融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用。本发明所提供的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS，是由蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS融合得到的融合蛋白：所述蛋白质Nt4CL是氨基酸序列是SEQ ID No.1自N端第1‑542位氨基酸残基组成的蛋白质；所述蛋白质PcSTS是氨基酸序列是SEQ ID No.1自N端第550‑937位氨基酸残基所示的蛋白质。融合蛋白Nt4CL7aPcSTS能够催化4‑香豆酸和丙二酰辅酶A生成具有生物活性的白藜芦醇，证明融合蛋白Nt4CL7aPcSTS具有4‑香豆酸辅酶A连接酶和芪合酶的活性。

权利要求

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，包括将所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述融合蛋白的编码基因导入所述生物细胞。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述微生物细胞为原核微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述原核微生物细胞为细菌。

7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是编码序列是SEQ ID No.2的第1-2814位核苷酸的DNA分子或cDNA分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子。

9.一种生产白藜芦醇的方法，包括在含有4-香豆酸的培养基中培养融合蛋白相关生物材料，得到白藜芦醇；所述融合蛋白相关生物材料为下述C1)至C3)中的任一种：C1)含有核酸分子的重组微生物；所述核酸分子编码权利要求1所述融合蛋白；所述微生物为原核微生物；

C2)含有表达盒的重组微生物；所述表达盒含有所述核酸分子；所述微生物为原核微生物；

C3)含有重组载体的重组微生物；所述重组载体为原核细胞表达载体，所述重组载体含有所述核酸分子或所述表达盒；所述微生物为原核微生物。

10.权利要求1所述的融合蛋白在生产白藜芦醇中的应用。

说明书

融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中融合蛋白Nt4CL7aPcSTS及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 白藜芦醇(Resveratrol，简称Res)，化学名为3，4'，5-三羟基-1，2-二苯乙烯(trans-3,4',5-trihydroxystilbene)，又称芪三酚，是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，分子量为228.2，不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂。天然的白藜芦醇在很多植物中存在，例如虎杖、花生和葡萄等。

[0003] 白藜芦醇是植物遭遇紫外线照射、机械损伤及真菌感染时急剧增加的一种植保素，研究显示白藜芦醇具有抗癌、保护心血管、抗氧化、抗衰老、免疫调节、神经保护和植物雌激素等作用，可广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。白藜芦醇是葡萄酒最重要的保健成分，法国人在高脂肪、高蛋白、高能量饮食习惯下，心血管疾病的发病率远低于其他欧美国家，就得益于经常饮用含白藜芦醇的红葡萄酒。

[0004] 白藜芦醇来源于苯丙烷代谢途径(Phenylpropanoid pathway)。其生物代谢途径为：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)作用下裂解成反式肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase，C4H)的催化作用下生成4-香豆酸，4-香豆酸在4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumarate-CoA ligase，4CL)的作用下合成4-香豆酰辅酶A，最后，芪合酶(Stilbene synthase，STS)催化1分子的4-香豆酰辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A生成白藜芦醇(图1)。

[0005] 在生物体内白藜芦醇生物合成途径限速步骤较多，单纯过量表达某一关键酶虽然对白藜芦醇的含量可能会产生一定的促进作用，但由于其它步骤限制，白藜芦醇的高水平积累非常困难。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何提高白藜芦醇的产量。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0008] 本发明所提供的融合蛋白，名称为Nt4CL7aPcSTS，是如下⑴或⑵的蛋白质：

[0009] ⑴由蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS融合得到的融合蛋白：

[0010] 所述蛋白质Nt4CL是如下a)或b)：

[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No.1第1-542位氨基酸残基的蛋白质；

[0012] b)将a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；

[0013] 所述蛋白质PcSTS是如下A或B：

[0014] A、氨基酸序列是SEQ ID No.1第550-937位氨基酸残基所示的蛋白质；

[0015] B、将A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

[0016] ⑵将⑴的N端或C端连接标签得到的带标签蛋白质。

[0017] 所述融合蛋白中，所述蛋白质Nt4CL和蛋白质PcSTS通过七个氨基酸残基连接。所述七个氨基酸残基的序列如SEQ ID No.1第543-549位所示，所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.1。

[0018] 为了使所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS便于纯化，可在所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS的N端和/或C端连接上如表1所示的标签。如在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和C端分别连接一个6*His标签(HHHHHH)得到的融合蛋白。

[0019] 表1.标签的序列

[0020]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0021] 上述融合蛋白，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0022] 上述融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述融合蛋白的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

[0023] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS相关的生物材料。

[0024] 本发明所提供的与所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS相关的生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：

[0025] B1)编码所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS核酸分子；

[0026] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

[0027] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

[0028] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

[0029] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

[0030] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

[0031] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

[0032] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

[0033] B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

[0034] B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0035] B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

[0036] B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

[0037] B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

[0038] B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

[0039] B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

[0040] B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

[0041] B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

[0042] B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

[0043] B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；

[0044] B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。

[0045] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0046] 上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子，即Nt4CL7aPcSTS的基因：

