一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用转让专利
申请号 : CN201510098635.4
文献号 : CN104611243B
文献日 : 2017-07-18
发明人 : 孙漫红 , 孙占斌 , 李世东
申请人 : 中国农业科学院植物保护研究所
摘要 :
本发明公开了一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用，该工程菌株命名为Cr‑per44，在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.10028，该工程菌株通过原生质体转化，将寄生相关基因‑脂滴包被蛋白基因Per3转入粉红螺旋聚孢霉HLD‑1菌株中获得，本发明的工程菌株Cr‑per44抗病性能强、防效稳定，能够有效防治农作物菌核病和灰霉病，同时对枯萎病、根腐等多种植物真菌病害也有较好的防治作用。
权利要求 :
1.一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-per44，其特征在于，在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.10028。
2.如权利要求1所述的工程菌株Cr-per44在制备微生物杀菌剂中的应用。
3.一种菌剂，其特征在于：该菌剂的组分包括权利要求1所述的工程菌株Cr-per44。
4.一种如权利要求3所述的菌剂的制备方法：
首先将重组菌株Cr-per44在PDA平板上培养，切取菌块，然后将切取的菌块置于PD培养液上振荡培养，最后向培养液中加入悬浮剂和展着剂，获得液体菌剂。
5.如权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述振荡培养的条件为：在摇床上转速180r/min，温度28℃，培养时间2～3d。
6.如权利要求3所述的菌剂在防治农作物菌核病、灰霉病、枯萎病和根腐中的应用。
说明书 :
一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其
应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程和生物防治技术领域，具体地说是一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株。
背景技术
[0002] 粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea，原名：粉红粘帚霉Gliocladium roseum，是一类重要的菌寄生菌，可通过缠绕、穿刺等方式侵染核盘菌、灰葡萄孢、镰刀菌和丝核菌等多种植物病原真菌，同时还可以产生抑菌物质抑制病原菌的生长，促进植株生长，诱导植物抗性，因而具有巨大的生防潜力。但现有技术中缺乏高致病力菌株、缺少优良菌株规模化培养技术是制约其在植物病害防治领域广泛应用的关键因素。
[0003] 现有技术表明脂酶类在植物抗病中起重要作用，其中脂滴包被蛋白是一类调节脂肪代谢的磷蛋白，它的调节是一种双向调控代谢，在基础状态下脂滴包被蛋白蛋锚定于脂滴表面作为生理屏障，防止被胞浆内的脂酶水解；在缺乏能量的特殊情况下受到脂解刺激，脂滴断裂，形成许多小脂滴，总表面积增大，但脂滴包被蛋白数量没有明显的增加，因此脂滴包被蛋白的保护作用相对减弱，使得脂滴分解。在金龟子绿僵菌侵染蝗虫研究中，脂滴包被蛋白通过调节脂滴代谢来影响附着胞的膨压，该基因缺失突变株中脂滴由于失去了脂滴包被蛋白的保护作用而被分解，最终导致突变株附着胞膨压减小及附着胞畸变，从而降低了对蝗虫表皮的穿透能力。
[0004] 粉红螺旋聚孢霉菌株HLD-1是一种高效菌寄生菌，中国微生物菌种保藏中心保藏编号CGMCC No.1037，对菌核的寄生率能够达到100％，并且对灰霉病菌、立枯丝核菌和镰刀菌等病原真菌也表现出强烈的寄生作用和明显的抑制作用，但存在防效不稳定的问题，通过遗传改良进一步提高该生防菌株抗病性能具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明目的在于提供一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用，解决现有技术中缺乏高致病力菌株以及现有粉红螺旋聚孢霉防效不稳定的问题。
