Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的应用及方法

摘要

本发明公开了一种Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的应用及方法，将肿瘤细胞溶液与Matrigel混合，得到混合液；将混合液加入到细胞培养基中进行细胞培养即得到逆转的肿瘤干细胞。得到的肿瘤干细胞可以用于肿瘤细胞发生机制的研究，也可以用于药物筛选。

权利要求

1.Matrigel在制备诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的试剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为PLC/PRF/5细胞或Huh7细胞。

3.权利要求1所述Matrigel 诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 将肿瘤细胞溶液与Matrigel混合，得到混合液，所述肿瘤细胞为肝癌细胞；

(2) 将混合液加入到细胞培养基中进行细胞培养即得肿瘤干细胞。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1) 中所述肝癌细胞溶液的细胞浓度为104个/mL，肝癌细胞溶液与Matrigel按1:1的体积比混合。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述细胞培养时间为1周。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述肝癌细胞溶液为Nanog阴性细胞溶液；所述Nanog阴性细胞为肝癌细胞感染Lv-pNanog-GFP 慢病毒后表现为绿色萤光蛋白不表达的细胞。

说明书

Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的应用及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的应用及方法。

背景技术

[0002] BD Matrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。

[0003] 本课题组的前期实验研究表明Nanog可以作为肝癌干细胞的新标记物分子(Hepatology.2012，56(3):1004-14)，也就是说，Nanog阴性细胞转变为Nanog阳性细胞即意味着肝癌细胞转变为肝癌干细胞。并且本研究小组利用Matrigel进行Nanog阴性细胞体内成瘤实验中，在体视显微镜下意外地观察到Nanog阴性细胞所形成的移植瘤中出现Nanog阳性细胞。据此，我们推测Matrigel很可能具有诱导Nanog阴性细胞转变为Nanog阳性细胞的作用，然而这一点现有技术并无相关报道，因此，本发明在此基础上进一步研究Matrigel能否作为逆转剂，诱导肝癌细胞转变为肝癌干细胞。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的应用，通过Matrigel的诱导，能够将肿瘤细胞转变为肿瘤干细胞；得到的肿瘤干细胞可以用于肿瘤治疗药物的筛选以及用于肿瘤细胞发生机制的研究。

[0005] 本发明还提供了Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的方法。

[0006] 本发明采用的技术方案具体如下：

[0007] 1、Matrigel在诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的试剂中的应用。

[0008] 优选的，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

[0009] 优选的，所述肝癌细胞为PLC/PRF/5细胞或Huh7细胞。

[0010] 3、Matrigel诱导肿瘤细胞逆转为肿瘤干细胞的方法，包括如下步骤：

[0011] (1)将肿瘤细胞溶液与Matrigel混合，得到混合液；

[0012] (2)将混合液加入到细胞培养基中进行细胞培养即得肿瘤干细胞。

[0013] 优选的，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

[0014] 优选的，所述步骤(1)中所述肝癌细胞溶液的细胞浓度为104个/mL，肝癌细胞溶液与Matrigel按1:1的体积比混合。

[0015] 优选的，所述步骤(2)中所述细胞培养时间为1周。

[0016] 优选的，所述步骤(1)中所述肝癌细胞溶液为Nanog阴性细胞溶液；所述Nanog阴性细胞为肝癌细胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒后表现为绿色萤光蛋白不表达的细胞。

[0017] 4、上述方法逆转得到的肿瘤干细胞。

[0018] 本发明的有益效果在于：在体外环境中肝癌细胞很难转化为肝癌干细胞，但是采用Matrigel进行诱导则能够促进这种转变的发生，从而得到肝癌干细胞。得到的肝癌干细胞可以用于肿瘤治疗药物的筛选以及用于肝癌细胞发生机制的研究。

附图说明

[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0020] 图1Nanog阴性细胞在体内发生逆转；具体为Huh7细胞Nanog阴性细胞体内成瘤后体视显微镜(放大倍数10倍)观察结果，通过显微镜可以观察到绿色荧光出现；图中的百分比为流式检测细胞中绿色荧光细胞的比例。

[0021] 图2为将Nanog阴性细胞形成的移植瘤中Nanog阳性和阴性细胞再次分离后，两种细胞的克隆和成球能力实验结果；其中GFP阳性细胞的克隆形成效率和细胞球形成效率均高于GFP阴性细胞。

