一种利用重组脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的方法

摘要

本发明公开了一种利用重组脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的方法。重组脂肪氧合酶rLOX-27853在降解三苯甲烷类染料中的应用，所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种利用重组脂肪氧合酶rLOX-27853降解三苯甲烷类染料的方法，向含有亚油酸钠和三苯甲烷类染料的介质中加入所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853对其进行降解。本发明人从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组中，克隆获得一种新型的原核脂肪氧合酶基因LOX‐27853，并利用发酵培养的方法实现了在大肠杆菌表达宿主菌的异源高效表达，可高效地催化三苯甲烷类染料苯胺蓝、孔雀石绿、亮绿的降解。

权利要求

1.重组脂肪氧合酶rLOX-27853在降解三苯甲烷类染料中的应用，其特征在于所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853通过以下方法制备得到：（1）从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶基因；

（2）构建脂肪氧合酶基因原核表达载体；

（3）在大肠杆菌中发酵生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶基因包含以下步骤：(1)提取保藏号为ATCC27853的铜绿假单胞杆菌的基因组DNA；(2)以F-2和R-2为上、下游引物，铜绿假单胞杆菌ATCC27853的基因组DNA为模板，PCR扩增脂肪氧合酶基因；(3) 回收纯化目标PCR产物；其中，所述的引物F-2序列为：SEQ ID NO.5，引物R-2序列为：SEQ ID NO.6。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的构建脂肪氧合酶基因原核表达载体是将步骤（1）克隆得到的脂肪氧合酶基因插入载体pET-23a的SacI、XhoI酶切位点得到表达质粒pET-23a-LOX-27853。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将表达质粒pET-23a-LOX-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS获得重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行发酵，生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于发酵使用的发酵培养基配方为：10g/L乳糖，

0.5g/L葡萄糖，5g/L甘油，3.4g/L KH2PO4，1.2g/L MgSO4，10g/L酶解酪蛋白酸钠，5g/L酵母提取物，8.95g/L Na2HPO4.12H2O，1.42g/L Na2SO4, 2.67g/L NH4Cl以及1ml微量元素混合液；所述的微量元素混合液配方为：50μM FeCl3.6H2O, 20μM CaCl2.2H2O,10 μM MnCl2.4H2O, 10 μM ZnSO4.7H2O, 2μM CoCl2.6H2O, 2μM CuCl2, 2μM NiCl2, 2μM Na2SeO3, 

2μM H3B4O7.

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。

7.一种利用重组脂肪氧合酶rLOX-27853降解三苯甲烷类染料的方法，其特征在于包含以下步骤：（1）以F-2和R-2为上、下游引物从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶基因；其中F-2引物序列如SEQ ID NO.5所示，R-2引物序列如SEQ ID NO.6所示；

（2）将步骤（1）克隆得到的脂肪氧合酶基因插入载体pET-23a的SacI、XhoI酶切位点得到表达质粒pET-23a-LOX-27853；

（3）将表达质粒pET-23a-LOX-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS获得重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行发酵，生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-

27853；

（4）向含有亚油酸钠和三苯甲烷类染料的介质中加入所述的重组脂肪氧合酶rLOX-

27853对其进行降解。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。

说明书

一种利用重组脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种利用重组脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的方法。

背景技术

[0002] 三苯甲烷类染料是一种多苯环化合物，使用面较广，用量也较大，其产量被列为第三大主要染料。其中某些染料及中间降解产物具有“三致”作用。且这类染料中的一部分难以降解，常常导致常规的生物处理系统处理效果不够理想。行之有效的染料废水处理方法和技术是改善生态环境、保证食品安全和维护人类健康的重要保证。生物法即通过筛选或构建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料废水的脱色，是一种经济、有效且适于大规模废水处理的技术。

[0003] 生物方法对染料的脱色主要通过降解和生物吸附两方面发挥作用，降解是由微生物分泌胞外氧化酶-木质素降解酶系统进行脱色，包括漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶等；而吸附主要是通过菌体的自身结构与染料等大分子物质相契合所致。因此，对用于染料的生物脱色方法通常以微生物和酶为载体进行研究。

[0004] LOX属于氧化还原酶，广泛存在于植物体中，它的结构中含有非血红素铁，能专一催化含顺，顺－1，4－戊二烯的多不饱和脂肪酸及酯，通过分子加氢，形成具有共扼双键的氢过氧化衍生物，这些氢过氧化物性质活泼，是重要的化学反应中间体。LOX对于它作用的底物具有特异性的要求，需要含有顺，顺－1，4－戊二烯的直链脂肪酸、脂肪酸酯和醇等。例如，LOX通过与其天然底物亚油酸作用，是处于未活化状态的酶中的还原态的Fe变成氧化态的Fe，从而使酶激活。活化态的酶通过催化氧化亚油酸，生成氢过氧化物，不稳定的氢过氧化物将裂解产生脂质自由基，脂质自由基具有非常高的反应活性，争夺生物分子如蛋白质、多糖等的电子，进而造成生物分子结构的变化。