[0047] 1)编码序列是SEQ ID No.2的第1-2814位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

[0048] 2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

[0049] 3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0050] 4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

[0051] 其中，SEQ ID No.2由2814个核苷酸组成，SEQ ID No.2的核苷酸编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

[0052] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Nt4CL7aPcSTS的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明人工合成的Nt4CL7aPcSTS的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码Nt4CL7aPcSTS且具有相同功能的蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0053] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0054] 上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

[0055] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0056] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码Nt4CL7aPcSTS的核酸分子的表达盒(Nt4CL7aPcSTS基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Nt4CL7aPcSTS的DNA，该DNA不但可包括启动Nt4CL7aPcSTS基因转录的启动子，还可包括终止Nt4CL7aPcSTS基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

[0057] 上述生物材料中，可用现有的表达载体构建含有所述Nt4CL7aPcSTS基因表达盒的重组载体。

[0058] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

[0059] 上述生物材料中，所述的微生物可为原核微生物或真核微生物。所述原核微生物可为细菌。所述细菌可为埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌。所述真核微生物可为藻类、真菌、原生动物。所述真菌可为单细胞真菌。所述单细胞真菌可为酵母菌。所述酵母菌可为酵母菌株WAT11。

[0060] 上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

[0061] 上述重组载体可为将所述Nt4CL7aPcSTS基因插入pET30a(+)质粒中构成的重组表达载体；所述重组菌可为重组大肠杆菌。

[0062] 上述重组载体可为将所述Nt4CL7aPcSTS基因插入pESC-Trp质粒中构成的重组表达载体；所述重组菌可为重组酵母菌。

[0063] 本发明的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS或上述与融合蛋白Nt4CL7aPcSTS相关的生物材料在生产白藜芦醇中的应用也属于本发明的保护范围之内。

[0064] 所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS在作为4-香豆酸辅酶A连接酶和芪合酶中的应用也属于本发明的保护范围之内。

[0065] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种生产白藜芦醇的方法。

[0066] 本发明所提供的一种生产白藜芦醇的方法，包括在含有4-香豆酸的培养基中培养融合蛋白相关生物材料，得到白藜芦醇；

[0067] 所述融合蛋白相关生物材料为下述C1)至C12)中的任一种：

[0068] C1)含有核酸分子的重组微生物；所述核酸分子编码所述融合蛋白；

[0069] C2)含有表达盒的重组微生物；所述表达盒含有所述核酸分子；

[0070] C3)含有重组载体的重组微生物；所述重组载体含有所述核酸分子或所述表达盒；

[0071] C4)含有所述核酸分子的转基因植物细胞系；

[0072] C5)含有所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0073] C6)含有所述重组载体的转基因植物细胞系；

[0074] C7)含有所述核酸分子的转基因植物组织；

[0075] C8)含有所述表达盒的转基因植物组织；

[0076] C9)含有所述重组载体的转基因植物组织；

[0077] C10)含有所述核酸分子的转基因植物器官；

[0078] C11)含有所述表达盒的转基因植物器官；

[0079] C12)含有所述重组载体的转基因植物器官。

[0080] 上述生产白藜芦醇的方法中，所述微生物可为原核微生物或真核微生物。所述原核微生物可为细菌。所述细菌可为埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌。所述真核微生物可为真菌。所述真菌可为酵母菌。所述酵母菌可为酵母菌株WAT11。所述载体可为克隆载体和表达载体。所述表达载体可为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。其它所述融合蛋白相关生物材料与上文中的与所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS相关的生物材料相同。

[0081] 本发明还提供了一种融合蛋白的制备方法，包括所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述融合蛋白。

[0082] 上述制备方法中，所述融合蛋白的编码基因是如下①或②或③或④所述的DNA分子：

[0083] ①编码序列是SEQ ID No.2的第1-2814位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

[0084] ②核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；

[0085] ③与①或②限定的DNA分子或cDNA分子具有75％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

[0086] ④在严格条件下与①或②限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。

[0087] 上述制备方法中，将所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述融合蛋白的编码基因导入所述生物细胞。

[0088] 上述制备方法中，所述融合蛋白的编码基因通过含有所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞得到表达所述融合蛋白的重组细胞；所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞，所述微生物细胞可为酵母、细菌、藻或真菌。在本发明的实施例中，所述生物细胞具体可为细菌和酵母菌。

[0089] 上述制备方法中，包括培养所述重组细胞得到所述融合蛋白。

[0090] 上述制备方法中，所述重组表达载体可为将pET30a(+)的EcoR I识别序列和XhoI识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子，保持pET30a(+)的其它序列不变得到的Nt4CL7aPcSTS基因表达载体，其名称为pET30a-Nt4CL7aPcSTS。

[0091] 上述制备方法中，所述大肠杆菌可为将重组表达质粒pET30a-Nt4CL7aPcSTS导入受体大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。所述受体大肠杆菌可为大肠杆菌Rosetta。

