VEGFR-3抑制剂用于治疗肝细胞癌的用途

摘要

本发明涉及血管内皮生长因子受体3用于治疗肝细胞癌(HCC)的用途。

权利要求

1.式(I)化合物或其可药用盐在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途：其中R为甲氧基或羟基。

2.权利要求1的用途，其中R为甲氧基。

3.权利要求1的用途，其中R为羟基。

4.权利要求1或2中任一项的用途，所述化合物为2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮。

5.权利要求1或3中任一项的用途，所述化合物为2-氨基-7-((3R)-3,4-二羟基-3-甲基-丁-1-炔基)-1-乙基-3-(1H-咪唑-2-基)-1,8-二氮杂萘-4(1H)-酮。

说明书

VEGFR-3抑制剂用于治疗肝细胞癌的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及血管内皮生长因子受体3用于治疗肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的用途。

背景技术

[0002] 肝细胞癌(HCC)全球第五常见的实体肿瘤且其发病率在25年中稳步上升(Thomas et al.Hepatocellular carcinoma:consensus recommendations of the National Cancer Institute Clinical Trials Planning Meeting.J Clin Oncol.2010；28(25):3994-4005)。HCC是一种致死性疾病，全球每年死亡人数超过600,000。未满足的需求极高，尤其是在亚太地区(Kudo et al.Asian consensus workshop report:expert consensus guideline for the management of intermediate and advanced hepatocellular carcinoma in Asia.Oncology 2011.81:158-64)。在中国，每年诊断约400,000新病例。他们中的大多数被诊断为晚期，仅有有限的治疗选择。只有20％适合手术，但复发率极高。迄今为止，只有索拉非尼，一种多激酶抑制剂，被批准用于HCC治疗。索拉非尼的OS(总生存期)大于安慰剂2-3个月，而且由于其高度伴随的毒性，少于5％的患者适合此药(Song et al.A single center experience of sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma patients:evaluation of prognostic factors.Eur.J.Gastroenterol Hepatol.2011(12):1233-8)。

[0003] 血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)是一种酪氨酸激酶受体，其识别两种配体VEGFC和VEGFD。HCC中肿瘤相关的淋巴管形成与不良预后和患者生存期有关(Thelen et al.Tumor-Associated Lymphangiogenesis Correlates with Prognosis after Resection of Human Hepatocellular Carcinoma.Ann.Surg.Oncol.(2009)16:1222–1230；Thelen et al.Tumor-associated angiogenesis and lymphangiogenesis correlate with progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.Am.J.Gastroenterol.105(5):1123-32,2010)。与正常肝样品相反，大多数HCC组织样品显示对VEGF-D的强免疫活性(Thelen et al.VEGF-D promotes tumor growth and lymphatic spread in a mouse model of hepatocellular carcinoma Int.J.Cancer:122,2471–24812008)。此外，临床试验数据表明在舒尼替尼(一种泛-VEGFR抑制剂)治疗后，基线时高水平的VEGF-C显著地与延长的OS相关(Harmon et al.Mechanism-related circulating proteins as biomarkers for clinical outcome in patients with unresectable hepatocellular carcinoma receiving sunitinib J.Transl.Med.2011Jul 25；9:120)。而且，据描述VEGFR-3的表达在>75％的乙型肝炎X抗原(HBxAg)阳性的HCC结节中上调且与HCC患者生存期反相关(Lian et al.Hepatitis B x Antigen Up-regulates Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3in Hepatocarcinogenesis.HEPATOLOGY,Vol.45,No.6,2007)。而且，可表达VEGFR-3的巨噬细胞浸润与肝内转移、肿瘤复发和不良的患者生存期相关。(Lin et al.Macrophage activation increases the invasive properties of hepatoma cells by destabilization of the adherens junction FEBS Letters 580(2006)3042–3050；
Zhu et al.High expression of macrophage colony-stimulating factor in peritumoral liver tissue is associated with poor survival after curative resection of hepatocellular carcinoma.J.Clin.Oncol.2008Jun 1；26(16):2707-16；
Ju et al.Peritumoral activated hepatic stellate cells predict poor clinical outcome in hepatocellular carcinoma after curative resection.Am.J.Clin Pathol.2009Apr；131(4):498-510)。然而，迄今为止，据报道尚无处于临床阶段的特异性VEGFR-3抑制剂用于治疗HCC。

