乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体公开了乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用。本发明发现乙酸橙酰胺能有效的抑制各种污损生物幼虫的附着变态过程，低剂量的乙酸橙酰胺就能对海洋生物的附着具有显著的抑制作用，并且，乙酸橙酰胺在抑制海洋污损动物附着的同时，不会造成水体环境的污染及通过食物链传递导致其在生物体中的富集。因此，乙酸橙酰胺是一种天然、环保、具有良好抗生物附着活性的化合物，在各类海洋设施的污损生物防除中具有良好的应用前景。

权利要求

1.乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用；所述乙酸橙酰胺是从马尾藻中提取获得，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述污损生物为蔓足类或/和双壳类生物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，防除海洋污损生物时是将乙酸橙酰胺涂覆2

于物体表面，涂覆量≥0.1 μg/cm。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，乙酸橙酰胺的涂覆量为0.1 1 μg/cm2。

~

5.乙酸橙酰胺在制备防止海洋生物附着或/和污损的防污涂料中的应用，所述乙酸橙酰胺的结构式如式（I）所示：

式（I）。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，从马尾藻中提取获得乙酸橙酰胺的方法包括如下步骤：S1. 将马尾藻用95%酒精提取，得到提取液；

S2. 提取液减压浓缩后分别用石油醚、乙酸乙酯萃取；

S3. 取石油醚萃取部分经硅胶柱层析，层析时所用洗脱液为正己烷和丙酮溶液；

S4. 取S3洗脱后的溶液再经凝胶柱层析纯化，层析时所用洗脱液为甲醇溶液，或为氯仿和甲醇的混合溶液，洗脱液重结晶后即得所述乙酸橙酰。

说明书

乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地，涉及乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用。

背景技术

[0002] 海洋污损生物是指固着或栖息在船舶和海洋设施水下部位的各类生物，污损生物通常分为两个生活阶段，一是浮游生活阶段，即从幼虫脱出卵膜发育至时断时续地探索物体表面准备附着变态的阶段；二是固着或附着生活阶段，即幼虫选好定居位置，在附着基表面附着、变态形成幼体的阶段。海洋污损生物产生的危害主要包括：增大阻力，降低航速，增加燃料消耗和CO2排放；堵塞海水管道系统，改变金属腐蚀过程，引发局部腐蚀或穿孔腐蚀；增大动力载荷效应，造成设施的漂移、失衡甚至导致倾覆；与养殖对象（如贝类）争夺附着基和饵料，妨碍其生长发育，降低产品的品质。

[0003] 防污涂料在海洋污损生物防除中是应用最为广泛的技术方法之一。然而，传统防污涂料通过释放毒料和毒杀作用来抑制污损生物的附着，具有毒性大、有效期短等缺点，并且释放出来的防污剂还存在着危害海洋生态环境的风险，因此，开发新型、高效、低毒、环保的防污剂已成为当前急需解决的问题和研究热点。

[0004] 弄清海洋生物天然化学防污作用机制可为开发无公害防污剂提供借鉴，而且海洋生物本身也应是新型防污剂的重要来源。由于防污活性物质在海洋动物及微生物中的含量比较少，不便于深入开发和广泛应用，故从生物资源量大的海洋植物中寻找天然防污剂，不仅是一种全新的尝试，而且具有重要的理论和现实意义。

[0005] 酰胺是一类具有肽键结构并广泛分布于海藻中的化合物，其具有抗氧化、抗炎、抗菌及杀虫作用等生物活性，然而，在海洋污损生物防除领域，未有报道公开过乙酸橙酰胺抗附着作用和将其用于污损生物防除方面。

发明内容

[0006] 针对现有技术中的不足，本发明提供了乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用。

[0007] 本发明的另一目的在于提供了乙酸橙酰胺在制备防止海洋生物附着或/和污损的防污涂料中的应用。

[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

[0009] 乙酸橙酰胺在海洋污损生物防除中的应用。

[0010] 乙酸橙酰胺的结构式为：

[0011]

[0012] ，分子式C27H28N2O4，分子量为444。与其他酰胺类物质相比，乙酸橙酰胺分子结构独特，其中包含3个苯环、1个乙酰氧基、2个酰胺基，这些基团是乙酸橙酰胺抗污过程中起关键作用的基团。本发明所述乙酸橙酰胺可以是普通市售或从植物中提取的天然物质。