[0005] 三苯甲烷类的染料是一类带有苯环及其他侧链结构的化合物，其降解过程即是其结构被破坏，产生无毒无害降解产物的过程。目前尚未见将脂肪氧合酶用于催化降解三苯甲烷类染料的报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有技术的现有缺陷，提供一种重组铜绿假单胞菌脂肪氧合酶的应 用。

[0007] 本发明的另一目的是提供一种利用重组铜绿假单胞菌脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的方法。

[0008] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0009] 重组脂肪氧合酶rLOX-27853在降解三苯甲烷类染料中的应用，所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 其中，所述的三苯甲烷类染料优选孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。

[0011] 所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853优选通过以下方法制备得到：

[0012] (1)从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶基因；

[0013] (2)构建脂肪氧合酶基因原核表达载体；

[0014] (3)在大肠杆菌中发酵生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853。

[0015] 所述的从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶基因优选包含以下步骤：(1)提取保藏号为ATCC27853的铜绿假单胞杆菌的基因组DNA；(2)以F-2和R-2为上、下游引物，铜绿假单胞杆菌ATCC27853的基因组DNA为模板，PCR扩增脂肪氧合酶基因；(3)回收纯化目标PCR产物；其中，所述的引物F-2序列为：SEQ ID NO.5，引物R-2序列为：SEQ ID NO.6。

[0016] 所述的构建脂肪氧合酶基因原核表达载体优选将步骤(1)克隆得到的脂肪氧合酶基因插入载体pET-23a的SacI、XhoI酶切位点得到表达质粒pET-23a-LOX-27853。将表达质粒pET-23a-LOX-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS获得重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行发酵，生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853。

[0017] 其中，发酵使用的发酵培养基配方为：10g/L乳糖，0.5g/L葡萄糖，5g/L甘油，3.4g/LKH2PO4，1.2g/L MgSO4，10g/L酶解酪蛋白酸钠，5g/L酵母提取物，8.95g/L Na2HPO4.12H2O，1.42g/LNa2SO4,2.67g/L NH4Cl以及1ml微量元素混合液；所述的微量元素混合液配方为：50μMFeCl3.6H2O,20μM CaCl2.2H2O,10μM MnCl2.4H2O,10μM ZnSO4.7H2O,2μM CoCl2.6H2O,2μMCuCl2,2μM NiCl2,2μM Na2SeO3,2μM H3B4O7.

[0018] 一种利用重组脂肪氧合酶rLOX-27853降解三苯甲烷类染料的方法，包含以下步骤：

[0019] (1)以F-2和R-2为上、下游引物从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶基因；

[0020] (2)将步骤(1)克隆得到的脂肪氧合酶基因插入载体pET-23a的SacI、XhoI酶切位点得到表达质粒pET-23a-LOX-27853；

[0021] (3)将表达质粒pET-23a-LOX-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS获得重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行发酵，生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853；

[0022] (4)向含有亚油酸钠和三苯甲烷类染料的介质中加入所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853对其进行降解。

[0023] 其中，所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。

[0024] 有益效果：

[0025] 本发明人从铜绿假单胞菌ATCC27853基因组中，克隆获得一种新型的原核脂肪氧合酶基因LOX-27853，以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，构建基因工程菌，通过发酵的方法，实现了重组铜绿假单胞菌脂肪氧合酶rLOX-27853异源高效生产。重组铜绿假单胞菌脂肪氧合酶rLOX-27853应用于高效地催化三苯甲烷类染料孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝的降解。

附图说明

[0026] 图1 rLOX-27853对苯胺蓝的降解效果图(A)及降解前后全波长扫描图(B)。

[0027] 图2 rLOX-27853对孔雀石绿的降解效果图(A)及降解前后全波长扫描图(B)。

[0028] 图3 rLOX-27853对亮绿的降解效果图(A)及降解前后全波长扫描图(B)。

具体实施方式

[0029] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

[0030] 实施例1：铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)的克隆[0031] 离心收集铜绿假单胞菌ATCC27853菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取铜绿假单胞菌ATCC27853的基因组DNA。

[0032] 根据Genebank数据库中已登录的假单胞菌脂肪氧合酶基因(No.CP006832.1)设计两个引物：

[0033] 上游引物F-1：5′-ATGAAACGCAGGAGTGTGCTCTTG-3′(SEQ ID NO.3)；

[0034] 下游引物R-1：5′-TCAGATATTGGTGCTCGCCGGGATC-3′(SEQ ID NO.4)；

[0035] 在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM,铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃3min；30×(94℃40s，53℃50s， 72℃90s)；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa pMD19-simple-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序，用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个序列如SEQ ID NO.1所示的长度为2058bp的ORF(Genebank上的登录号是：KJ622355.2)，即铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)，编码一个由655个氨基酸组成的蛋白质，序列如SEQID NO.2所示。