[0004] 于2012年5月16日提交的国际申请PCT/EP2012/059145(‘145申请)，公开了式(I)化合物，其中R为甲氧基或羟基，为VEGFR-3抑制剂。现在发现式(I)化合物也可用于治疗HCC。

[0005]

[0006] 发明概述

[0007] 本发明涉及治疗肝细胞癌的方法，其包括向有此需要的患者给予药用有效量的式(I)化合物或其可药用盐：

[0008]

[0009] 其中R为甲氧基或羟基。

[0010] 本发明也涉及上述式(I)化合物或其可药用盐用于治疗肝细胞癌。

[0011] 本发明也涉及上述式(I)化合物或其可药用盐在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途。

[0012] 本发明的上述或其它方面、特征和优势可从以下详述的说明书结合附图更好地理解，所有这些仅作为本发明的解释而非限制。

附图说明

[0013] 图1显示实施例1的化合物在鼠肝细胞癌异种移植物模型中的体内评估结果。

[0014] 图2显示实施例1的化合物在化学诱导的肝细胞癌中的体内评估结果。

具体实施方式

[0015] 如上文以及本发明说明书通篇中所用，除非另有指示，否则应当理解以下术语具有以下含义：

[0016] “本发明的化合物”是指式(I)化合物或其可药用盐。

[0017] “肝细胞癌”是自肝细胞生成的一类肝癌。肝损伤，表现为肝硬化(瘢痕形成)，是肝癌的原发危险因素。然而，HCC还包括无肝硬化存在下的实体肝癌。

[0018] “患者”包括人和其它哺乳动物。

[0019] “可药用盐”指的是式I化合物的相对无毒的、无机的和有机的酸加成盐和碱加成盐。这些盐可在式I化合物的最终分离和纯化过程中原位制备。参见例如S.M.Berge,et al.,"Pharmaceutical Salts,"J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)。

[0020] “药用有效量”是指本发明化合物或组合物有效产生所需治疗作用的量。

[0021] “治疗”是指缓解症状、临时或永久地消除症状的原因或减缓所述疾病或病症的症状的出现。

[0022] 本发明的一个实施方案涉及治疗肝细胞癌的方法，其包括向有此需要的患者给予药用有效量的2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮或其可药用盐。

[0023] 本发明的另一个实施方案涉及化合物2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮或其可药用盐，其用于治疗肝细胞癌。

[0024] 本发明的一个实施方案涉及治疗肝细胞癌的方法，其包括向有此需要的患者给予药用有效量的2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮。

[0025] 本发明的另一个实施方案涉及化合物2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮，其用于治疗肝细胞癌。

[0026] 本发明的另一个实施方案涉及式(I)化合物或其可药用盐，其用于制备用于治疗肝细胞癌的药物，其中R为甲氧基或羟基。

[0027] 本发明的另一个实施方案涉及2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮或其可药用盐，其用于制备用于治疗肝细胞癌的药物。

[0028] 本发明的另一个实施方案涉及2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮，其用于制备用于治疗肝细胞癌的药物。

[0029] 本发明的一个方面提供将以药物组合物的形式给予的本发明化合物。本发明的药物组合物包含本发明的化合物和可药用载体。

[0030] 实际上，本发明的化合物可以按单位给药形式作为与常规药用赋形剂的混合物通过口服或静脉内途径给予至人和其它动物。

[0031] 适用于口服给药的本发明的药物组合物可以分离的单位存在，如固体剂型，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂(各自含有预定量的活性成分)或散剂或颗粒剂；液体剂型如溶液剂或在水性液体或非水性液体中的悬悬浮液或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。

[0032] 适用于静脉给予的本发明的药物组合物可在液体溶液中，特别是生理学上相容的缓冲液如Hank’s溶液或林格氏溶液中配制。此外，该组合物可配制成固体形式并在使用前即刻再溶或悬浮。还包括冻干形式。这些制剂是无菌的并且包括乳剂、悬浮液、水性和非水性注射溶液，其可含有混悬剂和增稠剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与预期接受者的血液等渗且具有适当调节的pH的溶质。

[0033] 本发明组合物中的活性成分的实际剂量水平是可变的从而获得有效地达成患者对特定组合物和给药方法的所需治疗应答的活性成分的量。因此，对于任何特定的患者，所选择的剂量水平取决于多种因素，包括所需的治疗作用，给药途径，所需的治疗持续时间，疾病的病因学和严重性，患者的状况、重量、性别、饮食和年龄，各活性成分的类型和效力，吸收速率，代谢和/或排泄以及其它因素。

