本发明公开了产酶溶杆菌OH11中一种抗真菌和卵菌活性的代谢产物及其分离方法。所述的分离方法是首先将产酶溶杆菌OH11接种至TSB培养液中，发酵50～100h后，得到产酶溶杆菌OH11发酵液；之后调节发酵液至酸性，依次经过有机溶剂萃取，柱层析和色谱法分离制备得到目标产物。采用高分辨率质谱与核磁共振等技术，确定了该产物的化学结构，它是一种含有四胺酸残基的大环内酰胺类化合物，分子式为C29H40O6N2。得到的代谢产物及其衍生物具有较好的抗真菌和卵菌活性。
产酶溶杆菌OH11中一种抗真菌和卵菌活性代谢产物及其分离
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及来源于产酶溶杆菌OH11的一种抗真菌和卵菌活性代谢产物及其分离方法。
背景技术
[0002] 溶杆菌(Lysobacter spp.)属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)。1978年，溶杆菌属正式建立。近年来，通过系统发育分类学方法完善了溶杆菌属的分类地位，截止2014年7月，国际上已鉴定的溶杆菌属细菌有32个种。该属细菌无鞭毛但有滑移性，对许多微生物，如真菌、卵菌、酵母、细菌、单细胞藻类和线虫都有较好的拮抗活性，是一类具有重要生防和药用潜力的革兰氏阴性菌。其作用机理为：(1)产生小分子抗菌次生代谢产物；(2)分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3)诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。
[0003] 产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)OH11是本实验室自主分离的一个菌株。室内抑菌试验表明，该菌对多种植物病原真菌、卵菌和细菌均有较强的拮抗活性；温室防病试验表明，该菌对植物真菌、卵菌和细菌病害的总体防治效果为50％－70％(见专利ZL200710190998.6)。进一步研究表明：OH11能产生多种抗菌小分子代谢产物和胞外酶，而且这些小分子代谢产物是其具有抗菌活性的主要原因，因此，分离鉴定对真菌和卵菌具有拮抗作用的小分子化合物对于阐明溶杆菌作用机制，开发新型杀菌剂或农药先导化合物具有重要意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对上述问题提供产酶溶杆菌OH11中一种抗真菌和卵菌活性代谢产物及其衍生物。
[0005] 本发明还有一个目的是提供产酶溶杆菌OH11的一种抗真菌和卵菌活性代谢产物的制备方法及其应用。
[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007] 一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的抗真菌和卵菌活性代谢产物，该产物的结构式如式Ⅰ：
[0008]
[0009] 一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的抗真菌和卵菌活性代谢产物的衍生物，该衍生物的结构式如式Ⅱ：
[0010]
[0011] 其中，R1为H、OH、F、Cl、Br、I或OR3；
[0012] R2为H、OH、F、Cl、Br、I或OR4；
[0013] R3，R4彼此独立地为R5CO-；
[0014] R5为H或C1-C4的烷基。
[0015] 优选：R1为H、OH、Cl、Br、I或OR3；R2为H、OH、Cl、Br、I或OR4；R5为H所述的产酶溶杆菌OH11发酵液中提取的抗真菌和卵菌活性代谢产物，该产物的结构式如式Ⅱ-a～r：
[0016]
[0017]
[0018]
[0019] 一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的抗真菌和卵菌活性代谢产物的方法，该方法包括以下步骤：
[0020] (1)将产酶溶杆菌OH11单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在温度为28℃，搅拌速度为200rpm的条件下过夜培养得到种子液，取种子液按0.5～1.5％的接种量接种至5～15％TSB的培养基中，在搅拌的条件下发酵50～100h，得到产酶溶杆菌OH11发酵液；
