预防贾第虫病的二价DNA疫苗及其肠溶制剂

摘要

本发明公开了一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其中将贾第虫的两种抗原基因α1-giardin和CWP-2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，将所述重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌构成本发明的二价DNA疫苗。本发明创造性地提出分别针对滋养体和包囊两个阶段联合应用的抗贾第虫病二价DNA疫苗，实现了抑制滋养体的形成从而阻断致病以及抑制包囊的形成从而切断传播，克服了以往疫苗研发中疫苗作用单一的缺点。本发明的二价DNA疫苗本发明还实现了稳定性传代和保护性的持续。本发明还公开了一种定量包含所述二价DNA疫苗的肠溶制剂及其制备方法。

权利要求

1.一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其特征在于，将贾第虫的两种抗原基因α1-giardin和CWP-2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，将所述重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌构成所述二价DNA疫苗，其中所述抗原基因α1-giardin为SEQ ID NO：1序列，所述抗原基因CWP-2为SEQ ID NO：3序列；

所述二价DNA疫苗通过以下步骤制备：

(1)以贾第虫的cDNA作为模板，分别通过聚合酶链反应扩增获得α1-giardin和CWP-2基因片段；

(2)将所述基因片段插入载体pVAX1的HindIII和BamHI位点之间，产生pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2重组质粒；

(3)将步骤2中的重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中，得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，两种重组菌等比例混合后，即得到所述二价DNA疫苗；

其中，聚合酶链反应扩增中使用的引物如下：

α1-giardin的引物：

α1-G-F1:CC AAGCTT ATGCCGAAGGTCACCGACAT，其为SEQ ID NO：5序列；

α1-G-R2:CG GGATCC CTTCACGCGCCAGAGGGTGC，其为SEQ ID NO：6序列；

CWP-2的引物：

Gl-CWP2-F5:CC AAGCTT AGGCAGACAGTAGTCCGC，其为SEQ ID NO：7序列；

Gl-CWP2-R5:CG GGATCC CCTTCTGCGGACAATAGGCTTG，其为SEQ ID NO：8序列。

2.如权利要求1所述的用于预防人或动物贾第虫病的二价疫苗，其特征在于，所述宿主菌是减毒沙门菌。

3.一种用于预防人或动物贾第虫病的肠溶制剂，其特征在于，所述肠溶制剂包含如权利要求1所述的用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗。

4.如权利要求3所述的用于预防人或动物贾第虫病的肠溶制剂，其特征在于，所述肠溶制剂是定量配制的，使得每份肠溶制剂包含基本相同量的所述二价DNA疫苗的重组菌。

5.如权利要求4所述的用于预防人或动物贾第虫病的肠溶制剂，其特征在于，所述肠溶制剂通过包括以下步骤的方法制备：

1)对所述二价DNA疫苗的重组菌进行扩增培养得到培养物；

2)将步骤1)中得到的培养物离心后进行冻干得到冻干粉；

3)在步骤2)得到的冻干粉中混入定量辅料并研磨均匀得到研磨粉；

4)称取步骤3)得到的研磨粉进行定量压片，确保每片制剂含有基本相同量的重组菌；

5)将步骤4)得到的片剂用肠溶包衣剂进行包衣。

6.如权利要求5所述的用于预防人或动物贾第虫病的肠溶制剂，其特征在于，所述肠溶制剂通过包括以下步骤的方法制备：

1)扩增培养：将所述二价DNA疫苗的重组菌进行扩增培养得到经扩增的培养物；

2)冻干：将所述培养物离心，向离心沉淀中加入冻干保护剂，冻干24h，得到冻干粉，所述冻干保护剂包含5％脱脂奶粉和2.5％蔗糖；

3)研磨：在所述冻干粉中混入定量辅料，研匀得到研磨粉，所述辅料选自微晶纤维素、淀粉、微分散硅胶、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁；

4)压片：称取定量研磨粉，根据细菌重组菌活力检测结果进行定量压片，确保每片含有

0.2～5×105个重组菌；

5)包衣：称取适量欧巴代，高速搅拌下加入蒸馏水中，制成浓度为20％的混悬液，继续搅拌2h，得包衣液，包衣机转数调节为40-50r/min，加入制备好的片剂，调节喷枪液-气比例，包衣至片剂增重6-8％；