[0034] 以单剂量或分剂量给药的本发明化合物的总日剂量可以是例如每天从约0.001至约100mg/kg体重的量，特别是0.01至10mg/kg/天。组合物中活性成分的百分比是可变的，但是活性成分应当构成一定的比例从而获得适当的剂量。单位剂量组合物可含有数分之一的量，其可用于组成日剂量。显然地，数个单位剂量形式可在约同一时间给药。剂量可根据需要尽可能频繁的给药从而获得所需的治疗作用。一些患者可迅速地对较高或较低剂量做出应答且可发现弱得多的维持剂量是足够的。对于其他患者，根据各特定患者的生理需要，可能需要以每天1至4剂的速率长期治疗。不用说，对于其他患者，将需要开具每天不超过一剂或两剂。

[0035] 参考以下非限制性实施例可以更好地理解发明，这些非限制性实施例是本发明的范例。然而，不应当将它们解读为限制本发明的范围宽度。

[0036] 实施例

[0037] 实施例1：

[0038] 2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮

[0039] 步骤1：6-氯-2-乙基氨基-烟酸

[0040] 在环境温度将18.0g(84.4mmol)2,6-二氯烟酸于180ml的乙胺溶液(70％于水中)中的溶液搅拌72小时。然后在减压下将过量的胺蒸发除去并添加10％的乙酸水溶液直至产物沉淀。将米黄色固体旋滤干燥，用冷水淋洗并在烘箱中干燥。获得10.5g预期的产物。熔点＝158-160℃。产率＝62％。

[0041] 步骤2：6-氯-2-乙基氨基-烟酰氟

[0042] 将2ml(24.8mmol)吡啶和4.2ml(49.8mmol)2,4,6-三氟三嗪添加至5.0g(24.8mmol)6-氯-2-乙基氨基-烟酸于125ml二氯甲烷中的悬浮液中。将混合物在环境温度搅拌3小时，然后过滤。将固体用50ml二氯甲烷淋洗并将滤液用60ml冰冷水洗涤2次。有机相经Na2SO4干燥并在减压下蒸发除去溶剂。获得5.01g橙色油状物形式的产物，其无需进一步纯化即使用。产率＝99％。

[0043] 步骤3：1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-甲醛

[0044] 通过用己烷搅拌3次将20.8g氢化钠于矿物油中的油性悬浮液(50％,0.52mol)洗涤至无矿物油并悬浮于400ml DMF中。在室温在搅拌下将50.0g(0.520mol)咪唑-2-甲醛添加至悬浮液中。在1.5h后，添加101ml(0.572mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯并再搅拌反应混合物1小时。然后向悬浮液中添加过量的水并将反应混合物用乙酸乙酯萃取3次。有机相经Na2SO4干燥并在减压下蒸发除去溶剂。然后将粗物质通过柱色谱(DCM)纯化，得到
85.0g(0.376mol)经SEM保护的咪唑-2-甲醛。产率＝72％。MH+＝227.1(C10H18N2O2Si,Mr＝
226.35)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ9.83(s,1H)；7.86(s,1H)；7.39(s,1H)；5.75(s,2H)；
3.58(t,2H)；0.95(t,2H)；0.02(s,9H)。

[0045] 步骤4：[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-乙腈

[0046] 将1.73g(8.84mmol)对甲苯磺酰基甲基异腈溶解于10ml DME中并冷却至-60℃。在该温度首先添加1.98g叔丁醇钾，然后缓慢添加2.00g(8.84mmol)1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-甲醛于5ml DME中的溶液。在-60℃搅拌2小时后，将反应混合物升温至0℃并向溶液中添加5ml甲醇(123.60mmol)。将反应混合物在环境温度再搅拌24小时并在40℃搅拌2小时。添加过量的水并将溶液用二氯甲烷萃取3次。有机相经Na2SO4干燥，在减压下蒸发溶剂后，粗物质经反相柱色谱(水0.1％TFA/乙腈＝80/20)纯化，得到0.87g(0.367mol)经SEM保护的咪唑-乙腈。产率＝41％。MH+＝238.1(C11H19N3OSi,Mr＝237,38)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ7.66(s,1H)；7.39(s,1H)；5.53(s,2H)；4.52(s,2H)；3.55(t,2H)；
0.92(t,2H)；0.02(s,9H)。

[0047] 步骤5：3-(6-氯-2-乙基氨基-吡啶-3-基)-3-羟基-2-[1-(2-(三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-丙烯腈