[0021] (2)调节产酶溶杆菌OH11发酵液pH至2～4后用有机溶剂萃取，萃取后蒸干有机溶剂后得粗提物；
[0022] (3)将粗提物采用有机溶剂溶解后，依次采用柱层析法和色谱法分离制备得到目标产物。
[0023] 本发明技术方案步骤(1)种子液按0.9～1.2％的接种量接种至5～15％TSB的培养基中；发酵过程中保持温度为25～30℃，搅拌的速度为180～220rpm，发酵的时间为70～75h。
[0024] 本发明技术方案步骤(1)中卡那霉素的浓度是25μg/mL。
[0025] 在步骤2)中调节pH值所用的调节剂为盐酸、乙酸、磷酸、硫酸、三氟乙酸、已二酸中的一种或几种。
[0026] 本发明技术方案步骤(2)中的萃取所用的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇中的至少一种；优选萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯；进一步优选萃取的次数为3次。
[0027] 本发明技术方案步骤(3)中的粗产物采用甲醇溶解。
[0028] 在一些实施方案的步骤3)中粗提物先采用反相柱层析分离，分离过程中洗脱溶剂依次为：H2O，20％MeOH-H2O，40％MeOH-H2O，60％MeOH-H2O，80％MeOH-H2O，100％MeOH，分份收集，收集后采用HPLC法制备，其中HPLC法制备的条件如下：
[0029] 柱子：Agilent XDB-C18 5μm 9.4×250μm
[0030] 流速：4mL/min
[0031] 流动相：乙腈与水的体积比为＝55：45
[0032] 检测波长：318nm
[0033] 在另一些实施例方案的步骤(3)中粗提物采用Sephadex LH-20柱层析分离，分离过程中的洗脱溶剂为100％MeOH，分份收集，收集后采用HPLC法制备，合并洗脱液，烘干得到纯品，其中HPLC法制备的条件如下：
[0034] 柱子：Agilent XDB-C18 5μm 9.4×250μm
[0035] 流速：4mL/min
[0036] 流动相：乙腈与水的体积比为＝55：45
[0037] 检测波长：318nm
[0038] 本发明所用的SephadexLH-20柱层析中，可选用常压或加压柱层析。
[0039] 本发明技术方案中从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的代谢产物对真菌和卵菌具有拮抗作用。
[0040] 本发明所述的产酶溶杆菌OH11于2007.3.19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.1978。
[0041] 本发明的有益效果：
[0042] 本发明提供了一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的代谢产物及其衍生物，该代谢产物和衍生物对对真菌和卵菌具有拮抗作用。
附图说明
[0043] 图1该代谢产物的紫外吸收图谱。
[0044] 图2该代谢产物的质谱图。
[0045] 图3该代谢产物的1H NMR谱(d6-DMSO，400HZ)。
[0046] 图4该代谢产物的1C NMR谱(d6-DMSO，400HZ)。
[0047] 图5该代谢产物对真菌和卵菌的拮抗活性。
具体实施方式
[0048] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
[0049] 实验例1
[0050] 挑取产酶溶杆菌OH11单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中(卡那霉素的浓度是25μg/mL)，28℃，200rpm过夜培养得到种子液；将种子液按1％的接种量至10％TSB培养基中，28℃，200rpm，发酵72h。采用盐酸调节发酵液pH值至2～4后，用乙酸乙酯萃取3次。将乙酸乙酯萃取相蒸干后得粗提物，将粗提物用适量甲醇溶解，通过反相柱层析分离，洗脱溶剂依次为：H2O、20％MeOH-H2O，40％MeOH-H2O，60％MeOH-H2O，80％MeOH-H2O，100％MeOH，分份收集，每份收集50mL，共收集30～40个流份，采用HPLC法制备，其中HPLC法制备的条件如下：
[0051] 柱子：Agilent XDB-C18 5μm 9.4×250μm
[0052] 流速：4mL/min