6)包装。

说明书

预防贾第虫病的二价DNA疫苗及其肠溶制剂

技术领域

[0001] 本发明涉及疫苗领域，具体涉及预防人和动物贾第虫病的二价DNA疫苗及其肠溶制剂。

背景技术

[0002] 蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia，简称贾第虫)为人体致病性原虫，可导致腹泻、营养吸收不良综合症及儿童生长障碍。全世界每年出现约50万新感染病例，在艾滋病患者中感染率极高(大约有20％-50％)，已被世界卫生组织列为全世界危害人类健康的十种主要寄生虫病之一。此外，贾第虫可感染40多种动物，为典型的人畜共患病，是危害我国畜牧业发展的重要寄生虫之一。

[0003] 贾第虫的生活史包括滋养体(trophozoite)和包囊(cyst)两个发育阶段，以及出囊和成囊两个过程。滋养体为虫体的营养和繁殖期(或致病期)，当人和某些哺乳动物食入包囊，其在小肠内出囊形成滋养体并寄生于此，导致以腹泻和消化不良为主的蓝氏贾第鞭毛虫病(Giardiasis，简称贾第虫病)。包囊为静止期(或感染期)，由滋养体在结肠内分泌囊壁物质形成(成囊)，之后随宿主粪便排出体外，经口感染新的宿主，平均每10个包囊就可以导致宿主感染，在宿主小肠内脱囊形成滋养体而致病。

[0004] 目前，临床上治疗贾第虫病的首选药物是甲硝唑(metronidazole)。该药虽有较好的疗效，但也有显著的不良反应，最常见的是胃肠道反应，严重者可出现消化道大出血；部分患者还可出现神经系统症状，血液系统反应，甚至心肌炎。另外，因其对胎儿的致畸作用，而为孕妇所禁忌。上述不良反应极大地限制了甲硝唑在本病治疗中的应用。此外，贾第虫感染多呈慢性，患者病程长，该药用量大，疗程长。在长期药物治疗过程中，作为本虫致病阶段的滋养体因耐药而形成具有传播作用的包囊。包囊的囊壁厚实具有保护作用，甲硝唑分子难以穿透囊壁，丧失了对包囊的杀伤作用，无法阻断贾第虫病的传播。

[0005] 抗贾第虫疫苗的研发是控制贾第虫传播和致病的重要手段。目前抗贾第虫疫苗的研发尚处于初级阶段，以贾第虫滋养体的粗蛋白提取物作为免疫原的兽用疫苗是唯一商品化的抗贾第虫疫苗产品。然而，该产品不能控制动物包囊的排出，因而不能切断传播途径。

[0006] α-giardin是定位于贾第虫滋养体浆膜表面的一组胶连蛋白(Annexin)，在贾第虫包囊向滋养体转化(出囊)及滋养体的感染粘附过程中发挥重要作用。其中α1-giardin是分子量最小的α-giardin，只含有Annexin的核心结构，具有很强的免疫原性，在感染初期产生，存在于整个感染过程中，可以作为血清学诊断的标记性分子。此外，α1-giardin在不同的贾第虫致病株之间相对保守，包括序列同源性(氨基酸同源性为97％)和结构同源性，且其保护性作用并不依赖抗体的产生。贾第虫的CWP-2是贾第虫包囊囊壁的主要成分蛋白，在贾第虫滋养体成囊过程中，由滋养体分泌产生并渗入囊壁。

[0007] 本发明创造性地提出分别针对滋养体和包囊两个阶段联合应用的二价疫苗，以实现抑制滋养体的形成从而阻断致病以及抑制包囊的形成从而切断传播。本发明采用α1-giardin(α1-贾第素)和CWP-2(cyst wall protein-2，囊壁蛋白)分别作为二价疫苗中抗贾第虫滋养体感染和抑制贾第虫成囊的抗原。