[0013] 从海洋污损角度来看，污损生物对人类产生的危害始于固着或附着以后，本发明发现所述乙酸橙酰胺能有效的抑制各种污损生物幼虫的附着变态过程，即能有效应用于海洋污损生物的生物防除中。并且，作为天然存在的有机化合物，在抑制海洋污损动物附着的同时，乙酸橙酰胺不会造成水体环境的污染。因此，所述乙酸橙酰胺是一种天然、环保、具有良好抗生物附着活性的化合物，在各类海洋设施的污损生物防除中具有良好的应用前景。

[0014] 优选地，所述污损生物为蔓足类或/和双壳类生物。本发明经过大量的实验研究发现，所述乙酸橙酰胺对蔓足类和双壳类的附着具有显著抑制作用，蔓足类和双壳类属于海洋污损生物中危害较大且难以清除的生物种类。

[0015] 优选地，防除海洋污损生物时是将乙酸橙酰胺涂覆于物体表面，涂覆量≥0.1 μg/cm2。将所述乙酸橙酰胺涂覆于物体表面，可以有效抑制海洋污损生物的附着。

[0016] 优选地，所述乙酸橙酰胺的涂覆量为0.1 1 μg/cm2，在所述涂覆量范围内，乙酸橙~酰胺对污损生物的附着产生明显抑制作用，且对海洋生物没有明显的毒性。

[0017] 优选地，所述乙酸橙酰胺是从马尾藻中提取获得。

[0018] 乙酸橙酰胺在制备防止海洋生物附着或/和污损的防污涂料中的应用。

[0019] 一种从马尾藻中提取获得乙酸橙酰胺的方法，包括如下步骤：

[0020] S1. 将马尾藻用95%酒精提取，得到提取液；

[0021] S2. 提取液减压浓缩后分别用石油醚、乙酸乙酯萃取；

[0022] S3. 取石油醚萃取部分经硅胶柱层析，层析时所用洗脱液为正己烷和丙酮溶液；

[0023] S4. 取S3洗脱后的溶液再经凝胶柱层析纯化，层析时所用洗脱液为甲醇溶液，或为氯仿和甲醇的混合溶液，洗脱液重结晶后即得所述乙酸橙酰胺。

[0024] 所述分离制备方法简便，原材料来源稳定，适合大规模生产推广。

[0025] 更优选地，所述提取方法，包括如下步骤：

[0026] S1. 将马尾藻用95%酒精提取三次，得到提取液；

[0027] S2. 提取液减压浓缩后分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取三次；

[0028] S3. 取石油醚萃取部分经正相硅胶柱层析，层析时所用洗脱液为正己烷或/和丙酮组成的梯度洗脱液，其中正己烷：丙酮的体积比分别为10:0、8:2、4:6、6:4、2:8、0:10，洗脱得到10个组分F1 F10；~

[0029] S4. 取其中的组分F7再经凝胶柱层析纯化，层析时所用洗脱液为氯仿和甲醇溶液，其中，氯仿：甲醇的体积比为1:1，再经重结晶纯化，即得所述乙酸橙酰胺。

[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0031] （1）本发明发现乙酸橙酰胺能有效的抑制各种污损生物幼虫的附着变态过程，低剂量的乙酸橙酰胺即能对海洋生物的附着具有显著的抑制作用。并且，作为天然存在的有机化合物，不含铜和锡等重金属元素，在抑制海洋污损动物附着的同时，乙酸橙酰胺不会造成水体环境的污染及通过食物链传递导致其在生物体中的富集。因此，所述乙酸橙酰胺是一种天然、环保、具有良好抗生物附着活性的化合物，在各类海洋设施的污损生物防除中具有良好的应用前景。

[0032] （2）本发明公开的乙酸橙酰胺分离制备途径简便，适合于大规模生产，推广应用潜力大，在海洋污损生物防除中具有良好的应用前景。

具体实施方式

[0033] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0034] 本实施方式选择海洋污损生物中危害较大且难以清除的蔓足类藤壶及双壳类贻贝为测试对象。在热带沿岸海域，藤壶是无柄蔓足类的典型代表，并且是污损生物群落中的优势种类；贻贝则是东海和南海常见的双壳类软体动物，也是附着在船舶、航（浮）标和水产养殖设施上重要的污损生物种类。另外，从海洋污损角度来看，污损生物对人类产生危害始于固着或附着以后，如能有效地抑制幼虫的附着变态，就能达到防除的目的。

[0035] 因此，本实施方式采用网纹藤壶和翡翠贻贝两类海洋生物的幼虫作为实验对象，来检验乙酸橙酰胺的防污效果是科学合理及具有代表性意义的，而不作为对本发明保护范围的限定。