[0092] 上述制备方法中，所述重组表达载体可为将pESC-Trp的EcoR I识别序列和Bgl II识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子，保持pESC-Trp的其它序列不变得到Nt4CL7aPcSTS基因表达载体，其名称为pESC-Nt4CL7aPcSTS。

[0093] 上述制备方法中，所述重组酵母菌可为将pESC-Nt4CL7aPcSTS导入受体酵母菌得到的重组酵母菌。所述受体酵母菌具体可为酵母菌WAT11。

[0094] 上述制备方法中，所述培养包括在25℃，含有0.5mmol/L的IPTG的培养基中诱导2h表达所述融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0095] 体外酶促反应的实验证明，本发明提供的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS能够催化4-香豆酸和丙二酰辅酶A生成具有生物活性的白藜芦醇，证明融合蛋白Nt4CL7aPcSTS具有4-香豆酰辅酶A连接酶和芪合酶的活性。含有融合蛋白Nt4CL7aPcSTS基因的重组大肠杆菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS在含有4-香豆酸的培养基中产生白藜芦醇，其产量为24.4μg/mL；含有PcSTS基因的重组大肠杆菌Rosetta/pET30a-PcSTS在上述含有4-香豆酸的培养基中不产生白藜芦醇。表明在大肠杆菌表达系统中利用融合蛋白Nt4CL7aPcSTS可提高白藜芦醇的产量。含有融合蛋白Nt4CL7aPcSTS基因的重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS在含4-香豆酸的培养基中产生白藜芦醇，其产量为9.3μg/mL发酵液；重组酵母菌WAT11/pESC、WAT11/pESC-Nt4CL和WAT11/pESC-PcSTS在含4-香豆酸的培养体系不产白藜芦醇；重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CLPPPcSTS在含4-香豆酸的培养体系的白藜芦醇的产量为1.3μg/mL发酵液。表明在酵母表达系统中利用融合蛋白Nt4CL7aPcSTS可提高白藜芦醇的产量。

附图说明

[0096] 图1为白藜芦醇生物合成途径图。

[0097] 图2为蛋白质PcSTS诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。其中，M1为蛋白质分子量Marker；泳道1为重组菌Rosetta/pET30a-PcSTS菌体破碎液；泳道2为重组菌Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解上清液；泳道3为重组菌Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解沉淀；泳道4为Ni-NTA树脂孵育后的上清；泳道5为洗树脂收集液；6和7为经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后的蛋白质PcSTS。

[0098] 图3为蛋白质PcSTS经PD-10柱脱盐后的聚丙酰胺凝胶电泳图。泳道1-7为蛋白质PcSTS样品脱盐后的洗脱液。

[0099] 图4为融合蛋白Nt4CL7aPcSTS诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。其中，M1为蛋白质分子量Marker；泳道1为重组菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体破碎液；泳道2为重组菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解上清液；泳道3为重组菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解沉淀；泳道4为Ni-NTA树脂孵育后的上清；泳道5为洗树脂收集液；6为经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0100] 图5为融合蛋白Nt4CL7aPcSTS经PD-10柱脱盐后的聚丙酰胺凝胶电泳图。泳道1-3为融合蛋白Nt4CL7aPcSTS样品脱盐后的洗脱液。

[0101] 图6为高效液相色谱检测图谱。其中，A为白藜芦醇标准品高效液相色谱图；B为PcSTS体外酶促反应产物的高效液相色谱图；C为白藜芦醇标准品和PcSTS体外酶促反应产物的共色谱图。横坐标均为保留时间，单位是分钟。

[0102] 图7为融合蛋白Nt4CL7aPcSTS高效液相色谱检测图谱。其中，A为Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应产物的高效液相色谱图；B为白藜芦醇标准品和Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应产物的共色谱图。横坐标均为保留时间，单位是分钟。

[0103] 图8为重组菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC-MS的检测结果。其中A为白藜芦醇标准品的HPLC-MS；B为重组大肠杆菌以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC-MS。

[0104] 图9为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC的检测结果。其中箭头所指为白藜芦醇的吸收峰；A为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC；B为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS以香豆酸为底物的发酵产物与白藜芦醇标准品的共色谱图。横坐标均为保留时间，单位是分钟。

[0105] 图10为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC-MS的检测结果。其中A为白藜芦醇标准品的HPLC-MS；B为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS以香豆酸为底物的发酵产物的HPLC-MS。

具体实施方式

[0106] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0107] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0108] 下述实施例中的pESC-Trp为Agilent公司产品，产品目录号为217453。

[0109] 下述实施例中的酵母菌株WAT11(Zhang Y,Li SZ,Li J,et al.Using unnatural protein fusions to engineer resveratrol biosynthesis in yeast and mammalian cells[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(40):13030-13031.)为中国科学院武汉植物园章焰生老师馈赠。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0110] 下述实施例中所用的培养基如下：

