允许捕获微生物。C形的模块的两个相反端被流体地连接到用于导入和排出反应液体的通道。

[0111] 图5A为主卡的过滤部分的流向图，当限制板被关闭时珠子存在于所述部分中。

[0112] 图5B为类似于图5A的流向图，但其中限制板是打开的。

[0113] 图6给出了来自图5B中的细节A，但其中流体在捕获珠子内的运动以及限制板的运动被凸显。

[0114] 图7与图6相同，但集中在限制板的新运动以及反应液体在捕获珠子内的运动的开始上。

[0115] 图8与图7相同并清楚地示出了流体在所述捕获珠子内的运动。

[0116] 图9与图8相同但强调了核酸的提取。

[0117] 图10A至10D示出了填充腔室的有效性，随着时间的推移微生物被保持装置保持在腔室中。

[0118] 图11示出了表明在根据本发明的装置内溶解的效率的曲线。

具体实施方式

[0119] 本发明涉及微生物收集装置1。图1示出了由申请人提出的一个实施方式的分解视图，其中微生物收集装置1在没有任何流体2或液体12存在的情况下被呈现。所述收集装置1基本上包括两个主要部分：主卡4，其相对于副卡5被定位在下部位置，所述副卡5处于上部位置中。主卡4为L形的，并且副卡5被结合在此“L”形状中以给出总体上呈平行六面体的形状。主卡4和副卡5意在被使得与彼此接触。以这种方式，它们将形成用于保持珠子6的装置9，该装置9基本上由出现在该“L”形状的水平部分中的腔构成，该腔9由与卡4接触的副卡5的底表面关闭。这两个卡，主卡4和副卡5，一旦被组装就形成反应模块3。然而，保持装置9并不只是包括该反应模块3的边缘而且还包括一个或多个栅格27(未示于图1中)，其允许流体
2或液体12通过但不允许珠子6(也未示出)离开反应模块3。在栅格27(示于图4中)上，栅格
27中的孔28的直径取决于使用的珠子6的直径。栅格27中的孔28必须具有比玻璃珠子的直径小的直径。在优选的实施方式中，栅格27中的孔28必须具有比玻璃珠子的直径显著小的直径，“显著”意味着例如珠子6具有从400到600μm的直径并且栅格27具有从200到250μm的孔28。

[0120] 两个卡4和5的组件以及用于导入和排出流体的导管40和41及用于导入和排出反应液体的通道7和8(示于图4中)，被利用气密的限制外壳13进行限制，所述限制外壳13在呈现于图1中的实施方式中包括一定数量的限制板。

[0121] 首先，在上部位置中，有两个顶板14和15。然后在下部位置中有两个底板16和17；板14和16特别是在分析区域26的流体通道的水平上提供对反应模块3的限制，该分析区域将在后面进行描述。然后有顶和底铁磁限制板15和17，它们就其本身而言被定位在所述反应模块3上方。

[0122] 在捕获步骤之后，板15和17被重定位以关闭消耗品(consumable)。只有微生物10保留在腔室9中。通道7和8然后被用来在超声波溶解步骤之前循环洗脱缓冲剂。

[0123] 应注意的是，顶板15和底板17具有铁磁性质，因为它们包围了定位在反应模块3四个拐角处以及在其中心处的一定数目的磁体21。磁体21一方面提供铁磁板15和17在O形圈密封件18上的压力，并且另一方面在捕获微生物之后提供气密性。这些板15和17提供了到各捕获珠子6的通路，并使得可以将存在于流体2中的微生物10捕获在珠子6上。板15和17在装置1的表面上在滑动件29上滑动，所述滑动件位于侧边上，并且在本例中它们具有燕尾形状。在完成空气采样后，所述板15和17通过沿着滑动件29滑动而被重定位到它们的初始位置。液体回路于是被关闭。在板上需要“夹持”力以便确保关闭的完美气密性。该力例如是铁磁性的，其具有作用在上述板的整个表面上的均匀压力的优点。