[0022] 图3Matrigel诱导Nanog阴性细胞体外逆转实验结果；所用细胞为Huh7细胞，诱导组加入Matrigel；对照组用10％FBS的DMEM培养基替代Matrigel，将Nanog阴性细胞分别经过含Matrigel和不含Matrigel的对照条件培养6天后流式检测，图中A为对照组显微镜观察及流式结果，B为Matrigel诱导组显微镜观察及流式结果，在Matrigel诱导组观察到了明显的绿色荧光出现，流式检测阳性率为5.3％。

[0023] 图4为Matrigel体外诱导后得到的Nanog阳性细胞成球实验结果；图中A为诱导逆转形成的Nanog阳性细胞成球结果，图中B为未经诱导的普通Nanog阳性细胞成球结果；与普通经流式分选得到的Nanog阳性细胞相比，逆转形成的GFP阳性细胞表现出基本一致的成球能力。

具体实施方式

[0024] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0025] 本发明所述Nanog阴性细胞是指细胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒后表现为GFP(绿色萤光蛋白)不表达的细胞，Nanog阳性细胞是指细胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒后表现为GFP表达的细胞。

[0026] 本发明所用肝癌细胞系为PLC/PRF/5细胞和Huh7细胞，PLC/PRF/5细胞购于ATCC；Huh7细胞来源于本课题组库存。

[0027] 本发明所用仪器如表1所示。

[0028] 表1实验仪器

[0029]

[0030] 本发明所用试剂如表2所示。

[0031] 表2实验试剂

[0032]

[0033]

[0034] 试剂配制

[0035] 1.流式细胞检测试剂配制

[0036] (1).固定液(4％多聚甲醛)：称取4g多聚甲醛，加入100mLPBS，边加热边搅拌至沉淀完全溶解，过滤去除杂质，4℃保存备用。

[0037] (2).0.1％Triton X-100溶液：取0.1mL Triton X-100，加入100mL PBS中，充分混匀，高压灭菌，4℃保存备用。

[0038] (3).封闭液(1％FBS)：取1mL FBS，加入99mL PBS，混匀后，4℃保存备用。

[0039] 2.细胞培养试剂及溶液配制

[0040] (1).DMEM培养基：将DMEM粉末溶于超纯水中，每升加入青霉素0.0625g、链霉素0.11g、NaHCO33.73g和HEPES 5.96g，搅拌至完全溶解，用10mol/L NaOH将pH调至7.2-7.4，
0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。使用时每瓶按10％体积加入FBS，即为完全培养基。

[0041] (2).磷酸盐缓冲液(0.01mol/L PBS)：取PBS袋装粉剂(2L装)，用约1L超纯水溶解，充分搅拌至完全溶解，定容至2L，调PH值至7.4，分装，高压灭菌后4℃保存备用。

[0042] (3).胰酶消化液：称取0.25g胰酶和0.02g EDTA，溶于80mL PBS中，搅拌至完全溶解，定容至100mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。

[0043] (4).细胞冻存液：按DMEM培养基:FBS:DMSO＝7:2:1的比例(体积比)配制。

[0044] (5).2％甲基纤维素：将100mL去离子水加热到80℃以上，加入6g甲基纤维素震荡使甲基纤维素侵润并分散；另取200mL去离子水预冷至0-4℃，加入甲基纤维素中，震荡混匀，冰置20-40min使温度降至0-4℃；继续震荡至少30min后，高压灭菌，4℃保存。

[0045] (6).2×DMEM/F12培养基：取1袋DMEM/F12(1L装)粉末溶于400mL去离子水中，加入2g NaHCO3、2.5g HEPES、0.0625g青霉素和0.11g链霉素，混匀后用1M NaOH将pH调至7.20，定容至500mL。

[0046] (7).成球培养基：取48mL 2×DMEM/F12培养基，加入2mL B27、100μL EGF(20μg/mL)、100μL bFGF(20μg/mL)和100μL HGF(10μg/mL)，混匀后加入50mL 2％甲基纤维素，混匀，4℃保存不超过1个月。