[0111] Trp营养缺陷液体培养基按照如下方法配制：将Trp Minus Media(北京泛基诺科技有限公司产品)加入蒸馏水中，至Trp Minus Media的含量为8g/L；pH自然，高压灭菌后得到Trp营养缺陷液体培养基。

[0112] Trp营养缺陷固体培养基：向Trp营养缺陷液体培养基中加琼脂至其含量为20g/L得到的培养基。

[0113] 实施例1、融合蛋白Nt4CL7aPcSTS的原核表达和纯化

[0114] 一、Nt4CL7aPcSTS基因表达质粒的构建

[0115] 人工合成SEQ ID No.2所示的DNA分子(Nt4CL7aPcSTS基因)，编码SEQ ID No.1所示的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0116] 将pET30a(+)(Novagen公司产品)的EcoR I识别序列和Xho I识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID  No.2的DNA分子，保持pET30a(+)的其它序列不变得到Nt4CL7aPcSTS基因表达载体，其名称为pET30a-Nt4CL7aPcSTS。pET30a-Nt4CL7aPcSTS表达SEQ ID No.1所示的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0117] 将pET30a(+)的EcoR I识别序列和Xho I识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2中第1648-2814位的DNA分子，保持pET30a(+)的其它序列不变得到PcSTS基因表达载体，其名称为pET30a-PcSTS。pET30a-A3aSTS表达SEQ ID No.1第550-937位所示的蛋白质PcSTS。

[0118] 上述SEQ ID No.1所示的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS包括蛋白质Nt4CL、linker和蛋白质PcSTS。SEQ ID No.1中，第1-542位氨基酸残基为蛋白质Nt4CL的氨基酸序列，第543-549位氨基酸残基为linker的氨基酸序列，第550-937位氨基酸残基为蛋白质PcSTS的氨基酸序列。SEQ ID No.2中，第1-1626位所示的DNA分子编码蛋白质Nt4CL；第1627-1647位所示的DNA分子编码linker；第1648-2814位所示的DNA分子编码蛋白质PcSTS。

[0119] 二、融合蛋白Nt4CL7aPcSTS的表达和纯化

[0120] 将质粒pET30a-PcSTS导入大肠杆菌Rosetta，经LB固体平板(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)筛选，得到含有pET30a-PcSTS的重组菌大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为Rosetta/pET30a-PcSTS，作为对照菌。

[0121] 将重组表达质粒pET30a-Nt4CL7aPcSTS导入大肠杆菌Rosetta，经LB固体平板(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)筛选，得到含有pET30a-Nt4CL7aPcSTS的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS。

[0122] 将质粒pET30a(+)导入大肠杆菌Rosetta，经LB固体平板(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)筛选，得到含有pET30a(+)的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为Rosetta/pET30a，作为空载体对照菌。

[0123] 将Rosetta/pET30a-PcSTS、Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS和Rosetta/pET30a分别接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜得到培养菌液1，分别命名为Rosetta/pET30a-PcSTS培养菌液1、Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS培养菌液1和Rosetta/pET30a培养菌液1；将上述培养菌液1分别以1:100(体积比)接种到LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)中，振荡培养至OD600值0.6得到培养菌液2，分别命名为Rosetta/pET30a-PcSTS培养菌液2、Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS培养菌液2和Rosetta/pET30a培养菌液2；向上述Rosetta/pET30a-PcSTS培养菌液2和Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS培养菌液2中分别加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度分别为0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L和1.0mmol/L，25℃，分别诱导2h、4h、6h、8h、10h和22h，收集各诱导条件下等量菌体。上述各菌体依次加入SDS样品缓冲液裂解，离心，得到的上清液各取10μL进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在下文简称SDS-PAGE)，考马斯亮蓝染色后用凝胶成像分析仪扫描电泳结果。通过比较不同IPTG浓度和不同诱导时间下表达量的差异，结果表明，蛋白质PcSTS最适诱导表达条件为：IPTG在体系中的浓度为0.8mmol/L，25℃诱导6h；融合蛋白Nt4CL7aPcSTS最适诱导表达条件为：IPTG在体系中的浓度为0.5mmol/L，25℃诱导2h。

[0124] 向上述步骤中得到的Rosetta/pET30a-PcSTS培养菌液2加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度为0.8mmol/L，25℃，诱导6h，收集菌体后超声破碎，得到菌体破碎液(名称为Rosetta/pET30a-PcSTS菌体破碎液)。将该菌体破碎液12000rpm离心10min得到上清液(名称为Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解上清液)和沉淀(名称为Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解沉淀)。

[0125] 向上述步骤中得到的Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS培养菌液2加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度为0.5mmol/L，25℃，诱导2h，收集菌体后超声破碎，得到菌体破碎液(名称为Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体破碎液)。将该菌体破碎液12000rpm离心10min得到上清液(名称为Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解上清液)和沉淀(名称为Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解沉淀)。

