重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶

摘要

本发明涉及生物制品领域，特别是一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。所述凝胶的组分及用量为：重组牛碱性成纤维细胞生长因子20000-22000IU，人血白蛋白0.8-1.5mg，卡波姆20-30mg，甘油100-120mg，pH调节剂适量，注射用水加至5ml。本发明凝胶剂中的凝胶基质配伍合理，易涂布、延展性好，细腻均匀、对皮肤无刺激，保湿效果好和易于皮肤吸收；而且该凝胶剂稳定性高，药效持久，质量有保障，能更加有效地促进创面愈合，修复创伤皮肤；有利于该重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的推广和应用。

权利要求

1.一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，其特征在于，所述凝胶的组分及用量为：重组牛碱性成纤维细胞生长因子 21000IU ；

人血白蛋白 1mg ；

卡波姆 25 mg ；

甘油 110 mg ；

pH 调节剂 适量；

注射用水 加至5ml ；

其中，所述的pH 调节剂为氢氧化钠或三乙醇胺。

2.根据权利要求1所述的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备方法，其特征在于包含以下步骤：（1）将注射用水倒入不锈钢桶中，搅拌下加入处方量的卡波姆和甘油，溶胀过夜，得卡波姆溶液备用；

（2）将处方量的pH 调节剂加入步骤（1）中得到的卡波姆溶液，调节pH 值为6.5-7.5 后搅拌均匀，倒入稀配罐；

（3）加入适量注射用水荡洗不锈钢桶，荡洗后的注射水一并倒入稀配罐，在121℃热压下灭菌30min，冷却至37℃得透明凝胶备用；

（4）将处方量重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中，用0.22μm 滤膜过滤除菌；

（5）在无菌条件下将步骤（3）得到的透明凝胶和步骤（4）得到的溶液混合均匀，分装即得。

说明书

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制品领域，特别是涉及一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。

背景技术

[0002] 皮肤是人体面积最大的器官，因为其具有阻挡异物和病原体侵入，防止体液流失等功能，从而起到重要的屏障保护作用。皮肤还具有感觉、保护、调解体温等重要生理功能，以维持机体和外界环境的对立和统一，同时皮肤又是机体免疫系统的重要组成部分。任何原因造成皮肤连续性被破坏以及确实性损伤，若不及时修复，则会产生创面的急慢性感染及其相应的并发症，给患者的身体和精神的造成巨大的影响。

[0003] 传统的皮肤创面修复一般采用自体组织移植、异体组织移植、应用人工替代物和组织工程皮肤等方法。自体组织或器官移植虽然具有良好的修复治疗效果，但是面临供体来源缺乏、需二次手术等条件的制约；异体、异种移植不仅面临供体来源少的限制，而且存在引起免疫排斥反应、传播病原等风险；人工替代物则仅能起到有限的组织或器官的修复或填充作用；组织工程皮肤虽然具有易获得，体外可保存时间长，有防止细菌侵入和水分丢失的屏障功能的优势，但是由于原代培养的人体组织细胞的增殖能力有限及动物细胞可能引起免疫排斥反应等问题，难以满足临床需求。因此，研究出一种有效修复皮肤创伤的方法是临床亟需解决的难题。

[0004] 碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，简写为bFGF）又称为真皮生长因子，主要存在与表皮基底的角质形成细胞内，是重要的促细胞有丝分裂因子和血管生成因子，对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性，能促进细胞增殖、生长、分化，促进血管新生，改善细胞生活为环境，促进受损神经再生及血管、肌肉、皮肤等修复，减少紫外线辐射对皮肤造成的损害，是神经细胞营养和再生因子。大量基础研究和临床试验证实，bFGF能够作用于皮肤的不同层面，全面促进细胞再生，增加皮肤自身的免疫功能，改善循环，促进皮肤新陈代谢，使皮肤达到最佳生理功能状态，修复受损皮肤。

[0005] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子（Recombinant bovine basic fibroblast growth factor，简写为rb-bFGF）是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后得到的活性因子。经研究发现，rb-bFGF可促进创面愈合，用于烧烫伤创面、慢性创面和新鲜创面等创伤肌肤。