[0048] 向0.600g(2.53mmol)[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-乙腈于10ml无水THF中的0℃溶液中分小份添加0.283g(2.53mmol)叔丁醇钾。将混合物在环境温度搅拌45分钟，然后再次冷却至0℃。然后添加0.512g(2.53mmol)6-氯-2-乙基氨基-烟酰氟于10ml THF中的溶液并在环境温度搅拌媒介物过夜，再次冷却至0℃并添加第二当量的叔丁醇钾(0.283g,2.53mmol)。在环境温度搅拌2h后，添加50ml饱和的氯化铵水溶液，将pH用2N HCl调整至7，然后用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相经MgSO4干燥并在减压下蒸发溶剂。粗物质通过柱色谱(DCM/甲醇＝90:10)进一步纯化，得到418mg标题化合物(产率＝
38％)。MH+＝421(C19H26ClN5O2Si,Mr＝419,99)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ13.35(s,1H)；
7.70(d,1H)；7.46(s,1H)；7.23(s,1H)；7.08(t,1H)；6.58(d,1H)；5.59(s,2H)；3.58(t,2H)；
3.34(dq,2H)；1.13(t,3H)；-0.03(3s,9H)。

[0049] 步骤6：2-氨基-7-氯-1-乙基-3-[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮

[0050] 向418mg(1mmol)3-(6-氯-2-乙基氨基-吡啶-3-基)-3-羟基-2-[1-(2-(三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-丙烯腈于5ml无水THF中的溶液中分小份添加0.112g(1mmol)叔丁醇钾。将混合物在环境温度搅拌48h，然后添加50ml饱和氯化铵水溶液，将pH用2N HCl调整至7并将反应混合物用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相经MgSO4干燥并在减压下蒸发溶剂，得到400mg标题化合物。产率＝38％。MH+＝421(C19H26ClN5O2Si,Mr＝419,99)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.50(d,1H)；8.03(s,1H)；7.98(s,1H)；7.78(s,2H)；7.60(s,1H)；
5.49(s,2H)；4.58(q,2H)；3.57(t,2H)；1.42(t,3H)；0.85(t,2H)；-0.03(3s,9H)。

[0051] 步骤7：(±)-2-甲基-丁-3-炔-1,2-二醇

[0052] 将市售0.5M乙炔基氯化镁于四氢呋喃中的溶液用200ml四氢呋喃稀释并冷却至0℃。然后添加羟丙酮于200ml四氢呋喃中的溶液并将混合物在环境温度搅拌3小时。冷却反应混合物并添加NH4Cl水溶液。将混合物用乙酸乙酯萃取3次并合并有机相，经硫酸钠干燥，过滤并在真空(约200mbar)下浓缩。最后获得20g棕色油状物形式的预期产物，其无需进一步纯化即使用(定量粗产率)，为外消旋形式或可通过制备型HPLC在手性HPLC柱上分离纯的对映异构体。为了获得光学纯的对映异构体，相应的外消旋混合物经历在手性固定相(Chiralpak AD-H柱,250×21mm,5mm)上进行的制备型色谱，其使用以下流动相：CO2/2-丙醇(70％/30％)，流速60ml/min，压力100bar；或含0.3％TFA的异己烷/乙醇(70/30)混合物，流速120ml/min。

[0053] 在洗脱和蒸发后，分离各对映异构体并通过本领域技术人员已知的分析方法测定各对映异构体的化学纯度和对映异构体纯度。

[0054] 步骤8：2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮

[0055] 在用氩气填充的微波反应烧瓶中添加500mg(1.2mmol)2-氨基-7-氯-1-乙基-3-[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮、204mg(1.8mmol)(3R)-1-甲氧基-2-甲基-丁-3-炔-2-醇、84mg(0.120mmol)二(三苯基膦)二氯化钯(II)、30mg(0.16mmol)碘化亚铜(I)、2ml DMF(脱气的)和2ml三乙胺(脱气的)并在微波中以使反应混合物维持在120℃的方式照射24h。蒸发溶剂，将固体重新混悬于DMF中并过滤。然后将滤液通过HPLC纯化，得到430mg(0.702mmol)标题化合物的TFA盐。产率＝59％。MH+＝
498.2(C25H35N5O4Si,Mr＝497,67)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.39(d,1H)；7.95(s,1H)；
7.88(s,1H)；7.60(s,2H)；7.48(d,1H)；5.25(s,2H)；4.50(宽信号,2H)；3.52-3.40(宽信号,水峰+4H)；1.48(s,3H)；1.25(t,3H)；-0.12(3s,9H)。