[0126] 将Rosetta/pET30a-PcSTS菌体破碎液、Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解上清液、Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解沉淀、Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体破碎液、Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解上清液和Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解沉淀进行SDS-PAGE。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱从菌体裂解上清液中纯化蛋白，然后利用PD-10柱脱盐。

[0127] 实验结果见如图2、图3、图4和图5。结果表明，蛋白质PcSTS主要存在于Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解上清液中，分子量大小为43kDa；融合蛋白Nt4CL7aPcSTS主要存在于Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解上清液中，分子量大小为103kDa。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱从Rosetta/pET30a-PcSTS菌体裂解上清液中纯化得到带有His标签的蛋白质PcSTS，从Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS菌体裂解上清液中纯化得到带有His标签的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。经过截留分子量(MWCO)10000的滤膜浓缩后，用蛋白储存溶液溶解得到浓度均为1mg/mL的蛋白质PcSTS和融合蛋白Nt4CL7aPcSTS溶液。蛋白储存溶液：溶质及其浓度为：20mM Tris(pH7.5)，150mM氯化钠，0.5mM EDTA，25％(v/v)甘油，蛋白储存溶液使用时加入1mM DTT混匀后使用；溶剂为蒸馏水；pH自然。

[0128] 实施例2、HPLC检测融合蛋白Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应与产物

[0129] 2.1、白藜芦醇标准品HPLC检测：准确称取白藜芦醇标准品(Sigma公司产品)1.0mg于10mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解、定容至10mL，配置成100μg/mL的白藜芦醇母液。经0.22μm滤膜过滤，用甲醇稀释获得浓度分别为2.5、5、12.5、25、50μg/mL的标准溶液，浓度从低到高依次进样。使用配有SunfireTM C18反相柱(5.0μm，4.6mm×250mm)的Waters HPLC分析。流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为0.8mL/min，使用以下梯度洗脱条件：在0-30min内，流动相中甲醇的体积百分含量由10％匀速增至70％，水的体积百分含量由90％匀速降至30％，进行线性梯度洗脱；再用流动相(由甲醇和水按照7:3的体积比混合得到的溶液)洗脱
10min。检测波长为306nm。白藜芦醇标准品高效液相色谱图如图6中A所示。

[0130] 2.2、蛋白PcSTS体外酶促反应与产物HPLC检测：制备300μL PcSTS体外酶促反应体系，该体外酶促反应体系的pH为7.5，溶剂为0.1mol/L磷酸钾缓冲液(溶质为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，溶剂为水)，溶质为4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A、实施例1得到的纯蛋白质PcSTS。300μL PcSTS体外酶促反应体系中，4-香豆酰辅酶A的浓度为150μmol/L，丙二酰辅酶A的浓度为280μmol/L，实施例1的纯蛋白PcSTS的浓度为0.1μmol/L。上述反应体系置于35℃下反应30min，加入乙酸，使乙酸在体系中的浓度为5％(体积百分含量)，然后用300μL的乙酸乙酯萃取，10000r/min离心10min。取上层乙酸乙酯层进行真空干燥，得到PcSTS酶促反应产物，向PcSTS酶促反应产物中加入50μL 50％(体积百分含量)甲醇水溶液，得到PcSTS酶促反应产物待测样品。使用配有SunfireTM C18反相柱(5.0μm，4.6mm×250mm)的Waters HPLC分析PcSTS酶促反应产物待测样品。流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为0.8mL/min，使用以下梯度洗脱条件：在0-30min内，流动相中甲醇的体积百分含量由10％匀速增至70％，水的体积百分含量由90％匀速降至30％，进行线性梯度洗脱；再用流动相(由甲醇和水按照7:3的体积比混合得到的溶液)洗脱10min。检测波长为306nm。以白藜芦醇(Sigma公司，货号R5010)为标准品采用标准曲线法(外标法)进行定量分析白藜芦醇。实验重复三次，每次重复设10个反应体系。

[0131] 结果表明PcSTS体外酶促反应产物的高效液相色谱图如图6中B所示。白藜芦醇标准品和PcSTS体外酶促反应产物的共色谱图分别如图6中A和C所示，标准品白藜芦醇在该色谱条件下的保留时间为23.253分钟(见图6中A)；PcSTS体外酶促反应产物在该色谱条件下含有保留时间为23.232分钟的白藜芦醇的色谱峰(图6中B)。向上述PcSTS酶促反应产物待测样品中加入上述白藜芦醇标准品得到共色谱样品，共色谱样品中的上述白藜芦醇标准品的质量含量为共色谱样品中的PcSTS质量含量的一倍。在完成PcSTS酶促反应产物待测样品的HPLC分析检测后的10分钟内，在相同的色谱条件下对共色谱样品进行HPLC分析。共色谱样品在该色谱条件下含有保留时间为23.250分钟的色谱峰，将该色谱峰命名为共色谱峰(图7中B)，该共色谱峰的峰高为PcSTS色谱峰的两倍，说明PcSTS色谱峰为白藜芦醇的色谱峰。