[0006] 中国专利CN102357242B公开了一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，该生长因子凝胶的凝胶基质为羟丙基甲基纤维素和卡波姆，该凝胶剂稳定性好和释放性好的优点，但是，该凝胶剂的凝胶基质中的羟丙基甲基纤维素溶于水后有轻微乳光，而且在热水中溶解度较小，易析出，含有羟丙基甲基纤维素的凝胶基质不适合高温灭菌，该凝胶剂对创伤肌肤存在一定的安全性，而且还会影响该凝胶剂的延展性，不利于患者使用。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题对现有的bFGF凝胶剂安全性较低、延展性差的缺陷，本发明的目的提供一种稳定性好、无刺激性，保湿效果好和易吸收的的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。

[0008] 本发明的发明目的通过以下的实施方式来实现。

[0009] 本发明的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，所述凝胶的组分及用量为：

[0010] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 20000-22000 IU；

[0011] 人血白蛋白 0.8-1.5 mg；

[0012] 卡波姆20-30mg；

[0013] 甘油100-120mg；

[0014] pH调节剂 适量；

[0015] 注射用水 加至5 ml；

[0016] 其中，所述的pH调节剂为氢氧化钠或三乙醇胺。

[0017] 本发明的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，所述凝胶的组分及用量优选为：

[0018] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 21000IU；

[0019] 人血白蛋白 1mg；

[0020] 卡波姆25 mg；

[0021] 甘油110 mg；

[0022] pH调节剂 适量；

[0023] 注射用水 加至5ml；

[0024] 其中，所述的pH调节剂为氢氧化钠或三乙醇胺。

[0025] 另外，本发明还提供一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备方法，包含以下步骤：

[0026] （1）将注射用水倒入不锈钢桶中，搅拌下加入处方量的卡波姆和甘油，溶胀过夜，得卡波姆溶液备用；

[0027] （2）将处方量的pH调节剂加入步骤（1）中得到的卡波姆溶液，调节pH值为6.5-7.5后搅拌均匀，倒入稀配罐；

[0028] （3）加入适量注射用水荡洗不锈钢桶，荡洗后的注射水一并倒入稀配罐，在121℃热压下灭菌30min，冷却至37℃得透明凝胶备用；

[0029] （4）将处方量重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；

[0030] （5）在无菌条件下将步骤（3）得到的透明凝胶和步骤（4）得到的溶液混合均匀，分装即得。

[0031] 本发明的卡波姆基质是一种水性凝胶基质，能耐受低温贮存和高温湿热灭菌的作用，延展性好，易于涂抹，而且有良好的生物相容性，对眼睛和皮肤没有刺激，同时，添加甘油的卡波姆基质能促进皮肤的吸收，大大增加其保湿效果，湿润的环境更有利于伤口的愈合，从本发明的实施例7的延展性和保湿性试验证明本发明的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶是延展性高，保湿效果高的凝胶剂，促进皮肤受创者的修复和愈合，利于该凝胶重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的推广和应用。

[0032] 本发明通过试验例8对豚鼠的烫伤创面愈合试验得出，本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶可明显降低豚鼠背部烫伤皮肤结痂及愈合的时间，促进烫伤皮肤的愈合，减少愈合时间，说明本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶对烫伤创面愈合有显著促进作用。

[0033] 本发明通过试验例9的临床试验可以得出，从Ⅰ度烧烫伤治疗效果看，治疗1组的治愈率为100%，16位临床志愿者均不留疤痕；浅Ⅱ度烧烫伤治疗效果看，治疗4组的治愈率为92.14%，由于治疗5组和治疗6组的治愈率，而治疗4组的疤痕率仅为3.86%，与治疗5组和治疗6组相比，显著降低了其疤痕率，证明本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶在提高治愈率和烧伤后的留疤问题方面取得了预料不到的技术效果。