[0008] 许多人或动物的病原体感染发生在黏膜部位或由黏膜入侵。黏膜免疫系统是机体抗感染的第一道免疫屏障。在消化道、呼吸道和生殖系统等器官表面都覆盖着一层黏膜，能将机体的内环境和外界分隔，有效地将致病因子和对机体有害的物质阻断。黏膜内免疫细胞占机体内所有免疫细胞的80％，在机体的免疫保护中占有非常重要的地位。对于贾第虫等肠道寄生原虫，主要刺激肠黏膜产生分泌型IgA(sIgA)抗体，通过黏膜免疫途径可能会大大提高免疫接种的效果。同时就研制阻断贾第虫病传播的兽用疫苗而言，以饵料或饲料饲喂的免疫途径，通过有效控制病畜的感染达到控制贾第虫病的目的，发展口服疫苗显然是一种简单有效的途径。目前，通过饵料或饲料喂食途径的各种兽用疫苗普遍存在的问题在于很难保障动物喂食的量。

[0009] 本发明利用贾第虫α1-giardin和CWP-2的抗原表位，构建二价疫苗，以减毒沙门菌SL7207作为转运载体，定量制备肠溶制剂，经肠道使动物获得有效的特异性抗贾第虫感染和传播免疫。

发明内容

[0010] 本发明针对现有技术中存在的上述问题，提出有效的抗贾第虫疫苗应该包含两个主要指标，即阻断致病和切断传播。据此，本发明提出采用分别针对滋养体和包囊两个阶段的两种疫苗分子联合应用的二价疫苗，从而实现抑制滋养体的形成从而阻断致病以及抑制包囊的形成从而切断传播。

[0011] 本发明的一个目的在于提供一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，该疫苗能够同时阻断致病和切断传播。

[0012] 本发明的另一个目的在于提供一种包含所述二价DNA疫苗的肠溶制剂。

[0013] 本发明的再一个目的在于提供一种包含定量疫苗的肠溶制剂，以实现二价疫苗肠溶制剂的口服定量免疫。

[0014] 在本发明的第一方面，本发明提供一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其特征在于，将贾第虫的两种抗原基因α1-giardin和CWP-2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，将所述重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌构成所述二价DNA疫苗，其中所述抗原基因α1-giardin为SEQ ID NO：1序列，所述抗原基因CWP-2为SEQ ID NO：3序列。

[0015] 在一个优选实施方案中，所述二价DNA疫苗通过以下步骤制备：

[0016] (1)以贾第虫的cDNA作为模板，分别通过聚合酶链反应扩增获得α1-giardin和CWP-2基因片段，

[0017] (2)将所述基因片段插入载体pVAX1的HindIII和BamHI位点之间，产生pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2重组质粒；

[0018] (3)将步骤2中的重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中，得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌等比例混合后即得到所述二价DNA疫苗，

[0019] 其中，聚合酶链反应扩增中使用的引物如下：

[0020] α1-giardin的引物：

[0021] α1-G-F1:CC AAGCTT ATGCCGAAGGTCACCGACAT(HindIII)

[0022] α1-G-R2:CG GGATCC CTTCACGCGCCAGAGGGTGC(BamHI)

[0023] CWP-2的引物：

[0024] Gl-CWP2-F5:CC AAGCTT AGGCAGACAGTAGTCCGC(HindIII)

[0025] Gl-CWP2-R5:CG GGATCC CCTTCTGCGGACAATAGGCTTG(BamHI)。

[0026] 在一个优选实施方案中，所述宿主菌是减毒沙门菌，即减毒沙门菌SL7207。

[0027] 在本发明的另一方面，本发明还提供一种用于预防人或动物贾第虫病的肠溶制剂，所述肠溶制剂包含第一方面所述的用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗。