[0132] 2.3、融合蛋白Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应与产物HPLC检测：除将2.2中蛋白PcSTS体外酶促反应与产物HPLC检测中的体外酶促反应体系替代为300μL Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应体系外，其余均与2.2相同。300μL Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应体系的pH为7.5，溶剂为0.1mol/L磷酸钾缓冲液(溶质为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，溶剂为水)，溶质及其浓度为：150μmol/L 4-香豆酸、280μmol/L丙二酰辅酶A、250μmol/L ATP、100μmol/L CoA、0.1μmol/L实施例1的纯融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。实验重复三次，每次重复设10个反应体系。

[0133] 上述反应体系置于35℃下反应30min，加入乙酸，使乙酸在体系中的浓度为5％(体积百分含量)，然后用300μL的乙酸乙酯萃取，10000r/min离心10min。取上层乙酸乙酯层进行真空干燥，得到Nt4CL7aPcSTS酶促反应产物，向Nt4CL7aPcSTS酶促反应产物中加入50μL 50％(体积百分含量)甲醇水溶液，得到Nt4CL7aPcSTS酶促反应产物待测样品。按照2.2的方法进行HPLC分析Nt4CL7aPcSTS酶促反应产物待测样品。结果表明Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应产物在该色谱条件下含有保留时间为22.216分钟的色谱峰，将该色谱峰命名为Nt4CL7aPcSTS色谱峰(图7中A)。向上述Nt4CL7aPcSTS酶促反应产物待测样品中加入上述白藜芦醇标准品得到共色谱样品，共色谱样品中的上述白藜芦醇标准品的质量含量为共色谱样品中的Nt4CL7aPcSTS质量含量的一倍。在完成Nt4CL7aPcSTS酶促反应产物待测样品的HPLC分析检测后的10分钟内，在相同的色谱条件下对共色谱样品进行HPLC分析。共色谱样品在该色谱条件下含有保留时间为22.183分钟的色谱峰，将该色谱峰命名为共色谱峰(图7中B)，该共色谱峰的峰高为Nt4CL7aPcSTS色谱峰的两倍，说明Nt4CL7aPcSTS色谱峰为白藜芦醇的色谱峰。

[0134] 结果表明，蛋白质PcSTS体外酶促反应产物为白藜芦醇，在体外酶促反应体系中蛋白质PcSTS能够催化4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A形成具有生物活性的白藜芦醇，产量为4.9kg白藜芦醇/mol蛋白质PcSTS；融合蛋白Nt4CL7aPcSTS体外酶促反应产物为白藜芦醇，融合蛋白Nt4CL7aPcSTS能够催化4-香豆酸和丙二酰辅酶A生成具有生物活性的白藜芦醇，产量为6.9kg白藜芦醇/mol融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0135] 实施例3、利用重组大肠杆菌生产白藜芦醇

[0136] 3.1、重组大肠杆菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS生产白藜芦醇：将实施例1中的重组大肠杆菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜得到培养菌液1，将上述培养菌液1以1:100(体积比)接种到装有100mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素)的三角瓶中，振荡培养至OD600值0.4-0.5之间得到培养菌液2，向培养菌液2中加入IPTG，将得到的体系称为培养菌液2的体系，使IPTG在培养菌液2的体系中的浓度为0.5mM，25℃，150rpm诱导培养2h，6000rpm离心2min，弃上清，用100mL含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的培养基(该含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的培养基是向M9培养基中加入卡那霉素和氯霉素得到的液体培养基，卡那霉素在该液体培养基中的浓度为50μg/mL，氯霉素在该液体培养基中的浓度为25μg/mL)重悬菌体沉淀得到重悬液。向重悬液中加入IPTG和4-香豆酸，将得到的体系称为含4-香豆酸的培养体系，使IPTG在含
4-香豆酸的培养体系中的浓度为0.5mM、使4-香豆酸在含4-香豆酸的培养体系中的浓度为
12μg/mL，25℃，150rpm培养48h得到发酵培养液。取1mL上述发酵培养液12000rpm离心2min，取上清液，用1mL乙酸乙酯涡旋振荡40s萃取，重复萃取两次。离心取上层乙酸乙酯层，挥发干燥后，加入50μL 50％(体积百分含量)甲醇水溶液，得到重组大肠杆菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS的样品溶液，进行HPLC-MS的检测。使用配有SunfireTM C18反相柱(5.0μm，
4.6mm×250mm)的Waters HPLC进行检测。流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为0.8mL/min，使用以下梯度洗脱条件：在0-30min内，流动相中甲醇的体积百分含量由10％匀速增至
70％，水的体积百分含量由90％匀速降至30％，进行线性梯度洗脱；再用流动相(由甲醇和水按照7:3的体积比混合得到的溶液)洗脱10min。检测波长为306nm。以白藜芦醇(Sigma公司，货号R5010)为标准品采用标准曲线法(外标法)进行定量分析白藜芦醇。质谱检测条件为：质谱扫描范围150-1000(m/z)；鞘气：氮气，鞘气流速：40mL/min，辅助气流速：3mL/min，毛细管温度：300℃，毛细管电压：-35V。实验重复三次，每次重复设10个三角瓶。