[0047] 实验步骤

[0048] 一、肝癌细胞成球培养

[0049] 1.将贴壁生长的肝癌细胞用胰酶消化，制备成单细胞悬液；

[0050] 2.用PBS洗细胞2次，去除残余的培养基；

[0051] 3.加入成球培养基重悬细胞，用台盼蓝染色进行活细胞计数，然后根据计数用成球培养基将单细胞悬液适当稀释；

[0052] 4.将细胞铺入低粘附24孔板中，1000个细胞/孔；

[0053] 5.37℃培养箱中培养，每3天进行半量换液，即倾斜培养板静置1min使细胞球自然沉降，用移液器小心吸去一半培养基，并加入一半新鲜培养基。

[0054] 二、细胞球单细胞的分离及检测

[0055] 1.收集细胞球：吸取培养基至离心管中，在孔板中加入PBS，收集残余细胞球；

[0056] 2.1000rpm离心5min，弃上清；

[0057] 3.加入预温至37℃胰酶消化细胞球2-10min，中间每间隔2min，用移液器进行吹打，显微镜下观察直至细胞团消化成单细胞；

[0058] 4.加入完全DMEM培养基中和胰酶，1000rpm离心5min，弃上清；

[0059] 5.PBS重悬细胞，流式细胞仪检测相应指标。

[0060] 三、细胞球形成实验

[0061] 1.预先在低粘附96孔板中加入100μL含1％甲基纤维素的成球培养基，37℃培养箱中预热；

[0062] 2.将贴壁生长的肝癌细胞消化成单细胞悬液，PBS重悬细胞；

[0063] 3.在进行流式分选前，提前10min加入7-氨基放线菌素，用于排除死细胞；

[0064] 4.流式细胞仪分选GFP阳性/阴性细胞或不同处理组细胞，铺入96孔板中，10个细胞/孔，每个样品设置6-12个重复；流式分选时选择单细胞模式，排除聚集细胞，保证每一个细胞球来源于单个细胞；

[0065] 5.将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养；

[0066] 6.3天后，补加100μL新鲜的成球培养基后培养7-11天；

[0067] 7.显微镜下进行细胞球计数，统计直径大于75μm的细胞球，以每孔细胞球数目总和除以每孔铺入的细胞数来计算成球率；

[0068] 8.对于2代、3代成球，将细胞球收集后加入预温至37℃胰酶消化细胞球2-10min，中间每间隔2min，用移液器进行吹打，显微镜下观察直至细胞团消化成单细胞；

[0069] 9.加入完全DMEM培养基中和胰酶，1000rpm离心5min，弃上清；

[0070] 10.用含1％FBS的PBS重悬细胞；

[0071] 11.流式细胞仪分选GFP阳性/阴性细胞铺板。

[0072] 四、克隆形成实验

[0073] 1.预先在24孔板中加入500μL含10％FBS的DMEM培养基，37℃培养箱中预热；

[0074] 2.将贴壁生长的肝癌细胞消化成单细胞悬液，PBS重悬细胞；

[0075] 3.在进行流式分选前，提前10min加入7-氨基放线菌素，用于排除死细胞；

[0076] 4.流式分选GFP阳性/阴性细胞或不同处理组细胞，铺入24孔板中，50个细胞/孔，每个样品设置3-6个重复；流式分选时选择单细胞模式，排除聚集细胞；

[0077] 5.置于37℃5％CO2培养箱中培养；

[0078] 6.每3天更换1次培养基，共培养10-14天；

[0079] 7.吸去培养基，PBS洗1次，加入甲醇室温固定细胞10min；

[0080] 8.弃去甲醇，PBS洗1次，风干；

[0081] 9.每孔加入500μL 0.5％结晶紫进行室温摇床染色10min；

[0082] 10.吸去结晶紫，用水洗去多余结晶紫；

[0083] 11.显微镜下克隆计数，统计细胞数大于50个的克隆，计算出克隆形成率，即克隆形成率＝每孔克隆数总和/每孔铺入的细胞数×100％；

[0084] 12.根据克隆的紧密程度，将克隆分成三类：紧密型克隆、中间型克隆、松散型克隆，统计三种克隆形成率。

[0085] 五、体内成瘤实验

[0086] 1.预先从-20℃取出Matrigel，置于4℃融化24h；

[0087] 2.消化肝癌细胞，用无血清DMEM培养基重悬细胞，制备单细胞悬液；

[0088] 3.加入7-氨基放线菌素，用流式细胞仪分选出GFP阳性和阴性的细胞；

[0089] 4.计数，将细胞分成1×104、1×103、1×102三个不同数量级，并重悬于50μL DMEM培养基分装在不同Ep管中，每个数量级6-10个重复；