[0028] 优选地，所述肠溶制剂是定量配制的，使得每份肠溶制剂包含基本相同量的所述二价DNA疫苗的重组菌。

[0029] 在一个优选实施方案中，所述肠溶制剂通过包括以下步骤的方法制备：

[0030] 1)对所述二价DNA疫苗的重组菌进行扩增培养得到培养物；

[0031] 2)将步骤1)中得到的培养物离心后进行冻干得到冻干粉；

[0032] 3)在步骤2)得到的冻干粉中混入定量辅料并研磨均匀得到研磨粉；

[0033] 4)称取步骤3)得到的研磨粉进行定量压片，确保每片制剂含有相同数量的重组菌；

[0034] 5)将步骤4)得到的片剂用肠溶包衣剂进行包衣。

[0035] 在另一个优选实施方案中，所述肠溶制剂通过包括以下步骤的方法制备：

[0036] 1)扩增培养：将所述二价DNA疫苗的重组菌进行扩增培养得到经扩增的培养物；

[0037] 2)冻干：将所述培养物离心，向离心沉淀中加入冻干保护剂，冻干得到冻干粉，所述冻干保护剂包含5％脱脂奶粉和2.5％蔗糖；

[0038] 3)研磨：在冻干粉中混入定量辅料，研匀得到研磨粉，所述辅料选自微晶纤维素、淀粉、微分散硅胶、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁；

[0039] 4)压片：称取定量研磨粉，根据细菌重组菌活力检测结果进行定量压片，确保每片含有相同量的0.2～5×105个重组菌；

[0040] 5)包衣：称取适量欧巴代，高速搅拌下加入蒸馏水中，制成浓度为20％的混悬液，继续搅拌2h，得包衣液，包衣机转数调节为40-50r/min，加入制备好的片剂，调节喷枪液-气比例，包衣至片剂增重6-8％；

[0041] 6)包装。

[0042] 本发明的有益效果：

[0043] 1.贾第虫感染和传播过程中，成囊和出囊是两个重要的环节。本发明创造性地提出利用在成囊和出囊阶段的特定抗原表位构建二价DNA疫苗，从而能够有效地控制贾第虫感染和贾第虫病的传播，克服了以往疫苗研发中疫苗作用单一的缺点。

[0044] 2.CWP-2是贾第虫重要的囊壁蛋白，在贾第虫成囊的过程中必不可少，以往的研究表明其具有减少成囊率的作用。但是由于其对宿主菌具有一定的毒性，很难达到稳定性传代。本研究通过对CWP-2表位的分析，筛选出一段具有125个氨基酸序列的抗原表位，实验证明该表位不仅具有很好的抗原性，同时消除了对宿主菌的损伤，实现了稳定性传代和保护性的持续。

[0045] 3.本发明采用肠溶制剂的形式，实现定量免疫，同时对现有的肠溶疫苗制剂的生产工艺进行了改进，省去了可能影响疫苗活性的干燥等步骤，将携带有疫苗分子的载体菌活疫苗加工成肠溶制剂，进行定量免疫。具有给药快捷，安全有效，易于大规模生产等优点，具有较好的应用前景。

附图说明

[0046] 图1示出本发明的重组减毒沙门氏菌(二价疫苗)在体外传代培养后的稳定性实验结果；

[0047] 图2示出本发明的重组减毒沙门氏菌在体外传代培养后经荧光免疫检测的实验结果；

[0048] 图3示出本发明的重组减毒沙门氏菌免疫小鼠后，小鼠血清抗体IgG效价的变化；

[0049] 图4示出本发明的重组减毒沙门氏菌免疫小鼠后，小鼠肠道冲洗液中总SIgA含量变化；

[0050] 图5示出本发明的重组减毒沙门氏菌免疫小鼠后7周，小鼠肠道冲洗液中抗α1-giardin和CWP-2特异性SIgA的含量；

[0051] 图6示出本发明的重组减毒沙门氏菌在小鼠肠系膜淋巴结的目的蛋白表达结果。

具体实施方式

[0052] 以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

[0053] 实施例1

[0054] 重组原核表达载体pET41a-α1-giardin和pET41a-CWP-2的构建及鉴定[0055] (1)根据Genbank数据库中α1-giardin的基因测序，设计合成特异性引物，并在序列两端引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，在酶切位点两端皆引入保护性碱基GC。

[0056] α1-giardin的引物：

[0057] α1-G-F1:CC AAGCTT ATGCCGAAGGTCACCGACAT(HindIII)

[0058] α1-G-R2:CG GGATCC CTTCACGCGCCAGAGGGTGC(BamHI)

[0059] (2)根据Genbank数据库贾第虫CWP2的基因序列，对其所编码的抗原表位进行分析，筛选出一段含有125个氨基酸的表位。设计特异性引物，同时在序列两端引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，在酶切位点两端皆引入保护性碱基GC。

