一种酒瓶兰组织培养快速繁殖方法

摘要

一种酒瓶兰组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)以消毒过的酒瓶兰种子作外植体，置于MS发芽培养基中进行诱导发芽得到无菌试管苗；(2)将所述试管苗置于MS丛芽培养基中进行繁殖培养获得丛生芽；(3)将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中培养获得健壮植株；(4)将所述健壮植株置于1/2MS生根培养基中培养获得生根苗；(5)取生根苗进行炼苗，并移植于沙床生长一个月，再移栽到大田。采用本发明所述的繁殖方法得到的丛生芽增殖系数为20～30倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上，有效解决了酒瓶兰工厂化育苗的问题。

权利要求

1.一种酒瓶兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)外植体的选择与消毒：取酒瓶兰的种子作外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5分钟，线状自来水冲洗15～20分钟，添加2～3滴吐温-20的100mg/L0.1％升汞消毒8～10分钟，无菌水冲洗3～5次，最后用消毒滤纸去除表面水份，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；

(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)获得的外植体接种到MS丛芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养35天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中，MS丛芽培养基为MS基本培养基中加入GA3赤霉素0.1～0.5mg/L，

30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

(3)试管苗丛生芽快速扩繁培养：将步骤(2)得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，获得无菌试管苗丛生芽，其中，MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入TDZ 0.1～1.0mg/L，KT0.1～0.5mg/L，IBA0.1～1.0mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在温度为

22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到健壮植株，其中，MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入6～BA 0.5～1.5mg/L，NAA 0.1～0.5mg/L，

30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

(5)健壮植株生根培养：将步骤(4)得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基培养，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到带根完整植株，其中，1/2MS生根培养基为MS基本培养基中加入0.1～1.0mg/L NAA，0.1～0.5mg/L ABT生根粉，15g/L蔗糖，5g/L琼脂，培养基pH为6.0；

(6)炼苗与移栽：组培瓶中加入少量自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽到大田。

说明书

一种酒瓶兰组织培养快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种酒瓶兰组织培养快速繁殖方法。

背景技术

[0002] 酒瓶兰(NolinarecurvataLem)为原产墨西哥西北部干燥炎热地区、龙舌兰科诺林那属小乔木状多肉草本植物。诺林那属植物只有2-3种，在植物分类系统中地位较突出，因其繁殖相对困难，不易普及，故而被视为珍稀植物。酒瓶兰茎干直立，下部肥大，形似酒瓶；叶片姿态婆娑，酷似幽兰，故雅称酒瓶兰。由于它姿态妩媚、奇特，喜阳又耐阴，大的植株除在植物园供展览外，还可以布置在宾馆及其他场所；小的植株配上造型合适的花盆，装饰会议室、办公室和居室，十分雅致，富有浓厚的热带气息，呈现出一种奇特的异国情调，是一种特别适于热带地区绿化和美化的园林观赏植物。此外，酒瓶兰叶片中还含有大量甾体皂苷，具有重要的天然药物开发价值(Eskander等,2011)。但是，酒瓶兰繁殖困难，制约了其市场需求与快速推广。生长多年的植株有时会在茎基部自然萌生小芽(4龄以下者又无侧枝)，可用于扦插繁殖，但繁殖系数低，并较难长成酒瓶状茎干，所以，主要靠种子繁殖(黄献胜，
2001；邓国富，2002)。但龙舌兰科植物开花很晚，采收种子不易，国内栽培酒瓶兰不易结籽，种子多由国外进口，价格昂贵；且酒瓶兰需5龄左右才能开花，繁殖速度极慢(李意颖，1996；
林云甲，2009；凌勇坚与姜宝东，2013)。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种酒瓶兰组织培养快速地繁殖方法，它能够有效快速地提高酒瓶兰种苗繁殖速度和质量，实现酒瓶兰优质种苗的工厂化育苗，满足市场需求。

[0004] 本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种酒瓶兰组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0005] (1)外植体的选择与消毒：取酒瓶兰的种子作外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5分钟，线状自来水冲洗15～20分钟，添加2～3滴吐温-20的100mg/L0.1％升汞消毒8～10分钟，无菌水冲洗3～5次，最后用消毒滤纸去除表面水份，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；

[0006] (2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)获得的外植体接种到MS发芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养35天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中，MS发芽培养基为MS基本培养基中加入GA3赤霉素0.1～0.5mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0007] (3)试管苗丛生芽快速扩繁培养：将步骤(2)得到的无菌试管苗置于MS丛芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，获得无菌试管苗丛生芽，其中，MS丛芽培养基为MS基本培养基中加入TDZ 0.1～1.0mg/L，KT0.1～0.5mg/L，IBA0.1～1.0mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0008] (4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到健壮植株，其中，MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入6～BA 0.5～1.5mg/L，NAA 0.1～0.5mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0009] (5)健壮植株生根培养：将步骤(4)得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基培养，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到带根完整植株，其中，1/2MS生根培养基为MS基本培养基中加入0.1～1.0mg/LNAA，0.1～0.5mg/LABT生根粉，15g/L蔗糖，5g/L琼脂，培养基pH为6.0；