[0124] 在主卡4和副卡5与顶板15和底板17之间，气密性通过一组气密的O形圈密封件18得以确保。这些O形圈密封件18在上部位置中的数量是三个并在下部位置中的数量是三个，并且是同心的。当然，该数量不以任何方式进行限制，因为使用单一O形圈密封件可能也足够。此外，其它的密封装置存在于顶板14和底板16与装置1的其余部分之间。所采用的手段特别是利用粘合剂或双面胶将这些板中的每一个粘贴在主卡4上。类似地，副卡5被永久地粘贴在装置的本体4上。该粘贴被超声波地、通过激光或热地执行，其是永久的并且允许收集装置1的组装。

[0125] 应注意的是，主卡4包括在其中有通道的两个区域。首先是有存储区域，其在反应模块3近旁被标记为25。还有分析区域26，其在上面被提及。存在于区域25和26的水平上的各个通道允许整个卡的流体管理。存储区域25中的通道是用于存储反应液体12(洗脱缓冲剂)的贮存器。分析区域26中的通道是用于为分析而进行样品制备的流体通道。它们在卡的正面和背面上循环。荧光读取也发生在区域26中的通道中。因为这些区域25和26不是本发明的本质，它们将不进一步被描述。

[0126] 这些类型的通道和它们的功能在由申请人以2009年9月18日的法国优先权提交的在先专利申请WO-A-2011/033231中被更好地说明。读者请参考该专利申请以获得更全面的信息。

[0127] 在捕获微生物10之后，板15和17被再次关闭。来自腔室25的缓冲剂被送至捕获腔室9中以用于再悬浮微生物。然后超声波溶解通过在卡外部的装置而在该同一腔室9中进行。溶解产物然后经由分配器阀22(其在孔31中滑动)被共享，并通过泵活塞23(其在孔32中滑动)被送至区域26的通道中，以便为检测做准备和扩增核酸11。

[0128] 然而，应被理解的是，各个元件允许反应液体12通过分配器阀22、以及泵活塞23的干预而从隔室到隔室的流体管理和传递。这些泵活塞23中的三个在主卡4的左侧，且另外三个在该同一卡4的右侧。

[0129] 最后，为结束对图1的描述，要注意的是，在主卡4内还有干燥站24。这些站24位于分析区域26近旁，并且包含干燥剂以用于优化与该卡相集成的呈冻干试剂的珠子形式的试剂的存储，该冻干试剂的珠子也被称作“球丸”，其通过冻干法、通过干燥不然就通过冻结而获得。干燥剂不与球丸直接接触而是靠近这些球丸。这些球丸包含着核酸11的扩增所必需的试剂。

[0130] 分配器阀22控制收集装置1中的流体的分配。因此，有若干个位置，这些位置提供：

[0131] ·反应液体12的存储，

[0132] ·反应液体12到包含珠子6的腔室或保持装置9的传递(在捕获微生物10之后)，[0133] ·总体积120μl的溶解产物，或每通道20μl的溶解产物，到区域26的六个通道的传递。

[0134] 最后，泵活塞23类似于注射器并且在整个过程中允许吸入和传递反应液体12。它们的特别特征是它们在封闭的空气循环中(没有空气从外部吸入)起作用，尽管具有外部空气的吸入的较简单型式是可以想象的。该封闭容器的益处是最大避免了与外部的交流并且从而最大避免了从内部到外部以及反之的交叉污染的风险。

[0135] 在图1中可以看出，有弹簧板19用于锁定铁磁板15和17。该板19通过螺钉20被附装至反应模块3。这样，无意识地操纵这些可拆开的板应当是不可能的。该弹簧板19使得阻挡和防止铁磁板15和17的无意识的打开成为可能。