[0060] CWP-2的引物：

[0061] Gl-CWP2-F5:CC AAGCTT AGGCAGACAGTAGTCCGC(HindIII)

[0062] Gl-CWP2-R5:CG GGATCC CCTTCTGCGGACAATAGGCTTG(BamHI)。

[0063] (3)以贾第虫的cDNA作为模板，进行RT-PCR扩增得到目的片段，经酶切后与同样经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后的pET41a载体片段相连接，构建重组质粒pET41a-α1-giardin和pET41a-CWP-2，转化E.coli DH5a，挑取阳性克隆。经测序鉴定正确的重组子转入E.coli BL21。

[0064] (4)小量表达实验：分别从pET41a-α1-giardin/BL21和pET41a-CWP-2/BL21抗生素选择性平板上挑取单菌落放入5ml含卡那霉素(30mg/ml)的LB培养液中，一式两份。37℃，200rpm，振摇培养过夜；次日，检测培养物的分光光度值(OD600)，取适量的菌液，接种2ml新鲜的含有30mg/ml卡那霉素的LB培养基，使OD值为0.2，继续在37℃，250rpm，快速振摇培养至OD600≈0.6。加入IPTG至终浓度为1mM，37℃,200rpm,诱导表达4h。通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，并进行可溶性分析。

[0065] α1-giardin的氨基酸序列为SEQ ID NO：2序列；CWP-2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4序列。

[0066] 实施例2

[0067] 重组α1-giardin和CWP-2在大肠杆菌中的大量表达与纯化，特异性抗体的制备[0068] (1)扩大表达体系：从pET41a-α1-giardin/BL21和pET41a-CWP-2/BL21的平板上挑取单菌落放入50ml含卡那霉素的LB培养液中。37℃，200rpm，振摇培养过夜；次日，分别取25ml过夜培养的菌液接种两个装有1L LB(含卡那霉素30μg/ml)的4L锥形瓶中。37℃，
250rpm，快速振摇培养至OD600≈0.6。加入IPTG至终浓度为1mM，在30℃，250rpm，诱导表达
5h；离心收集菌体沉淀，超声裂解，收集上清(可溶性表达)，采用His-tag亲和层析柱进行目的蛋白纯化。

[0069] (2)特异性多克隆抗体制备：取20只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，分别用20μg/0.1ml的抗原(rα1-giardin和rCWP-2)加等量的完全弗氏佐剂(CFA)背部多点皮下注射。隔周用不完全弗氏佐剂(IFA)与重组蛋白混合，以同样剂量加强，共加强两次。于末次免疫后10天，摘眼球取血，采集的血液置室温中凝固2～3h后，3000rpm，4℃离心10分钟；再取上清，3000rpm，4℃离心10分钟。收集血清并分装。–80℃保存。

[0070] 实施例3

[0071] 重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2的构建

[0072] (1)根据Genbank数据库中α1-giardin的基因测序，设计合成特异性引物，并在序列两端引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，在酶切位点两端皆引入保护性碱基GC。

[0073] α1-giardin的引物：

[0074] α1-G-F1:CC AAGCTT ATGCCGAAGGTCACCGACAT(HindIII)

[0075] α1-G-R2:CG GGATCC CTTCACGCGCCAGAGGGTGC(BamHI)

[0076] (2)根据Genbank数据库贾第虫CWP2的基因序列，对其所编码的抗原表位进行分析，筛选出一段含有125个氨基酸的表位。设计特异性引物，同时在序列两端引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，在酶切位点两端皆引入保护性碱基GC。

[0077] CWP-2的引物：

[0078] Gl-CWP2-F5:CC AAGCTT AGGCAGACAGTAGTCCGC(HindIII)

[0079] Gl-CWP2-R5:CG GGATCC CCTTCTGCGGACAATAGGCTTG(BamHI)。

[0080] (3)以贾第虫的cDNA作为模板，进行RT-PCR扩增得到目的片段，经酶切后与同样经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后的pVAX1载体片段相连接，构建重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，转化E.coli DH5a，挑取阳性克隆。经测序鉴定正确的重组子以电击转化的方式转入沙门菌SL7207，构建重组沙门菌疫苗。