[0006] 一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-per44，在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.10028，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 上述工程菌株Cr-per44的培养特征为：在PDA培养基上生长较快，26℃下培养10d菌落直径可达8～9cm，见图1。菌落毡状，初始为白色，产孢后逐渐变成灰绿色。适宜的生长、 产孢温度为25～28℃，最适pH值为6～7，且对光照较为敏感。镜检形态为：菌丝无色、分隔，分生孢子梗直立，可产生2～3级帚状分枝，瓶梗顶端产生大量分生孢子，聚集成球状。孢子卵形或圆柱形，直径3～5μm。
[0008] 上述工程菌株Cr-per44的构建方法为：
[0009] 1)酶切pAN7-1载体获取线性化pAN7-1载体，将线性化pAN7-1载体与脂滴包被蛋白目的片段融合拼接，获得转化载体；
[0010] 2)对粉红螺旋聚孢霉HLD-1菌株进行培养，筛选收集幼龄菌丝，将幼龄菌丝与蜗牛酶进行混合酶解，过滤并离心，收集原生质体沉淀物，用STC溶液溶解后获取原生质体溶液；
[0011] 3)将转化载体与原生质体溶液混合静置，通过液体培养基TB3进行复苏，振荡培养，离心去除上清液，通过STC溶液悬浮沉淀后，与TB3培养基混合后倒板培养，获得稳定遗传的转化子，从中挑取阳性转化子。
[0012] 上述挑取阳性转化子的方法为：提取稳定遗传的转化子RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增后采用琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性转化子。
[0013] 上述工程菌株Cr-per44在制备微生物杀菌剂中的应用。
[0014] 一种含有上述工程菌株Cr-per44的菌剂。
[0015] 上述含有工程菌株Cr-per44的菌剂的制备方法：
[0016] 首先将重组菌株Cr-per44在PDA平板上培养，7～10d后切取菌块，然后将切取的菌块置于PD培养液上振荡培养，最后向培养液中加入悬浮剂和展着剂，获得液体菌剂。
[0017] 上述菌剂制备方法中的振荡培养的条件为：在摇床上转速180r/min，温度28℃，培养时间2～3d。
[0018] 上述菌剂在防治农作物菌核病、灰霉病、枯萎病和根腐中的应用。
[0019] 本技术通过原生质体转化，将寄生相关基因-脂滴包被蛋白基因Per3转入粉红螺旋聚孢霉HLD-1菌株中，获得了转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，该重组菌株Cr-per44抗病性能强、防效稳定，能够有效防治农作物菌核病和灰霉病，同时对枯萎病、根腐等多种植物真菌病害也有较好的防治作用。
附图说明
[0020] 图1Cr-per44菌株在PDA培养基上培养10d的菌落形态。
[0021] 图2HLD-1菌株和Cr-per44菌株对核盘菌菌核的侵染情况(5d)。
具体实施方式
[0022] 下面的实施例对本发明技术方案做进一步的补充说明，但对本发明没有限制。
[0023] 脂滴包被蛋白基因全长1284bp，包含555bp的开放阅读框，GenBank登录号KF269990。
[0024] 实施例1
[0025] 脂滴包被蛋白转化载体的构建
[0026] 分别利用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit试剂盒，对脂滴包被蛋白基因cDNA序列片段进行3′RACE和5′RACE扩增，将两段扩增产物克隆到pMD19-T载体，测序，拼接，获得Per3全长cDNA，并进行PCR验证；使用特异引物Per3F：5′-3′GAAACTTCTCTTTCGTCTCTATCGA和Per3R：CTTGCAAGCACAGAAAGAAAATCAA进行扩增获得Per3基因全长，GenBank登录号KF269990；
[0027] 转化载体选用pAN7-1真核表达载体(由中国科学院微生物所提供)，含有真核启动子基因gpda、潮霉素抗病标记基因hph以及终止子基因trpC。采用PCR扩增启动子、终止子和脂 滴 包 被 蛋 白 基 因 片 段 ，引 物 分 别 为 ：( 5 ′- 3 ′) g p d a F ：ACTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGAATTCCCTTGTATCTCTACACA，gpdaR：