[0010] (6)炼苗与移栽：组培瓶中加入少量自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽到大田。

[0011] 本发明突出的优点在于：

[0012] (1)对酒瓶兰进行组织培养，快速获得丛生芽，在短时间内培育出大量适合移栽的酒瓶兰种苗，显著提高了酒瓶兰种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足市场上的需求。

[0013] 在MS发芽诱导培养中，添加0.1～0.5mg/L GA3，可以打破酒瓶兰种子休眠。

[0014] 在MS繁殖培养基中添加的TDZ、KT和IBA属于常见植物生长调节剂，比较便宜易得，可大大降低酒瓶兰组织培养中的成本消耗，达到降低成本的目的。

[0015] 在MS繁殖培养基中添加TDZ 0.1～1.0mg/L，KT 0.1～0.5mg/L可促进丛生芽分化，IBA0.1～1.0mg/L，可促进丛生芽生长。

[0016] 在MS壮苗培养基添加NAA 0.1～0.5mg/L，可促进丛生芽长高展叶。

[0017] (2)在生根培养基中添加0.1～0.5mg/L ABT生根粉0.1～1.0mg/L NAA，可获得带根完整植株，这些完整植株经炼苗后可直接移栽于沙床。

[0018] (3)采用本技术方案培养所得到的酒瓶兰组培苗增殖系数达到20～30倍，获得组培苗生根率在95％以上，移栽苗床成活率在90％以上，有效解决了酒瓶兰工厂化育苗的问题。

具体实施方式

[0019] 下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

[0020] 实施例1

[0021] 本发明所述的酒瓶兰组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0022] (1)外植体的选择与消毒：取酒瓶兰的种子作外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5分钟，线状自来水冲洗15～20分钟，添加2～3滴吐温-20的100mg/L0.1％升汞消毒8～10分钟，无菌水冲洗3～5次，最后用消毒滤纸去除表面水份，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；

[0023] (2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)获得的外植体接种到MS发芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养35天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中，MS发芽培养基为MS基本培养基中加入GA3赤霉素0.5mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0024] (3)试管苗丛生芽快速扩繁培养：将步骤(2)得到的无菌试管苗置于MS丛芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，获得无菌试管苗丛生芽，其中，MS丛芽培养基为MS基本培养基中加入TDZ 1.0mg/L，KT 0.5mg/L，IBA 0.5mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0025] (4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到健壮植株，其中，MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入6～BA 1.0mg/L，NAA 0.3mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0026] (5)健壮植株生根培养：将步骤(4)得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基培养，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到带根完整植株，其中，1/2MS生根培养基为MS基本培养基中加入1.0mg/L NAA，0.5mg/L ABT生根粉，15g/L蔗糖，5g/L琼脂，培养基pH为6.0；

[0027] (6)炼苗与移栽：组培瓶中加入少量自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽到大田。

[0028] 实施例2

[0029] 本发明所述的酒瓶兰组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0030] (1)外植体的选择与消毒：取酒瓶兰的种子作外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5分钟，线状自来水冲洗15～20分钟，添加2～3滴吐温-20的100mg/L0.1％升汞消毒8～10分钟，无菌水冲洗3～5次，最后用消毒滤纸去除表面水份，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；

[0031] (2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)获得的外植体接种到MS发芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养35天，种子发芽后获得无菌试管苗，其中，MS发芽培养基为MS基本培养基中加入GA3赤霉素0.5mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0032] (3)试管苗丛生芽快速扩繁培养：将步骤(2)得到的无菌试管苗置于MS丛芽培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，获得无菌试管苗丛生芽，其中，MS丛芽培养基为MS基本培养基中加入TDZ 1.0mg/L，KT 0.3mg/L，IBA 0.5mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0033] (4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到健壮植株，其中，MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入6～BA 1.5mg/L，NAA 0.3mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L琼脂，培养基的pH为6.0；

[0034] (5)健壮植株生根培养：将步骤(4)得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基培养，在温度为22～26度，光照强度1500lux，光照时间为8～10小时/天的条件下培养30天，得到带根完整植株，其中，1/2MS生根培养基为MS基本培养基中加入0.8mg/L NAA，0.5mg/L ABT生根粉，5g/L琼脂，培养基pH为6.0；

[0035] (6)炼苗与移栽：组培瓶中加入少量自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽到大田。

[0036] 实施例3

[0037] 本发明所述的酒瓶兰组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0038] (1)外植体的选择与消毒：取酒瓶兰的种子作外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