[0056] 步骤9：2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3-羟基-4-甲氧基-3-甲基-丁-1-炔基)-3-(1H-咪唑-2-基)-1H-[1,8]二氮杂萘-4-酮

[0057] 在0℃将240mg(0.4mmol)经SEM保护的二氮杂萘酮溶于1.2ml TFA和1.2ml DCM中。将溶液维持在3-5℃过夜直至分析型HPLC显示二氮杂萘酮完全脱保护。溶液通过添加过量的NaHCO3水溶液中和。然后将混合物用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相经MgSO4干燥并在减压下蒸发除去溶剂。将如此获得的粗物质在硅胶上纯化(DCM:MeOH＝4:1)，得到143mg(定量产率)脱保护的标题化合物。MH+＝368.2(C19H21N5O3,Mr＝367,41)。1H NMR(DMSO-d6,
500MHz):δ13.15(s,1H)；11.55(bs,1H)；8.59(d,1H)；8.10(bs,1H)；7.47(d,1H)；7.25(s,
1H)；7.02(s,1H)；5.85(s,1H)；4.58(宽信号,2H)；3.51-3.370(宽信号,水峰+4H)；1.48(s,
3H)；1.25(t,3H)。Rt(分析型HPLC):4.806min。

[0058] 实施例2：

[0059] 2-氨基-7-((3R)-3,4-二羟基-3-甲基-丁-1-炔基)-1-乙基-3-(1H-咪唑-2-基)-1,8-二氮杂萘-4(1H)-酮

[0060] 步骤1：2-氨基-1-乙基-7-(3,4-二羟基-3-甲基-丁-1-炔基)-1-乙基-3-[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-1,8-二氮杂萘-4(1H)-酮

[0061] 根据实施例1步骤8的操作，使用实施例1步骤6所描述的中间体(2-氨基-7-氯-1-乙基-3-[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-1,8-二氮杂萘-4(1H)-酮)和实施例1步骤7的中间体((±)-2-甲基-丁-3-炔-1,2-二醇)，获得标题化合物。MH+＝354.16(C18H19N5O3,Mr＝353,38)。Rt(分析型HPLC):4.48min。

[0062] 步骤2：2-氨基-1-乙基-7-((3R)-3,4-二羟基-3-甲基-丁-1-炔基)-1-乙基-3-[1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)-1H-咪唑-2-基]-1,8-二氮杂萘-4(1H)-酮

[0063] 步骤1获得的外消旋化合物经历制备型手性SFC纯化，其使用以下方法：Berger制备型SFC，在230nm进行UV检测，固定相为Chiralpak IC 20×250nm5μm，流动相为65％/35％CO2/(MeOH+0.5％异丙胺)，50ml/min，100巴，使R和S对映异构体得以分离。

[0064] 手性纯度如下控制：使用手性SFC方法，Berger SFC，在210nm进行UV检测，固定相为Chiralpak AD-H(250mm×4.6)5μm，流动相为65/35％CO2/(异丙醇+0.5％异丙胺)，2.4ml/min，100巴。

[0065] R对映异构体(Rt＝6.9min且对映异构体纯度＝97.9％)

[0066] 步骤3：2-氨基-7-((3R)-3,4-二羟基-3-甲基-丁-1-炔基)-1-乙基-3-(1H-咪唑-2-基)-1,8-二氮杂萘-4(1H)-酮

[0067] 根据实施例1步骤9的操作，分离到实施例2的化合物，其为黄色粉末。MH+＝354.16(C18H19N5O3,Mr＝353,38)。Rt＝0.77min。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ13.15(s,1H)；11.55(bs,1H)；8.55(d,1H,J＝6.4Hz)；8.10(bs,1H)；7.47(d,1H,J＝6.4Hz)；7.15(s,1H)；7.02(s,1H)；5.6(s,1H)；5.1(t,1H,J＝6.4Hz)4.53(bd,2H)；3.49(dd,1H,J＝6.4；10.4Hz)；3.41(dd,1H,J＝6.4；10.4Hz)1.48(s,3H)；1.27(t,3H,J＝7.2Hz)。

[0068] 手性纯度如下控制：使用手性SFC方法，Berger SFC，在230nm进行UV检测，固定相为Chiralpak AD-H(250mm×4.6)5μm，流动相为60/40％CO2/(异丙醇+0.5％异丙胺)，2.4ml/min，100巴。