[0136] 图2示出了主卡4的更详细的视图。主卡4包括不同厚度的两个部分；在左侧厚度较大并且包括分析区域26。我们还注意到干燥站24的存在，以及用于接纳分配器阀22(其未在该图中示出)的孔31。最后还有用于将六个泵活塞23(其也未在该图中示出)接纳在主卡4内的六个孔32。在主卡4的具有小厚度的部分上，即在该图的右侧，在所述反应液体12已进行下列行为之后用于反应液体12的存储区域25的存在被注意到：

[0137] -再悬浮捕获的微生物10，

[0138] -通过经由该液体12对珠子6进行超声波搅动而提供溶解，

[0139] -运输感兴趣的生物，以及

[0140] -最后供应核酸11的扩增和检测所必要的反应混合物12。

[0141] 图3示出了副卡4。注意的是，在该部分上有用于接纳O形圈密封件18的位置以及用于接纳磁体21的位置33；密封件18和磁体21未在该图中示出。

[0142] 图4示出了图2的在珠子6的保持装置9以及通道7和8的水平上的细节的放大视图。C形模块的两个相反端被流体地连接到用于导入和排出反应液体的通道7和8。

[0143] 在本例中，装置9包括栅格27，其在图5A或5B中更清楚地被示出。注意的是，将栅格27的孔28分开的空间是小的；例如对于500μm的珠子，各孔具有从200到300μm的直径并且彼此分开200到300μm的空间，这导致流体2或液体12被迫进入该空间，这改善和增大了包含感兴趣的核酸的微生物之间的接触点，并且珠子6的表面允许更好地捕获所述核酸11。珠子6还被涂覆有进一步便于微生物在珠子表面上的附着的物质。在当所用的流体是气体的情况下该物质特别是甘油。这样，甘油的使用仅在收集气体(特别是空气)中的微生物的情况下起作用。在该情况下，空气经过甘油上方并且微生物被捕获在甘油上。甘油然后被反应缓冲剂12所溶解。如果细菌存在，那么它们然后将通过超声波被溶解在该缓冲剂中。当收集存在于水中的微生物时，甘油不起作用，其被水溶解，并且被驱使到卡外。为利用液体介质完成正确的操作，必须找到甘油的替代品，例如不溶于水但仅溶于特定的反应缓冲剂或者允许在该特定的缓冲剂中“盐析”的聚合物涂层，或者可以在珠子的下游增加过滤器使得流体在循环通过该过滤器之前与珠子接触。

[0144] 根据图5A和5B，在具有腔室或保持装置9的主卡4的水平上，注意的是，有被标记为40和41的两个导管。导管40允许流体2导入模块3中，所述流体2包含待捕获以用于随后的分析的细菌，而导管41允许该同一流体2排出至所述模块3的外部。当然，在导入和排出之间，流体2将被传递通过其中存在珠子6的模块3；正是在该水平上微生物的收集可以被执行。如果流体2经由导管40和41被引入和排出，那么反应液体12(其可以包括洗脱缓冲剂或其它缓冲剂)经由导入通道7(示于图4中)被引入模块3中，其也经由排出通道8(也示于图4中)从该同一模块3中被排出。

[0145] 事实上，该流体2(例如空气，但其也可以是不同于反应液体12的液体)与卡垂直地循环。其流过栅格27。

[0146] 图5至8给出了用于捕获微生物的规程的简化描述。

[0147] 图5A描述了根据本发明的装置1的在流体2的处理水平上的一部分，我们希望从该部分中提取微生物10，该部分中有：

[0148] ·存在于形成保持装置9的腔中的珠子6，

[0149] ·上部栅格和下部栅格27，其由若干个孔28穿孔，这些栅格将珠子6限制在装置1内并因此在卡4的保持装置9内，

[0150] ·用于限制的铁磁顶板15，

[0151] ·用于限制的铁磁底板17，板15和17未像用于限制的顶板和底板14和16那样被粘贴到卡4。

[0152] ·流体通道，其未在该图中示出。根据图5B，装置1或多或少地与图5A中的配置一致，但用于限制的铁磁顶板15和用于限制的铁磁底板17沿着F1被平移。这允许流体2依照F2传递并通过与用于一种或多种反应液体的通道(未示于该图中)垂直的运动而进入由栅格27保持在位的珠子6。该运动经由模块3内的流体2的导入导管40和排出导管41进行。