[0081] 实施例4

[0082] 重组菌株在体外传代培养的稳定性

[0083] 为了检测重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2电转入减毒沙门氏菌SL7207后在细菌内的稳定传代情况，分别将携带重组质粒的重组减毒沙门氏菌在含有卡那霉素培养基和不含卡那霉素培养基中培养7天，每隔12小时取等体积菌液铺板计数，通过计数在两种培养基中菌落数量来计算稳定性。即用含卡那霉素的培养基中生长的菌落数量除以不含卡那霉素的培养基中生长的菌落数量，再换算成百分比。

[0084] 实验结果示于图1，显示培养168小时后，有90％以上的质粒仍稳定存在于重组减毒沙门氏菌内。

[0085] 收集培养后7天的重组菌株，PBS洗涤离心后涂片，以5％正常羊血清封闭30分钟，PBS洗涤后分别滴加1:2000CWP-2和α1-giardin免疫兔血清，4℃过夜；PBS洗涤后滴加1:200DyLightTM488标记的羊抗兔荧光二抗，在荧光显微镜下观察照相。实验结果示于图2，显示菌体内有相应蛋白的表达。

[0086] 以上实验结果表明，重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2电转入减毒沙门氏菌SL7207后能够在宿主细菌内进行稳定传代，并可以稳定表达免疫抗原α1-giardin和CWP-2。

[0087] 实施例5

[0088] 重组菌株的免疫效果

[0089] 小鼠口服本发明的二价DNA疫苗即重组减毒沙门氏菌体SL7207/pVAX1-α1-giardin和SL7207/pVAX1-CWP-2的1:1混合疫苗免疫后，采集小鼠的血清和肠道冲洗液，分别检测血清抗体IgG效价和肠道冲洗液总SIgA含量随免疫时间的变化，以及在免疫小鼠7周时小鼠肠道冲洗液中抗α1-giardin和CWP-2特异性SIgA的含量。

[0090] 实验结果分别示于图3、图4和图5中。图3表明相对于PVAX1/SL7207和PBS的对照组，本发明的重组减毒沙门氏菌免疫小鼠的血清抗体IgG效价随免疫时间而显著升高并且在7周后趋于稳定。图4表明本发明的重组减毒沙门氏菌免疫小鼠的肠道冲洗液中总SIgA含量显著高于PVAX1/SL7207和PBS的对照组，并在11周左右达到峰值。图5表明本发明的重组减毒沙门氏菌免疫小鼠在7周时肠道冲洗液中抗α1-giardin和CWP-2特异性SIgA的含量显著高于PVAX1/SL7207和PBS的对照组。以上实验结果明确证实经本发明的二价DNA疫苗免疫的小鼠在血清和肠道中产生了显著的相关抗体，表明本发明的二价DNA疫苗具有明确而显著的免疫效果。

[0091] 实施例6

[0092] 重组菌株的体内定植稳定性

[0093] 通过免疫荧光试验检测重组沙门菌SL7207/pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2在小鼠肠系膜淋巴结的表达结果。

[0094] 在口服重组减毒沙门氏菌体SL7207/pVAX1-α1-giardin和SL7207/pVAX1-CWP-2免疫7周后，采集小鼠的肠系膜组织，10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，进行免疫荧光检测。

[0095] 一抗：1:2000CWP-2和α1-giardin免疫兔血清。

[0096] 二抗：HRP-羊抗兔血清。

[0097] 实验结果示于图3，显示两种目的蛋白α1-giardin和CWP-2分别在小鼠肠系膜淋巴结内得到表达。该实验结果表明本发明的二价DNA疫苗在小鼠体内实现稳定定植。

[0098] 实施例7

[0099] 二价DNA疫苗肠溶制剂的制备

[0100] 1.扩增培养：将本发明的1:1混合的重组减毒沙门氏菌体SL7207/pVAX1-α1-giardin和SL7207/pVAX1-CWP-2进行扩增培养得到经扩增的培养物；

[0101] 2.冻干：取150ml培养物离心，向沉淀中加入5ml冻干保护剂(5％脱脂奶粉，2.5％蔗糖)，冻干24h，得到冻干粉；

[0102] 3.研磨：在冻干粉中混入定量辅料(微晶纤维素、淀粉、微分硅胶、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁等)，研匀得到研磨粉；