[0137] 3.2、重组菌Rosetta/pET30a-PcSTS生产白藜芦醇：除将3.1中的重组大肠杆菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS培养菌液2替换为实施例1的Rosetta/pET30a-PcSTS培养菌液2，其余均相同。

[0138] 3.3、重组菌Rosetta/pET30a生产白藜芦醇：除将3.1中的pET30a-Nt4CL7aPcSTS培养菌液2替换为实施例1的Rosetta/pET30a培养菌液2，其余均相同。

[0139] 重组菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS在上述含4-香豆酸的培养体系所产的白藜芦醇的HPLC-MS的检测结果如图8所示。结果表明，重组菌Rosetta/pET30a-Nt4CL7aPcSTS在上述含4-香豆酸的培养体系的白藜芦醇的产量为24.4μg/mL发酵液；重组菌Rosetta/pET30a-PcSTS在上述含4-香豆酸的培养体系不产白藜芦醇；重组菌Rosetta/pET30a在上述含4-香豆酸的培养体系中不产白藜芦醇。表明在大肠杆菌表达系统中利用融合蛋白Nt4CL7aPcSTS可提高白藜芦醇的产量。

[0140] 实施例4、利用重组酵母菌生产白藜芦醇

[0141] 1、重组酵母表达载体的构建及转化

[0142] 人工合成SEQ ID No.2所示的DNA分子(Nt4CL7aPcSTS基因)，编码SEQ ID No.1所示的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0143] 将pESC-Trp(Agilent公司产品，产品目录号为217453)的EcoR I识别序列和Bgl II识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子，保持pESC-Trp的其它序列不变得到Nt4CL7aPcSTS基因表达载体，其名称为pESC-Nt4CL7aPcSTS。pESC-Nt4CL7aPcSTS表达SEQ ID No.1所示的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS。

[0144] 将pESC-Trp的EcoR I识别序列和Pac I识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2中第1-1626位的DNA分子，将pESC-Trp的BamH I识别序列和Xho I识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2中第1648-2814位的DNA分子，保持pESC-Trp的其它序列不变得到基因表达载体，其名称为pESC-Nt4CLPPPcSTS。pESC-Nt4CLPPPcSTS表达SEQ ID No.1第1-542位氨基酸残基所示的蛋白质Nt4CL和SEQ ID No.1第550-937位氨基酸残基所示的蛋白质PcSTS。

[0145] 将pESC-Trp的EcoR I识别序列和Bgl II识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2中第1-1626位的DNA分子，保持pESC-Trp的其它序列不变得到Nt4CL基因表达载体，其名称为pESC-Nt4CL。pESC-Nt4CL表达SEQ ID No.1第1-542位所示的蛋白质Nt4CL。

[0146] 将pESC-Trp的EcoR I识别序列和Bgl II识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.2中第1648-2814位的DNA分子，保持pESC-Trp的其它序列不变得到PcSTS基因表达载体，其名称为pESC-PcSTS。pESC-PcSTS表达SEQ ID No.1第550-937位所示的蛋白质PcSTS。

[0147] 上述SEQ ID No.1所示的融合蛋白Nt4CL7aPcSTS包括蛋白质Nt4CL、linker和蛋白质PcSTS。SEQ ID No.1中，第1-542位氨基酸残基为蛋白质Nt4CL的氨基酸序列，第543-549位氨基酸残基为linker的氨基酸序列，第550-937位氨基酸残基蛋白质PcSTS的氨基酸序列。SEQ ID No.2中，第1-1626位所示的DNA分子编码蛋白质Nt4CL；第1627-1647位所示的DNA分子编码linker；第1648-2814位所示的DNA分子编码蛋白质PcSTS。

[0148] 将Trp营养缺陷固体培养基制成的固体平板，命名为Trp营养缺陷平板。将重组酵母表达质粒pESC-Nt4CL7aPcSTS转入酵母菌株WAT11，然后在Trp营养缺陷平板上筛选，得到含有pESC-Nt4CL7aPcSTS的重组酵母菌，将该重组酵母菌命名为WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS。

[0149] 将质粒pESC-Trp导入酵母菌株WAT11，然后在Trp营养缺陷平板上筛选，得到含有pESC-Trp的重组酵母菌，将该重组酵母菌命名为WAT11/pESC，作为空载体对照菌。

[0150] 将重组酵母表达质粒pESC-Nt4CLPPPcSTS导入酵母菌株WAT11，然后在Trp营养缺陷平板上筛选，得到含有pESC-Nt4CLPPPcSTS的重组酵母菌，将该重组酵母菌命名为WAT11/pESC-Nt4CLPPPcSTS。