[0090] 5.每管中加入50μL Matrigel，混匀；注意需要冰上操作，避免Matrigel凝固；

[0091] 6.将细胞悬液分别以1×104、1×103、1×102三个不同数量级皮下注射SCID鼠；

[0092] 7.接种细胞后，从长出肿瘤开始，每2日测量肿瘤大小；

[0093] 8.接种肿瘤细胞后6-12周后处死小鼠，统计成瘤率、肿瘤重量；

[0094] 9.计算各时间点移植瘤体积，移植瘤体积计算公式：肿瘤体积＝(长×宽2)/2；

[0095] 10.形成的肿瘤经过体视显微镜拍摄明场和GFP荧光；

[0096] 11.将肿瘤被切割1mm3小块，然后经胰酶消化分离成单细胞悬液；

[0097] 12.流式细胞仪检测其中的GFP阳性率。

[0098] 六、Matrigel体外培养实验

[0099] 1.将Nanog阴性细胞稀释至104个/mL，然后取100μL和等体积的4℃溶解后的Matrigel混合；

[0100] 2.将细胞/Matrigel混合体加入到含EGF/bFGF的成球培养基中，继续培养1周；

[0101] 3.荧光显微镜观察细胞中GFP的表达情况；

[0102] 4.离心收集细胞，加入dispase酶将Matrigel分解；

[0103] 5.加入PBS重悬细胞球，离心收集细胞沉淀；

[0104] 6.加入胰酶消化细胞团，得到分散的单个细胞；

[0105] 7.流式检测细胞中GFP的阳性率，并将阴性和阳性细胞分别再分选出来进行克隆、成球和成瘤能力检测。

[0106] 实验结果及分析

[0107] 虽然前期在体外研究中，无论是在细胞群体还是在单细胞水平上，从未观察到Nanog阴性细胞向阳性细胞的转变。但在检测Nanog阴性细胞体内成瘤实验中，在体视显微镜下意外地观察到Nanog阴性细胞所形成的移植瘤中有GFP荧光存在(图1)。而进一步将移植瘤剪碎、消化成单细胞悬液，进行流式细胞仪检测证实GFP阳性细胞的确存在，且阳性率在0.5％～29.6％之间。为了进一步对Nanog阳性细胞的功能进行确认，排除其他因素如病毒随机整合导致的GFP异常表达，我们将Nanog阴性细胞所形成的移植瘤中GFP阳性和GFP阴性的细胞通过流式细胞仪分选出来，并分别进行小鼠皮下移植瘤注射，结果发现，1×103个阳性细胞全部成瘤，而1×102个阳性细胞成瘤率为50％，同样情况下1×103个阴性细胞成瘤率为50％，而1×102个阴性细胞无法成瘤(表1)。此外GFP阳性细胞的克隆形成效率和细胞球形成效率分别为38.8％和26.7％，分别显著高于GFP阴性细胞的23.8％和8.3％(p<0.01)(图2)。

[0108] 表1体内成瘤实验结果

[0109]

[0110] NanogNeg是指Nanog阴性细胞，NanogPos是指Nanog阳性细胞。

[0111] 为了进一步验证上述结论，即Matrigel能够诱导肝癌细胞转变为肝癌干细胞，利用Matrigel培养Nanog阴性细胞来模拟体内微环境。结果发现，与对照相比，Matrigel培养6天后Nanog阴性细胞中出现明显的GFP荧光，流式细胞仪检测显示有5.3％的阴性细胞发生了逆转(图3)。进一步对诱导形成的Nanog阳性细胞进行成球实验，采用未经诱导的普通筛选出的Nanog阳性细胞作为对照，结果显示，Matrigel诱导后逆转形成的Nanog阳性细胞中细胞球形成效率达到了20％以上，与普通经流式分选得到的Nanog阳性细胞基本一致，显微镜观察亦可以看出成球良好(图4)，表明经过Matrigel处理使Nanog阴性细胞发生逆转，也就是说，Matrigel具有诱导肝癌细胞逆转为肝癌干细胞的作用。

[0112] 需要说明的是，本实验没有列出的实验操作均属于本领域常规的技术手段，所采用的条件也是本领域常规采用的实验条件。

[0113] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。