[0034] 总之，本发明与现有技术相比，具有以下的优点和效果：

[0035] ①本发明凝胶剂中的凝胶基质配伍合理，易涂布、延展性好，细腻均匀、对皮肤无刺激，保湿效果好和易与皮肤吸收；

[0036] ②本发明的凝胶剂稳定性高，药效持久，质量有保障，能更加有效地促进创面愈合，缩短结痂时间，降低疤痕率；

[0037] ③本发明凝胶剂使用方便、经济实用，增加了病人的依从性。

具体实施方式

[0038] 下面结合本发明较佳的实施例做进一步的说明，这些实施例应理解为不会限制本发明的实施范围，其变型及等同方式均被涵盖在本发明的保护范围内。

[0039] 实施例1、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备

[0040] 处方：

[0041] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 21000000IU；

[0042] 人血白蛋白 1.0 g；

[0043] 卡波姆 25g；

[0044] 甘油 110g；

[0045] 三乙醇胺 适量；

[0046] 注射用水加至5000 ml；

[0047] 共制1000支

[0048] 制备工艺如下：

[0049] （1）将注射用水倒入不锈钢桶中，搅拌下加入处方量的卡波姆和甘油，溶胀过夜，得卡波姆溶液备用；

[0050] （2）将处方量的三乙醇胺加入步骤（1）中得到的卡波姆溶液，调节pH值为6.5-7.5后搅拌均匀，倒入稀配罐；

[0051] （3）加入适量注射用水荡洗不锈钢桶，荡洗后的注射水一并倒入稀配罐，在121℃热压下灭菌30min，冷却至37℃得透明凝胶备用；

[0052] （4）将处方量重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；

[0053] （5）在无菌条件下将步骤（3）得到的透明凝胶和步骤（4）得到的溶液混合均匀，分装即得。

[0054] 实施例2、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备

[0055] 处方：

[0056] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 20000000IU；

[0057] 人血白蛋白 0.8 g；

[0058] 卡波姆 20g；

[0059] 甘油 100g；

[0060] 氢氧化钠 适量；

[0061] 注射用水加至5000 g；

[0062] 共制1000支

[0063] 制备工艺如实施例1。

[0064] 实施例3、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备

[0065] 处方：

[0066] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 22000000IU；

[0067] 人血白蛋白 1.5 g；

[0068] 卡波姆 30g；

[0069] 甘油 120g；

[0070] 氢氧化钠 适量

[0071] 注射用水加至5000 g；

[0072] 共制1000支

[0073] 制备工艺如实施例1。

[0074] 对比例4、一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备

[0075] 处方：

[0076] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 28000000 IU；

[0077] 人血白蛋白 2.4 g；

[0078] 羟丙基甲基纤维素 10 g

[0079] 氢氧化钠 适量

[0080] 注射用水加至5000 g；

[0081] 共制1000支

[0082] 制备工艺如实施例1。

[0083] 对比例5、一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备

[0084] 处方：

[0085] 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 18000000IU；

[0086] 人血白蛋白 2.0 g；

[0087] 卡波姆 25 g；

[0088] 氢氧化钠 适量；

[0089] 注射用水加至5000 g；

[0090] 共制1000支

[0091] 制备工艺如实施例1。

[0092] 试验例6、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶长期稳定性试验[0093] 将实施例1制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶灌装于内涂层封口铝管中，密封置于2℃～8℃下进行实验，分别于第0个月、1个月、3个月、6个月、9个月、12个月末、18个月末检测凝胶的外观、装量、pH值、生物学活性（%）和无菌检查。结果如下表：

[0094] 表1、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶稳定性试验

[0095]

[0096]  由表1数据得出，本发明的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，在2℃～8℃下，18个月内各项指标符合标准，说明本发明的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶稳定性高，利于该重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的工业化生产和应用。

[0097] 试验例7、重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的延展性和保湿性试验[0098]  1、试验材料

[0099] 1.1、试验用药：本发明实施例1制备的生长因子凝胶，对比例4制备的生长因子凝胶和对比例5制备的生长因子凝胶。

[0100] 1.2、受试者：筛选出烧烫伤愈合后留有疤痕，无皮肤病过敏史的50名志愿者进行试验。

[0101]  2、试验方法

[0102]  2.1、延展性的试验方法：将实施例1、对比例4和对比例5制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶在垫板的0刻度处挤出0.02mL凝胶剂(只有米粒大)，使用涂布棒拖曳，测定其拖拽长度。

[0103]  2.2、保湿性的试验方法：先采用水分检测仪测试50名志愿者的烧伤愈合后留有疤痕位置的初始水分值，然后将实施例1、对比例4和对比例5制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶涂抹在烧伤愈合后留有疤痕位置，分析水份值的差值大小评价生长因子凝胶的保湿性，其中肌肤水分值上升率=涂药后的水分值百分率 —初始水分值百分率。