[0153] 图6示出了来自图5B的细节A。在该配置中，可拆开的限制板15和17依照F1被移开，并且流体2与栅格27的轴线垂直地循环。微生物10被捕获在保持装置9内的珠子6上。

[0154] 在图7中，可拆开的板15和17通过依照F3的滑动运动被返回到关闭位置。洗脱缓冲剂12经由导入通道7被引入腔室9中。其从珠子6分离微生物10。

[0155] 最后在图8中，一旦腔室9已满，就执行超声波溶解以便破坏微生物(例如细菌)10并释放核酸11。包含核酸11的溶解产物经由排出通道8被发送在各通道中，以用于通过再悬浮冻干试剂的珠子、通过光学检测等而准备扩增。

[0156] 因此该装置通过使空气流循环通过珠子6的堆使得将特别是来自空气的微生物10捕获在涂覆甘油的玻璃珠子上成为可能。通过干燥表面捕获微生物提供了许多优点，诸如：

[0157] ·在捕获期间没有介质的磨损(由于蒸发)，

[0158] ·在存储期间没有蒸发，

[0159] ·非常高的微生物浓度，

[0160] ·相对于平坦撞击表面的非常大地发展的捕获表面(由于微珠)，

[0161] ·捕获表面不会那么容易地饱和，捕获因此比在撞击系统中有效得多。

[0162] 此外，该装置被设计成：

[0163] ·提供大的平面外的表面面积以用于从流体中捕获微生物。

[0164] ·减少水头损失并且因此减少泵的总体尺寸；这样，在捕获空气传播的微生物期间，该装置被连接到通过捕获栅格27接受空气的泵。

[0165] ·由于捕获平面中的流体通道的使用，允许微生物在任何液体缓冲剂中仅通过吸液(pipetting)而被吸取；这样，在将微生物捕获在甘油上之后，可拆开的板15和17被再次关闭。再悬浮缓冲剂(存储在腔室25中)被迫进入包含珠子的腔室。微生物然后在甘油中被取走；甘油溶解在缓冲剂中，使得所捕获的微生物被释放。

[0166] ·整体溶解(特别是利用超声波)在用于收集微生物的消耗品或装置1中，[0167] ·获得高的捕获效率同时小的水头损失，因为空气越过涂覆甘油的珠子的堆(并且不是撞击到珠子的堆上)。

[0168] 捕获效率主要取决于珠子堆的厚度和这些珠子的尺寸，但在传送穿过珠子时进行捕获的情况下捕获效率显著较高，特别是对于1μm以下的粒子尺寸。该捕获模式提出了技术难点，诸如：

[0169] ·对水头损失的控制，

[0170] ·将珠子保持在捕获腔室中，

[0171] ·在缓冲剂中吸取微生物，

[0172] ·溶解。

[0173] 干捕获被执行而没有起泡或含水凝胶，随着时间过去(>4m3样品)没有效率损失。甘油的优点在于其不会干透。因此，所采样的空气的体积可以非常大，而没有显著的效率损失。

[0174] 在含水表面(琼脂，培养皿)或含水液体(Coriolis型)上捕获的系统具有随着捕获的进行而干透的缺点。该干燥导致捕获效率的下降。在一种规定的液体中捕获决定了在收集的下游所执行的分析的种类，而利用干捕获的话微生物可以在任何缓冲剂中被吸取。