[0069] R对映异构体(Rt＝8.37min且对映异构体纯度＝99.2％)。

[0070] 分析方法：LC/UV/MS保留时间(Rt)检测

[0071] 柱：Merk Chromolith performance RP18e,100×4.6mm,3.5μm

[0072] 溶剂A：H2O/TFA(99.9/0.1)

[0073] 溶剂B：ACN/TFA(99.9/0.1)

[0074] 流速：2ml/min

[0075] 梯度(A/B)：98/2(0min)至0/100(8min)至98/2(10min)

[0076] 检测：254.16nm

[0077] NMR

[0078] 使用NMR光谱仪Bruker 250、300、400或600MHz于DMSO-d6中获得1H NMR谱，其使用DMSO-d5的峰作为内标。化学位移δ以百万分数(ppm)表示。

[0079] 所观测的信号如下表示：s＝单峰；d＝二重峰；t＝三重峰；q＝四重峰；m＝多重峰或大单峰；br＝宽峰；H＝质子。

[0080] 熔点

[0081] 熔点用Kofler工作台测量。

[0082] 药理学测试

[0083] I.实施例1的化合物的体外评估

[0084] ‘145申请公开了实施例1和2的化合物在HEK细胞中抑制重组VEGFR-3TK的活性和自磷酸化，其中IC50分别为约25nM和47nM。在同一测定中，实施例1的化合物展现出对VEGFR-2(90nM-140nM)和VEGFR-1(>1μM)的较小活性。使用原代淋巴细胞，我们确认了对VEGFR-3的高活性，这是因为其抑制了VEGFC和VEGFD所诱导的增殖，其中IC50为约10-15nM。另外，我们证实与所有其它所测试的激酶(85种不同的激酶)和107种受体、酶和离子通道相比，实施例
1的化合物对VEGFR-3具有高度选择性。

[0085] II.实施例1的化合物在鼠肝细胞癌异种移植物模型中的体内评估

[0086] 评估实施例1的化合物在HepG细胞系原位异种移植物模型中的体内抗肿瘤效力。将HepG2细胞注射至SCID小鼠(自ATCC获得)的肝中并在细胞注射后14天将小鼠随机分成2组：用媒介物治疗的对照组和用实施例1的化合物治疗的治疗组。治疗以100mg/kg(在作为媒介物的甲基纤维素吐温中)每天进行一次。

[0087] 在第28天通过称重带有肿瘤的肝叶来测量肿瘤大小。用实施例1的化合物进行的治疗在细胞注射后第28天使带有肿瘤的肝叶的平均重量显著减少34％(p＝0.001,学生t检验)。正常肝叶也被测量并由带有肿瘤的小鼠的肝叶进行推断。在该情况下，实施例1的化合物使肿瘤重量减少62％。(参见图1)。

[0088] III.实施例1的化合物对小鼠中化学诱导的肝细胞癌的作用的体内评估[0089] DEN(N-二乙基亚硝胺)所诱导的小鼠模型已被验证为人HCC的代表性模型(Wu et al.J.Cancer Res.Clin.Oncol.2009,135969-981；Chuang et al.Carcinogenesis(2000)21；331-335)。

[0090] 如下引发肿瘤：对5周龄雄性C3H小鼠(Charles river laboratories France)单次腹膜内注射10mg/kg N-二乙基亚硝胺(DEN)。

[0091] 小鼠自给予DEN后第7个月在肝内形成肿瘤，但在第12个月发生率达到100％。在给予DEN后第10个月至第12个月每天P.O.(口服)给予悬浮于甲基纤维素吐温中的实施例1的化合物。

[0092] 在治疗期间和第12个月每周评估体重。小鼠用过剂量的苯巴比妥钠处死且取出肝脏并称重。计数每个肝脏的肿瘤数目并用测径器测量肿瘤体积。肿瘤体积V使用公式V＝0.52×a2×b计算，其中“a”表示最小肿瘤直径且“b”表示最大肿瘤直径。

[0093] 当在第10个月对相同参数进行比较时，用实施例1的化合物进行的后期治疗预防了新疾病位点的形成并完全阻断了肿瘤的发展。与媒介物组相比，实施例1的化合物使每个肝脏的肿瘤数目减少了50％且使总肿瘤体积减少了85％。其还降低并几乎正常化了总肝脏重量。(参见图2)。