[0104]  3、试验结果

[0105]  试验结果如表2所示，拖拽长度为50名志愿者的平均拖拽长度，肌肤水分值上升率为50名志愿者的平均肌肤水分值上升率。

[0106] 表2 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的延展性和保湿性试验结果[0107]  由表2可知，本发明的的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的延展性和保湿性均优于对比例4和对比例5，说明本发明的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶是延展性高，保湿效果高的凝胶剂，促进皮肤受创者的修复和愈合，利于该凝胶重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的推广和应用。

[0108]  试验例8、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶对烫伤创面愈合的影响试验

[0109] 1、试验材料

[0110]  1.1、试验动物：豚鼠，雌雄各半，体重280-300g；

[0111]  1.2、试验药物：本发明实施例1制备的重组牛碱性成纤维细胞生长生长因子凝胶，对照药物：对比例4制备的重组牛碱性成纤维细胞生长生长因子凝胶。

[0112] 2、试验方法

[0113]  造模：豚鼠在试验期间均正常饮水，普通饮食，于试验前24h将豚鼠背部脱毛4cm*4cm。用80℃恒温水通过一玻璃圆筒分别烫伤豚鼠背部皮肤，造成II度烫伤模型。豚鼠造模后随机分为空白组、治疗组和对照组，每组各10只。治疗组和对照组每日分别给予相应药物
4次，单独饲养，连续7天。观察创面愈合情况，记录皮肤结痂时间和创面愈合时间。

[0114] 3、试验结果

[0115]  采用方差分析对试验结果进行统计学处理，以X±S表示，试验结果如下：

[0116]  表3 各组豚鼠烫伤创面愈合结果比较（X±S）

[0117]

[0118] 与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05。

[0119] 由以上结果表明，本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶可明显降低豚鼠背部烫伤皮肤结痂及愈合的时间，且愈合程度较对照组更明显，说明本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶对烫伤创面愈合有显著促进作用。

[0120] 试验例9、本发明重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶治疗烧烫伤临床志愿者的试验研究

[0121] 1、试验资料

[0122] 1.1一般资料

[0123] 选取珠海市烧烫伤的临床志愿者102例，男52例，女50例，年龄15～68岁，平均年龄27岁；按照烧烫伤原因分为：沸水烫伤30例，火焰烧伤37例，蒸汽烫伤30例，化学性烧伤5例；
按照烧烫伤程度分为：Ⅰ度烧烫伤48例，浅Ⅱ度烧烫伤52例。

[0124] 1.2分组与给药方法

[0125] Ⅰ度烧烫伤临床志愿者48例，分为3组，每组16人，具体给药方法如下：

[0126] 治疗1组：外涂实施例1制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶；

[0127] 治疗2组：外涂对比例4制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶；

[0128] 治疗3组：外涂对比例5制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶。

[0129] 浅Ⅱ度烧烫伤临床志愿者54例，分为3组，每组18人，具体给药方法如下：

[0130] 治疗4组：外涂实施例1制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶；

[0131] 治疗5组：外涂对比例4制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶；

[0132] 治疗6组：外涂对比例5制备的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶。

[0133] 2、治疗方法

[0134] 在无菌操作下，将烫烧伤的创面常规消毒，先用生理盐水简单清洗创面，清除附着物及脱落皱皮，张力高的水疱穿刺放液，尽量保持残留上皮，剪除脱落或坏死表皮，感染创面行彻底清创，向创面外涂或喷洒相应的药液，白天每3小时1次，每天涂药4次。用药后充分暴露创面，不可覆盖，防止进水，冬天注意保暖。

[0135] 痊愈疗效标准：用药后肿胀消失，疼痛感消失，创面无感染，痂下愈合，有表皮生长，创面基本修复或全部修复。用药后记录15d内痊愈人数，计算7d治愈率，7d治愈率=7d内痊愈人数/病例总人数×100%；定义创面完全上皮化所需的时间为愈合时间，记录每例临床志愿者的愈合时间，并对愈合时间进行t检验比较；记录烧烫伤临床志愿者的创面疤痕情况，记录留下疤痕的临床志愿者例数，计算疤痕率，疤痕率=留下疤痕的临床志愿者例数/病2 2
例总人数×100% ；应用统计软件SPSS 11.0进行各治疗组治愈率和疤痕率的 χ检验。若χ>χ20.05,1=3.84，以p<0.05具有统计学差异性。结果见表4。