[0053] 流动相：乙腈与水的体积比为＝55：45
[0054] 检测波长：318nm
[0055] 合并洗脱液，得纯品0.035g，将各组分蒸干后做供试真菌或卵菌的拮抗活性。。
[0056] 实验例2
[0057] 挑取产酶溶杆菌OH11单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中(卡那霉素的浓度是25μg/mL)，28℃，200rpm过夜培养得到种子液；将种子液按1％的接种量至10％TSB培养基中，28℃，200rpm，发酵72h。采用盐酸调节发酵液pH值至2～4后，用乙酸乙酯萃取3次。将乙酸乙酯萃取相蒸干后得粗提物，将粗提物用适量甲醇溶解，通过SephadexLH-20柱层析分离，洗脱溶剂为100％MeOH，分份收集，每份收集5mL，共收集50～60个流份，采用HPLC法制备，其中HPLC法制备的条件如下：
[0058] 柱子：Agilent XDB-C18 5μm 9.4×250μm
[0059] 流速：4mL/min
[0060] 流动相：乙腈与水的体积比为＝55：45
[0061] 检测波长：318nm
[0062] 合并洗脱液，将各组分蒸干后做供试真菌或卵菌的拮抗活性。选择具有拮抗活性的组分用高效制备液相制备，得纯品0.031g。
[0063] 得到代谢产物的结构式如式Ⅰ所示，分子式C29H40O6N2，分子量512.2793。
[0064] 代谢产物的鉴定：
[0065] 对实施例1和实施例2分离得到的代谢产物进行鉴定，该代谢产物的分子式如式Ⅰ所示，分子式C29H40O6N2，分子量512.2793。
[0066] EI-MS m/z：511.2793[M-H]-
[0067] 1H NMR(d6-DMSO，400HZ)显示1H NMR(d6-DMSO,400MHz):δ8.94(s,1H,H-28),7.99(s,1H,H-6),6.86(d,J＝15.6Hz,1H,H-24),6.57(dd,J＝15.5,10.5Hz,1H,H-23),5.91(t,J＝10.7Hz,1H,H-8),5.70(d,J＝11.2Hz,1H,H-9),3.86(s,1H,H-2),3.81(d,J＝5.6Hz,1H,H-3),3.60-3.43(m,1H,H-20),3.25(dd,J＝9.2,5.7Hz,2H,H-5),2.57(d,J＝10.1Hz,2H,H-10),2.34(td,J＝18.8,9.4Hz,1H,H-22),2.14-1.94(m,3H,H-13,H-15a),1.90(dd,J＝
15.6,14.0Hz,1H,H-4a),1.82-1.69(m,2H,H-17,H-21a),1.65(dd,J＝11.2,5.7Hz,1H,H-
15b),1.61-1.47(m,1H,H-18),1.45-1.32(m,2H,H-21b,H-14),1.31-1.09(m,5H,H-11,H-
16,H-12,H-29),1.06(d,J＝5.8Hz,4H,H-4b,H-31),0.85(t,J＝7.3Hz,3H,H-30)。
[0068] 13C NMR(101MHz,DMSO)：δ193.44,176.18,172.66,165.91,150.52,139.49,124.51,121.77,100.81,73.12,70.58,69.02,59.53,58.52,53.96,47.88,46.85,46.05,
43.91,42.30,41.86,37.68,36.85,31.47,28.41,26.29,18.87,13.07。
[0069] 代谢产物及其衍生物对真菌和卵菌的拮抗活性测定：
[0070] 本发明代谢产物及其衍生物对植物病原真菌的拮抗活性测定：
[0071] 采用平板对峙法，在PDA平板中央放置供试的12种植物病原真菌的菌丝块。在平板四周放置无菌滤纸片，用移液枪吸取5μL该产物的甲醇溶液(浓度为10μg/mL)滴加在滤纸片上，28℃倒置培养至出现明显拮抗效果，测定抑菌带。结果如下：
[0072]
[0073] 代谢产物及其衍生物对卵菌的拮抗活性测定：
[0074] 采用平板对峙法，在PDA平板中央放置放置瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)菌丝块。在平板四周用移液枪吸取5μL该产物的甲醇溶液(浓度为10μg/mL)滴加在平板中央，28℃倒置培养至出现明显拮抗效果，测定抑菌带。结果如下：
[0075]