[0151] 将重组酵母表达质粒pESC-Nt4CL导入酵母菌株WAT11，然后在Trp营养缺陷平板上筛选，得到含有pESC-Nt4CL的重组酵母菌，将该重组酵母菌命名为WAT11/pESC-Nt4CL。

[0152] 将重组酵母表达质粒pESC-PcSTS导入酵母菌株WAT11，然后在Trp营养缺陷平板上筛选，得到含有pESC-PcSTS的重组酵母菌，将该重组酵母菌命名为WAT11/pESC-PcSTS。

[0153] 2、利用重组酵母菌生产白藜芦醇

[0154] 将20％(质量百分比浓度)无菌葡萄糖溶液(溶质为葡萄糖，溶剂为无菌水)加入Trp营养缺陷液体培养基，使得到的培养基中葡萄糖的浓度为2％，将该培养基命名为葡萄糖-Trp缺陷液体培养基；将20％(质量百分比浓度)无菌葡萄糖溶液(溶质为葡萄糖，溶剂为无菌水)加入Trp营养缺陷固体培养基，使得到的固体培养基中葡萄糖的浓度为2％，将该培养制成的固体平板命名为葡萄糖-Trp缺陷平板；将20％(质量百分比浓度)无菌半乳糖溶液(溶质为半乳糖，溶剂为无菌水)加入Trp营养缺陷液体培养基，使得到的培养基中半乳糖的浓度为2％，将该培养基命名为半乳糖-Trp缺陷液体培养基。

[0155] 2.1、重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS生产白藜芦醇

[0156] 将重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS在葡萄糖-Trp缺陷平板上划线进行活化，挑取单菌落接种在葡萄糖-Trp缺陷液体培养基中，30℃，200rpm培养24h得到培养菌液。上述培养菌液离心去上清，沉淀用ddH2O洗3次，该沉淀即为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS菌体，然后用半乳糖-Trp缺陷液体培养基重悬重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS菌体得到重悬液，向重悬液中加入4-香豆酸，将得到的体系称为含4-香豆酸的培养体系，使4-香豆酸在该含4-香豆酸的培养体系中的浓度为12μg/mL，30℃培养24h后得到发酵液。

[0157] 取1mL上述发酵液，加入等量乙酸乙酯萃取，离心取上层乙酸乙酯层，挥发干燥后，加入50μL 50％(体积百分含量)甲醇水溶液，用过滤膜过滤得到WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS样品溶液。取上述样品溶液10μL，按照实施例3的方法进行HPLC-MS的检测。实验重复三次，每次重复设10个三角瓶。结果表明WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS样品溶液在该色谱条件下含有保留时间为22.623分钟的色谱峰，将该色谱峰命名为Nt4CL7aPcSTS色谱峰(图9中A)。向上述WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS样品溶液中加入上述白藜芦醇标准品得到共色谱样品，共色谱样品中的上述白藜芦醇标准品的质量含量为共色谱样品中的Nt4CL7aPcSTS质量含量的两倍。在完成WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS样品溶液的HPLC分析检测后的10分钟内，在相同的色谱条件下对共色谱样品进行HPLC分析。共色谱样品在该色谱条件下含有保留时间为22.461分钟的色谱峰，将该色谱峰命名为共色谱峰(图7中B)，该共色谱峰的峰高为Nt4CL7aPcSTS色谱峰的三倍，说明Nt4CL7aPcSTS色谱峰为白藜芦醇的色谱峰。

[0158] 2.2、重组酵母菌WAT11/pESC生产白藜芦醇

[0159] 除将2.1中的重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS替换为重组酵母菌WAT11/pESC，其余均相同。

[0160] 2.3、重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CLPPPcSTS生产白藜芦醇

[0161] 除将2.1中的重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS替换为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CLPPPcSTS，其余均相同。

[0162] 2.4、重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL生产白藜芦醇

[0163] 除将2.1中的重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS替换为重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL，其余均相同。

[0164] 2.5、重组酵母菌WAT11/pESC-PcSTS生产白藜芦醇

[0165] 除将2.1中的重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS替换为重组酵母菌WAT11/pESC-PcSTS，其余均相同。

[0166] 重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS在上述含4-香豆酸的培养体系所产的白藜芦醇的HPLC-MS的检测结果如图9、图10所示。结果表明，含有融合蛋白Nt4CL7aPcSTS基因的重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CL7aPcSTS在含4-香豆酸的培养体系中产生白藜芦醇，其产量为9.3μg/mL发酵液；重组酵母菌WAT11/pESC、WAT11/pESC-Nt4CL和WAT11/pESC-PcSTS在含4-香豆酸的培养体系中不产白藜芦醇；重组酵母菌WAT11/pESC-Nt4CLPPPcSTS在含4-香豆酸的培养体系的白藜芦醇的产量为1.3μg/mL发酵液。表明在酵母表达系统中利用融合蛋白Nt4CL7aPcSTS可提高白藜芦醇的产量。