[0036] 实施例2：铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)原核表达载体的构建(附图1)

[0037] 根据获得的漆酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列):

[0038] 上游引物F-2：5′-CGCGAGCTCATGAAACGCAGGAGTGTGCTCTTG-3′(SEQ ID NO.5)[0039] 下游引物R-2:5′-CCGCTCGAGTCAGATATTGGTGCTCGCCGGGATC-3′(SEQ ID NO.6)[0040] 按照下列PCR体系加入各成分，扩增LOX基因:

[0041]

[0042] PCR程序为：94℃3min；30×(94℃40s；53℃50s；72℃90s)；72℃10min。

[0043] 用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH2O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a连接，转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。

[0044] 实施例3：铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)在大肠杆菌中发酵生产

[0045] 铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)在大肠杆菌中发酵生产涉及以下三种培养基：

[0046] (1)固体平板培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉

[0047] (2)种子液培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠[0048] (3)发酵培养基：10g/L乳糖，0.5g/L葡萄糖，5g/La甘油，3.4g/L KH2PO4，1.2g/L MgSO4，10g/L酶解酪蛋白酸钠，5g/L酵母提取物，8.95g/L Na2HPO4.12H2O，1.42g/L Na2SO4,2.67g/L NH4Cl以及1ml微量元素混合液。

[0049] (4)微量元素混合液：50μM FeCl3.6H2O,20μM CaCl2.2H2O,10μM MnCl2.4H2O,10μM ZnSO4.7H2O,2μM CoCl2.6H2O,2μM CuCl2,2μM NiCl2,2μM Na2SeO3,2μM H3B4O7.[0050] 铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)在大肠杆菌中发酵生产的方法：

[0051] (1)将含有LOX-27853表达质粒pET-23a-LOX-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS(德国Novagen公司产品)，涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)固体平板平板培养基，37℃培养12-16小时；

[0052] (2)挑取单菌落，接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的50ml种子液培养基，70-90rpm 30℃培养过夜；

[0053] (3)按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素(100μg/ml)的100ml发酵培养基，37℃180rpm振荡培养2-3小时至OD600约为0.6；

[0054] (4)调节发酵温度至25℃，180rpm振荡培养25-30小时。

[0055] (5)离心收集菌体，加pH 6.0的磷酸缓冲液，超声破碎菌体，离心收集上清液，获得重组铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶(rLOX-27853)的粗酶液。

[0056] 实施例4：重组脂肪氧合酶的分离纯化

[0057] 采用NTA(镍柱，GE公司产品)亲和层析法对实例3中获得的rLOX-27853粗酶液进行分离纯化。

[0058] 样品中加5mM咪唑(终浓度)，增强吸附柱。

[0059] 上样前，用20mM咪唑平衡层析柱。样品过三次柱材料，达到rLOX-27853与亲和柱材料充 分结合的目的。

[0060] 上样结束后，用100mM咪唑洗脱(分别用10个柱床体积)，收集洗脱液测酶活。

[0061] 实施例5：重组脂肪氧合酶活力测定

[0062] 脂肪氧合酶活性分析用亚油酸钠作为底物。酶反应体系中含有：pH 6.0的磷酸缓冲液2.79mL，酶液(实施例4或3制备制备的酶液)10μL，亚油酸钠200μL，混匀后放入35℃水浴中并开始计时，反应3min后测定吸光度。酶活单位定义：在上述条件下以1min内3mL反应体系在234nm的吸光度增加0.001作为一个酶活力单位U。

[0063] 按照上述酶活定义，采用实施例3所述的铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因(LOX-27853)在大肠杆菌中发酵生产的方法，rLOX-27853的产量可到达50000-55000U/ml发酵液。

[0064] 实施例6：rLOX-27853对染料的降解

[0065] rLOX-27853对染料的脱色能力采用比色法测定。苯胺蓝、孔雀石绿、亮绿的最大吸收波长分别为585nm、627nm和617nm，测染料降解前后在最大吸收波长处的吸光值。降解前后的吸光值分别为A1、A2，其脱色率用下述公式计算：

[0066] 脱色率(％)＝(A1-A2)/A1×100％

[0067] 利用rLOX-27853催化染料脱色降解的反应体系：总体积4mL，包括0.2mol/L pH6.0磷酸缓冲液，亚油酸钠2.5mmol/L，5U/mL rLOX-27853(实施例4制备的酶液)和50mg/L的染料(苯胺蓝、孔雀石绿或亮绿)，以不加酶为对照，于37℃下静置反应12h，对染料的脱色效率分别为：苯胺蓝，100％；孔雀石绿，90％；亮绿，80％。全波长扫描结果见附图1～3。3种染料经rLOX27853处理后，在最大吸收波长处的吸收峰均明显消失。