[0175] 此外，在干燥表面(玻璃珠子+甘油)上捕获允许微生物在非常小体积的缓冲剂(小于1mL或甚至小于100μL)中被释放。增大微生物浓度的优点在于其促进了对它们的检测。在分子生物学中用于检测的系统具有每微升(μL)1个基因组当量的级别的检测极限。

[0176] 对于常规的装置，当捕获体积是15mL(稀释了微生物的大体积)时，因此必须捕获大得多的量(从15到30倍大，即从200到600μL)的微生物。

[0177] 机械溶解是非常有效的并且与所有类型的生物学方法相容，诸如在该规程的后续步骤所需的任何缓冲剂中的超声波溶解。

[0178] 所捕获的微生物的溶解被集成在该装置中。该溶解技术是纯机械的(与化学溶解相对比)并且因此确保了卓越的溶解产量，而不管所选的溶解缓冲剂和待溶解的微生物如何。

[0179] 因此可以按原样使用溶解产物，并然后执行扩增，例如NASBA或PCR。

[0180] 根据由本发明提出的装置1的优选用途，在微生物10已被溶解并且核酸11已在反应液体或洗脱缓冲剂12中被吸取之后，收集装置1使得执行所述已提取的核酸11的扩增以及检测成为可能。为此目的，主要有四个步骤在溶解之后被执行。

[0181] 第一步骤包括提取包含核酸11以及一定数量的微生物10残渣30的缓冲剂12，这些残渣在溶解之后存在于液体12中，这些残渣随后在将在分析区域26的水平上进行的分析中不被考虑。在该第一步骤中，载有核酸11和残渣30的液体12将经由排出通道8从保持装置9中排出。在排出通道8的水平上，例如可以具有仅允许具有小于或等于提取的核酸的尺寸的生物学成分通过的过滤器。

[0182] 在第二步骤中，该混合物被发送至用于获得等分试样的区域34中，如在图2中清楚地示出。这样获得的体积相当于120μl。

[0183] 该等分试样然后被发送到标记为35的溶解产物分离区域中的第三步骤。该图中，有从彼此完全区分开的六个区域以允许在区域26的分析通道中分离成20μl的六倍。在区域26的这些通道中，扩增借助于被定位在中间区域36中的用于扩增的试剂(诸如核苷酸)、扩增引物和检测探针被执行。从图3可以看出，存在位于主卡4正面上的第二中间区域37，其包含至少一种酶(如果执行PCR的话为一种酶，如果执行TMA的话为两种，并且如果执行NASBA的话为三种)。

[0184] 第四且最后的步骤发生在区域26的通道的水平上，如在图3中清楚地示出的，在中间区域37的右边，检测可以在这里被执行。

[0185] 因此所有的这些运动都借助于分配器阀22和泵活塞23被执行，分配器阀22和泵活塞23通过它们的滑动运动(未示于图中)使得将液体从各个区域引导到将允许核酸11的扩增及其随后的检测的其它区域成为可能。分配器阀22和泵活塞23分别具有密封件38和39(清楚地示于图1中)，它们确保了系统的气密性。

[0186] 实施例1：根据珠子尺寸和珠子堆厚度的微生物捕获效率(利用粒子计数器)[0187] 对于同一个装置，这里是用于根据珠子尺寸和珠子堆厚度的捕获效率的规程。

[0188] 1.A.过程：

[0189] 滑动板15和17在贯穿实验的过程中是打开的。

[0190] 对于该实验，使用粒子计数器，其估算每立方米(m3)的吸入空气中粒子的量。检测到的粒子以在0.3μm，0.5μm，1μm和5μm之间的不同的尺寸范畴被分类。

[0191] 三个测量周期被执行：

[0192] 1：不使用该装置的空白标准(Blank reference)测量。

[0193] 2：在粒子计数器的上游使用该装置的估算测量。

[0194] 3：第二标准测量。

[0195] 1.B.实验：

[0196] 空白标准测量被平均。捕获效率作为使用和不使用该装置的测量值的比值被计算出。

[0197] 结果在下面在表1中被示出：

[0198]