ACCAATCCAAAAGCCTACTCTGAAGGGAAAAGAAAGAGAAAAGAAAAG，trpCF：
TGTGATTATGAGCAAATATGGGGTGGATCCACTTAACGTTACTGAAA，trpCR：
GTAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG，Per3F：
GAAACTTCTCTTTCGTCTCTATCGA，Per3R：(CTTGCAAGCACAGAAAGAAAATCAA。反应体系为50μl，包含1μl模板，1μl上下游引物，0.5μl高保真PCR聚合酶(TransStart FastPfu Fly DNA ploymerase)，10μl Buffer，5μl dNTPs以及31.5μl ddH2O。PCR过程为：95℃预变性5min，按以下步骤进行35个循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。最后在72℃下保持
10min，结束扩增反应。琼脂糖凝胶电泳后将片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收。
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10min，结束扩增反应。琼脂糖凝胶电泳后将片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收。
[0028] 将载体pAN7-1用HindIII酶切。酶切体系为：质粒30μl，HindIII 1μl，Buffer 4μl以及ddH2O 5μl。反应条件为37℃、1h。酶切后使用PCR纯化试剂盒对产物进行纯化，得到线性的pAN7-1载体。
[0029] 使用核酸定量仪测定回收的启动子片段、脂滴包被蛋白片段、终止子片段，以及线性pAN7-1片段浓度，将浓度调整至载体与各插入片段最佳摩尔比为1∶2。将4个片段置于10μl融合反应体系进行融合，体系中包括按比例添加的线性载体和各插入片段、2×融合Mix 5μl，ddH2O补齐。轻轻混合，50℃反应15min，放置于冰上冷却数秒，将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞Transl-T1中，37℃下氨苄抗性LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯 化钠10g/L)中培养过夜。挑选阳性克隆进行PCR鉴定和重组质粒酶切鉴定，并将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，确保片段插入的正确性。重组质粒命名为：pAN7-1-per3。
[0030] 实施例2
[0031] 重组载体pAN7-1-per3的转化
[0032] 将粉红螺旋聚孢霉HLD-1接种到PDA培养基上培养10d，加入5ml无菌水洗脱孢子，吸取1ml接种于PD培养液中，26℃，160r/min振荡培养12h。用灭菌的500目网筛收集菌丝，无菌水洗脱营养，然后用0.7M NaCl渗透压稳定剂冲洗使其平衡。挑取少量菌丝，放入含有40mg/ml蜗牛酶的溶液中，涡旋振荡使其分散，28℃，100r/min酶解3h，加入等体积渗透压稳定剂稀释以免酶解过度。500目网筛去除细胞碎片，将滤液转移至50ml离心管中，4000r/min离心10min，弃上清，STC溶液(蔗糖200g/L，1M Tris-HCL 50ml/L，氯化钙5.55g/L)悬浮沉淀物，STC离心洗涤2次，悬浮，调整浓度至107原生质体/ml。
[0033] 取100μl原生质体溶液，加入20μg线性化质粒混合，冰浴20min，加入1.25ml PTC溶液(PEG4000 400g/L，1M Tris-Hcl 10ml/L，2.5M氯化钙20ml/L)，室温静止20min。然后转入15ml离心管，并加入5mL TB3培养液(酵母浸粉3g/L，酸水解酪素3g/L，蔗糖200g/L)和氨苄抗生素(终浓度100μg/mL)，28℃，100r/min摇床振荡培养16h。培养液5000r/min离心10min，
200μl STC悬浮沉淀，与10mL含低熔点琼脂糖的TB3培养液，以及潮霉素(终浓度300μg/mL)和氨苄抗生素(终浓度100μg/mL)混匀倒板，28℃培养过夜。培养基表面铺盖10mL含低熔点琼脂糖和潮霉素(终浓度300μg/mL)的TB3培养基。28℃培养箱避光培养5d，将转化子转接到含潮霉素(终浓度300μg/mL)的PDA培养基上，连续转接3代，获得稳定遗传的转化子。