[0103] 4.压片：称取定量研磨粉，进行细菌重组菌技术和活力检测，根据技术结果定量压5
片(例如1×10个细菌/片)。

[0104] 5.包衣：称取适量欧巴代，高速搅拌下加入蒸馏水中，制成浓度为20％的混悬液，继续搅拌2h，得包衣液，包衣机转数调节为40-50r/min，加入制备好的片剂，调节喷枪液-气比例，包衣至片剂增重6-8％；

[0105] 6.全检：随机抽取片剂进行崩解实验和重组菌活力实验，以及储存温度和保质期实验

[0106] 7.铝塑包装。

[0107] 实施例8

[0108] 二价DNA疫苗肠溶制剂的效力实验

[0109] 1.1-2月龄实验犬，20只，体重1.5kg左右。随机分为4组，每组5只。实验组0天喂食实施例7得到的肠溶制剂的片剂(剂量：1×105个细菌/片)，第2周和第6周同样剂量加强一次。对照组不处理。免疫后8周，实验组和对照组幼犬均经口饲喂2×105贾第虫滋养体。

[0110] 2.贾第虫感染后第三天开始每日采集实验幼犬新鲜粪便若干，加一定量水稀释后，经60目网筛过滤，滤液经3000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加饱和硫酸锌溶液搅匀，2500r/min离心10min，取悬液以4倍水稀释，3000r/min离心10min,沉淀加自来水用上述离心沉淀法反复洗2次，以洗去硫酸锌，最后将沉淀加水定容成5mL，取1滴，滴加卢戈氏碘液染色后，加盖玻片置400倍光镜下观察，检查有无贾第虫包囊，连续坚持15天，以确定感染情况。经检查有包囊排出者，视为感染。试验结果示于表1。

[0111] 表1 二价DNA疫苗口服肠溶制剂的效力试验

[0112]

[0113] 从表1可见，本发明的二价疫苗的免疫效果显著优于单独使用一价疫苗，并且本发明的二价DNA疫苗口服肠溶制剂具有显著的免疫效果。

[0114] 实施例9

[0115] 疫苗肠溶制剂的安全性试验

[0116] 取6～8周龄BALB/c雌性小鼠25只，随机分组，给予不同剂量的重组菌液，观察小鼠的不良反应，7周后处死，对小鼠感染沙门菌进行评价。除1只在感染初期死亡(病因不明确)以外，其他均未发现沙门菌致病表现。取所有实验鼠的肝、脾、肠系膜等样本进行病理检测，无沙门菌感染病理改变。

[0117] 该试验结果表明本发明的二价DNA疫苗肠溶制剂不会造成沙门菌感染致病，动物试验证明是安全的。

[0118] 本发明的实用性：

[0119] 1.人体贾第虫病的控制：贾第虫呈世界范围分布，是引起肠道感染的最主要的肠道寄生原虫。尤其在艾滋病或免疫功能低下的患者，可引起致死性腹泻。贾第虫的包囊主要污染水源，具有非常强的抵抗力，常规的过滤或氯化处理并不能杀死贾第虫的包囊。动物感染源是导致人类致病的重要原因。此外，随着旅游业的发展，人口流动的增加，贾第虫感染出现明显增加的趋势。因此，有效的抗贾第虫疫苗的研发，对于人体贾第虫病的控制至关重要。

[0120] 2.畜牧业发展的需要：贾第虫可感染40多种动物，为典型的人畜共患病，也是近年来危害我省畜牧业发展的主要寄生虫病之一。动物感染贾第虫后可出现厌食、腹泻和消瘦等症状，严重者可导致死亡。因此，研发能够阻断贾第虫病传播的兽用疫苗显得尤为迫切。就研制阻断贾第虫病传播的兽用疫苗而言，发展以饵料或饲料饲喂的口服疫苗，显然是一种简单有效的途径。

[0121] 鉴于贾第虫对于人类健康和畜牧业发展的重要性，本发明的新型抗贾第虫二价DNA疫苗口服肠溶制剂的研制成功将迎来广阔的市场。

[0122] 虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容只是为了便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属技术领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式上及细节上作任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

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