[0199] 表1：根据珠子尺寸和珠子堆厚度的微生物捕获效率(按％)(利用粒子计数器)[0200] 1.C.分析：

[0201] 对于同一个装置1，表1表明，相对于包括在该PCT文献中所描述装置的现有技术而言，捕获效率是非常有效的，不管珠子尺寸和该珠子堆的厚度如何。小于0.5μm的粒子看来未给出足够的产量，然而其仍远高于该现有技术(最小18％的产量对0)。对于在0.5和5μm之间的尺寸而言，其结果是良好的(始终在65％以上，并且甚至，如果我们排除65％的那个案例的话，始终在85％以上)。所测试的该珠子堆的所有的厚度都是可接受的。

[0202] 实施例2：每个所测试装置的水头损失的优化：

[0203] 2.A.过程：

[0204] 每个装置被放置在测试台上，该测试台允许水头损失根据空气流速被测量。目标是找到装置1的捕获效率与其水头损失之间的最佳折衷。高水头损失意味着采样装置的高耗电量(对于便携式应用来说是不利的)。

[0205] 2.B.实验：

[0206] 表2为用于辅助设计该捕获微生物用的装置的表。其将粒子捕获效率(按尺寸范围：0.5-1μm，1-5μm，5-25μm)与装置的水头损失(mbar)进行比较。泵送一定体积的空气通过该装置所需要的能量与水头损失(对于同一个流速)成比例。对于具有便携式泵的应用而言，找到捕获效率和水头损失之间的良好折衷是有必要的(见表2)。

[0207]

[0208] 表2：根据珠子尺寸和该珠子堆的厚度的按粒子尺寸范围的微生物捕获效率和所测试的(在50L/min时)装置的水头损失

[0209] 2.C.分析：

[0210] 根据该表并与构成现有技术的专利申请WO-A-2009/001010相比较，可以看出，根据本发明的装置，不管该珠子堆的厚度和所用的珠子的直径如何，始终给出优于由该现有技术提出的方案的性能。此外，对于等同的水头损失，在从425到600μm的珠子和1.5mm的堆厚度时，结果比专利WO-A-2009/001010的装置在用于捕获粒子方面是最为高效的。

[0211] 实施例3：填充和清空装置：

[0212] 3.A.过程：

[0213] 仅珠子6的腔室9被测试。珠子腔室(充满珠子但没有液体)的入口被连接到流体连接器和吸液管。液体被迫进入珠子腔室中直至其被填满。一旦被填充，其就以相同的方式被清空。

[0214] 3.B.实验：

[0215] 图10A到10D示出了在其中捕获微生物10的腔室9的填充。500μL在导入通道7的水平上被注入并且200μL在排出通道8的水平上被回收。

[0216] 3.C.结果：

[0217] 填充完美地发生。

[0218] 实施例4：微生物的溶解：

[0219] 4.A.过程：

[0220] 包括溶解腔室的装置1被填充有包含表皮葡萄球菌的缓冲剂12。装置经由超声焊极而受到超声波，以便溶解微生物。实验以0、1、5和10分钟的溶解时间被重复。溶解产量通过培养皿上的溶解产物的增长和计数而被估算。该实验的目标是找到用于在溶解步骤中传递超声波的合适界面。

[0221] 4.B.实验：

[0222] 关于图11，珠子腔室装置的同一个设计与下面的一些界面配置一起被使用，即：

[0223] 第一配置：具有替换铁磁板15和17的塑料元件(超声焊极与根据本发明的修改后的装置直接接触)，

[0224] 第二配置：具有一层硅酮(存在于超声焊极和根据本发明的装置之间)，[0225] 第三配置：具有增加到该装置的充当铁磁板15和17的金属元件。

[0226] 这三个装置如前面那样并且针对两种类型的珠子直径被测试(见表3)。

[0227]