200μl STC悬浮沉淀，与10mL含低熔点琼脂糖的TB3培养液，以及潮霉素(终浓度300μg/mL)和氨苄抗生素(终浓度100μg/mL)混匀倒板，28℃培养过夜。培养基表面铺盖10mL含低熔点琼脂糖和潮霉素(终浓度300μg/mL)的TB3培养基。28℃培养箱避光培养5d，将转化子转接到含潮霉素(终浓度300μg/mL)的PDA培养基上，连续转接3代，获得稳定遗传的转化子。
[0034] 提取转化子RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，以hphF和hphR为引物进行PCR扩增，hphF：(5′-3′)ATGCCTGAACTCACCGCGACGTCTG，hphR：CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG。PCR条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃下保持10min。琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性转化子。
[0035] 实施例3
[0036] 工程菌株Cr-per44脂滴包被蛋白基因表达量的测定
[0037] Real-time定量PCR方法测定工程菌株Cr-per44中脂滴包被蛋白表达量，以延伸因子(Elongation factors)作为内参基因。使用Primer5软件分别设计延伸因子和Per3特异性引物。 EFF：TCGATGTCGCTCCTGACT，EFR：AGCGTGACCGTTTATTTGA，Per3F：GAAACTTCTCTTTCGTCTCTATCGA，Per3R：CTTGCAAGCACAGAAAGAAAATCAA。将cDNA样品稀释10倍，SYBR Green法进行荧光定量测定。反应体系为：SYBR Premix 12.5μl，cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，以及ddH2O 8.5μl。反应条件为：95℃变性2min，按以下反应40个循环：95℃变性-ΔΔCt
10s和60℃退火30s。相对表达量的计算采用2 法。结果表明，工程菌株Cr-per44脂滴包被蛋白基因表达量比野生菌株HLD-1提高3倍。
10s和60℃退火30s。相对表达量的计算采用2 法。结果表明，工程菌株Cr-per44脂滴包被蛋白基因表达量比野生菌株HLD-1提高3倍。
[0038] 实施例4
[0039] 工程菌株Cr-per44对大豆核盘菌菌核的寄生性测定
[0040] 从生长10d的核盘菌PDA平板上切取菌块，转接到胡萝卜培养基中，每瓶10块。26℃培养3周，待长出黑色颗粒状菌核后，置于10目筛网上，用蒸馏水反复冲洗，去除培养基及菌丝。将收集的菌核表面消毒、风干，阴凉干燥处保存。
[0041] 将工程菌株Cr-per44和HLD-1野生菌株接种于PDA平板，26℃下培养10d，加入5ml无菌水，用刮铲轻轻刮取孢子，灭菌粗滤纸过滤，制备孢子悬液。血球计数板计数，加水调节孢子浓度为1×107/ml一致。将菌核分别用75％乙醇和2.5％NaClO溶液表面消毒，无菌水反复冲洗，灭菌滤纸上晾10min。取30粒整齐且大小一致的菌核放置于不同孢子液中，浸泡10min，灭菌滤纸吸去多余水分，置于灭菌湿滤纸上，26℃保湿培养。8h开始检测，解剖镜下观察菌核被寄生的情况，记录寄生率。每隔2h测定1次至24h。3次重复。统计表明，Cr-per44菌株对核盘菌的寄生率显著高于HLD-1菌株，见图2。10h时Cr-per44菌株开始寄生，16h、20h寄生率分别达到80.0％和100％，而野生菌株16h的寄生率为46.7％。
[0042] 实施例5
[0043] 工程菌株Cr-per44温室防治番茄灰霉病试验
[0044] 自然土过40目筛，混合1倍蛭石，混匀后装入苗盘，播种番茄。4周后将长势一致的幼苗移栽至花盆中，每盆3株。待幼苗长至3～4片复叶期，叶子正面、背面均匀涂抹HLD-1和Cr-per44菌株孢子悬液，菌浓度为5×106CFU/ml。2h后，喷雾接种番茄灰霉病菌分生孢子悬液(浓度5×106/ml)。试验区搭设支架，覆盖塑料棚膜，以保持水分。控制温室温度日间25℃～30℃，夜晚15℃。7d后按9级分级标准调查番茄叶片发病情况，计算病情指数和防治效果，以清水和98％多菌灵1000倍稀释液为对照。结果发现，工程菌株Cr-per44对番茄灰霉病防效达到80.7％，野生菌株和多菌灵处理分别为63.9％和62.1％。