[0036] 实施例1

[0037] 从硇洲马尾藻中提取乙酸橙酰胺，包括如下步骤：

[0038] S1. 将硇洲马尾藻用95%酒精提取三次，得到提取液；

[0039] S2. 提取液减压浓缩后分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取三次；

[0040] S3. 取石油醚萃取部分经正相硅胶柱层析，层析时所用洗脱液为正己烷和丙酮组成的梯度洗脱液，其中正己烷：丙酮的体积比分别为10:0、8:2、4:6、6:4、2:8、0:10，洗脱得到10个组分F1 F10；~

[0041] S4. 取其中的组分F7再经凝胶柱层析纯化，层析时所用洗脱液为氯仿和甲醇混合溶液，其中氯仿：甲醇的体积比为1:1，再经重结晶纯化，即得乙酸橙酰胺。

[0042] 提取获得的乙酸橙酰胺可用于海洋污损生物的防除及制备防止海洋生物附着或/和污损的防污涂料。

[0043] 实施例2

[0044] 实验组I：将实施例1提取得到的乙酸橙酰胺用氯仿溶解，配制成浓度为28.26 μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1 ml该溶液，并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的乙酸橙酰胺含量为1 μg/cm2。加入10 ml海水。

[0045] 实验组II：将实施例1提取得到的乙酸橙酰胺用氯仿溶解，配制成浓度为2.826 μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1 ml该溶液，并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的乙酸橙酰胺含量为0.1 μg/cm2。加入10 ml海水。

[0046] 本发明乙酸橙酰胺在培养皿的底部形成涂层，且乙酸橙酰胺不溶于海水，加入海水的目的在于培养海洋污损生物。

[0047] 对照组：加1 ml氯仿，使其均匀分布于培养皿底部，待挥发完全再加入10 ml海水。

[0048] 空白组：加入10 ml海水。

[0049] 实验组、空白组和对照组各设5个平行样。于各样品中分别加入30只网纹藤壶金星幼虫，置于温度为29℃左右的恒温培养箱内于黑暗环境中培养，每隔24小时观察一次。培养72小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。

[0050] 表1列出了实验组、对照组和空白组金星幼虫的附着和死亡率。结果显示，在恒温培养箱中培养72小时后，空白组的幼虫附着率为85%，对照组83%，空白组和对照组金星幼虫的附着率无显著差异（p>0.05），表明作为溶剂的氯仿挥发后不会遗留影响金星幼虫活性的有害物质。对于经乙酸橙酰胺处理的实验组，其金星幼虫的附着率≤10%，远远小于对照组，且差异极其显著（p<0.01）；另外，空白组、对照组和实验组的幼虫死亡率均为0，表明这种化合物能有效地抑制网纹藤壶金星幼虫的附着且该剂量不会对幼虫产生毒杀作用。

[0051] 表1 网纹藤壶金星幼虫附着状况

[0052]

[0053] 实施例3

[0054] 实验组：将实施例1提取得到的乙酸橙酰胺用氯仿溶解，配制成浓度为28.26 μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1 ml该溶液并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的乙酸橙酰胺含量为1.0 μg/cm2。加入10 ml海水。

[0055] 本发明乙酸橙酰胺在培养皿的底部形成涂层，且乙酸橙酰胺不溶于海水，加入海水的目的在于培养海洋污损生物。

[0056] 对照组：加1 ml氯仿，使溶液均匀分布于培养皿底部，待溶剂挥发完全，再加入10 ml海水。

[0057] 空白组：加入10 ml海水。

[0058] 幼虫数量的确定：从育苗池取含翡翠贻贝面盘幼虫的水体并用筛绢浓缩。分三次各取50 ml，滴入1-2滴福尔马林溶液杀死幼虫后于显微镜下计数，所得平均值即为水体中幼虫的密度。

[0059] 实验组、空白组和对照组均设5个平行样，在各组中加入约30个翡翠贻贝幼虫，接着在温度约为26℃的培养箱中于黑暗环境下培养，每隔24小时观察一次。培养72小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。

[0060] 表2列出了实验组、对照组和空白组翡翠贻贝幼虫的附着和死亡率。可见，在恒温培养箱中培养72小时后，空白组的幼虫附着率约为30%，对照组约31%，空白组和对照组面盘幼虫的附着率无显著差异（p>0.05），表明作为溶剂的氯仿挥发后不会遗留影响面盘幼虫活性的有害物质。而经乙酸橙酰胺处理的实验组，其幼虫的附着率仅为3.0%，远远低于对照组，差异极其显著（p<0.01），表明这种化合物能有效地抑制翡翠贻贝幼虫的附着。

[0061] 表2 翡翠贻贝面盘幼虫幼虫附着状况

[0062]