[0228] 表3：超声波溶解的效率

[0229] 4.C.结果：

[0230] 结果对所执行的所有测试来说都相当好。然而，使用金属插入件的方案对于两种类型的珠子给出了或多或少相同的好结果。

[0231] 实施例5：没有对微生物(表皮葡萄球菌)提纯的情况下的溶解和NASBA扩增：

[0232] 5.A.过程：

[0233] 装置被填充有包含表皮葡萄球菌的缓冲剂以及包括与所测试的细菌不同的细菌的内部控制装置。溶解是在根据实施例4中描述的第三配置的装置中被执行。溶解产物然后从装置中被移除并被分析。

[0234] 5.B.实验：

[0235] 检测曲线在下面呈现于表4和5中。

[0236]

[0237]

[0238] 该实验示出了所描述的装置用于溶解微生物和通过NASBA分析来检测它们的效率。微生物在实验之前被注入缓冲剂12中(在每次实验中不同浓度的微生物)。卡的金属垂片被关闭。包含珠子的那部分被填充有缓冲剂12(其包含各种浓度的微生物)。该装置被放置在超声波探针上以执行溶解。在溶解步骤结束时，缓冲剂12被手动地收集并离开该卡通过NASBA被分析。这些结果将与一控制范围进行比较。

[0239] 根据第一目的，对结果的解释是二元的：阳性表示检测到微生物并且阴性表示微生物未被检测到。

[0240] 5.C.分析：

[0241] 从上面的表中可以看出，所测试的样品对于0.2CFU/μl以上的所有浓度都被记为阳性。

[0242] 参考符号

[0243] 1.用于收集微生物10的装置

[0244] 2.流体

[0245] 3.反应模块

[0246] 4.主卡

[0247] 5.副卡

[0248] 6.珠子

[0249] 7.模块3的反应液体12导入通道

[0250] 8.用于从模块3排出反应液体12的通道

[0251] 9.模块3内的珠子6保持装置

[0252] 10.存在于流体2中的微生物

[0253] 11.存在于微生物10中的核酸

[0254] 12.反应液体

[0255] 13.包括板14至17的气密限制外壳

[0256] 14.用于限制装置1的顶板

[0257] 15.用于限制装置1的滑动铁磁顶板

[0258] 16.用于限制装置1的底板

[0259] 17.用于限制装置1的滑动铁磁底板

[0260] 18.外壳13与卡4和5之间的气密O形圈密封件

[0261] 19.用于锁定铁磁板15和17的弹簧板

[0262] 20.弹簧板19的固定螺钉

[0263] 21.磁体

[0264] 22.分配器阀

[0265] 23.泵活塞

[0266] 24.干燥站

[0267] 25.反应液体12的存储区域

[0268] 26.卡的正面和背面上的分析区域

[0269] 27.上部和下部栅格

[0270] 28.栅格27中的孔

[0271] 29.滑动件

[0272] 30.在溶解之后存在于液体12中的微生物残渣

[0273] 31.用于接纳分配器阀22的孔

[0274] 32.用于接纳泵活塞23的孔

[0275] 33.卡4和5的接纳磁体21的通孔

[0276] 34.等分试样的区域

[0277] 35.分离区域

[0278] 36.包含酶的第一中间区域

[0279] 37.包含酶的第二中间区域

[0280] 38.分配器阀22上的密封件

[0281] 39.泵活塞23上的密封件

[0282] 40.模块3内的流体2导入导管

[0283] 41.模块3内的用于去除流体2的导管

[0284] F1.铁磁顶板15和铁磁底板17的允许打开以便流体2通过的滑动运动[0285] F2.流体2通过珠子6的运动

[0286] F3.铁磁顶板15和铁磁底板17的允许关闭以便液体12通过的滑动运动[0287] F4.液体12通过珠子6的运动

[0288] F5.核酸11的提取