利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用

摘要

本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是一种SSR引物组及其利用该引物鉴定石榴品种的方法；该SSR引物组由20条引物组成；鉴定步骤包括（1）石榴叶片DNA提取；（2）PCR扩增；（3）电泳检测；（4）数据记录；（5）结果判定。本发明引物特异性高，扩增效率好，能快速鉴定石榴的不同品种，具有周期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源特点。本发明可以用于对供试石榴品种与已知石榴品种进行品种鉴定，或构建石榴品种数据库。该方法为准确鉴定石榴种质资源，尤其是同物异名和同名异物现象奠定了基础，也为新品种保护奠定了基础。

权利要求

1.利用ssr引物鉴定石榴品种的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)提取各样品石榴种质DNA；

(2)利用设计的11对石榴SSR引物，扩增石榴的基因组DNA；

(3)电泳检测每个样品的扩增条带；

(4)记录每个样品每对引物的DNA扩增带型；

(5)根据DNA扩增带型区分鉴定石榴品种；

所述的11对石榴SSR引物序列如下：Pom04 F:TCCTTTTTACCCAATTTTCAR:TGCACATCTTTTGCTGTAAGPom06 F:TACTAGGTGGAACCGAACTTR:CCTTGACAACCTCATCTCATPom10 F:CCTCATTGCTGATGAATCTTR:ACTCGAGAAGCTCTGTGAAGPom13 F:CACACCCTTCATCAAAAGATR:GGACTAACAACCAGCCATAGPom14 F:CGCATTTGGTTGTAGAAGACR:AGGAGCGTCTGTTTTAATCTTPom21 F:GACTGGAAGAAGCAGAGACTR:GAAAAGGAAGTAGCAGAGCAPom24 F:GGAGATTTGAATTGGGAAGTR:GTGGACTAACTCAAGCAAGGPom39 F:TAGTTGAATAGGCCACATCCR:CTATACAGTCCGAGGACCACPom46 F:CTTCCTCCTACCGAACTATGR:CCCACTTTGACACTTCTACCPom55 F:GAGACAATTGGGATCAGAAAR:AGTCGACGAACTGTGAAATCPom56 F:CTCGCCATACTACTGAAAGGR:ATTGGGTGAGATATGTTTGG。

2.根据权利所要求1所述利用ssr引物鉴定石榴品种的方法，其特征是，所述步骤（2）中扩增程序为94℃预变性5min ;94℃变性45s,60℃复性45s,72℃延伸lmin,35个循环；最后

72℃延伸l0min,4℃保存。

3.根据权利要求2所述利用ssr引物鉴定石榴品种的方法，其特征是所述步骤(5)结果判定时，如果两个品种在两个或两个以上SSR标记位点具有不同等位，则判定为不同品种。

说明书

利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用

[0001] 技术领域：本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用。

[0002] 背景技术：

[0003] 品种鉴定是农业生产、作物育种和种子检验上的重要方法，也是保护作物品种、防止假冒伪劣品种进入市场的重要手段。传统的果树品种检验方法有形态学鉴定与同工酶鉴定等，但是，形态学鉴定所需周期长，耗费大量人力、物力和财力。石榴品种的纯正是石榴生产的重要环节。在石榴生产中，各种品种混杂现象严重，同名异物、同物异名现象严重，常规鉴定耗时较长，田间形态学鉴定难度较大，随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记技术不断成熟，给果树从品种基因组水平上的鉴定开辟了途径。

[0004] 发明内容：

[0005] 为实现上述石榴品种鉴定中出现的问题，本发明的目的在于，提出利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用，该方法利用分子标记技术，在营养生长期实现石榴品鉴定，具有周期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源，大大提高了品种鉴定的准确性。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种SSR引物组，该SSR引物组的序列如下：

[0007] Pom04 F:TCCTTTTTACCCAATTTTCA

[0008] R:TGCACATCTTTTGCTGTAAG

[0009] Pom06 F:TACTAGGTGGAACCGAACTT

[0010] R:CCTTGACAACCTCATCTCAT

[0011] Pom10 F:CCTCATTGCTGATGAATCTT

[0012] R:ACTCGAGAAGCTCTGTGAAG

[0013] Pom13 F:CACACCCTTCATCAAAAGAT

[0014] R:GGACTAACAACCAGCCATAG

[0015] Pom14 F:CGCATTTGGTTGTAGAAGAC

[0016] R:AGGAGCGTCTGTTTTAATCTT

[0017] Pom21 F:GACTGGAAGAAGCAGAGACT

[0018] R:GAAAAGGAAGTAGCAGAGCA

[0019] Pom24 F:GGAGATTTGAATTGGGAAGT

[0020] R:GTGGACTAACTCAAGCAAGG

[0021] Pom39 F:TAGTTGAATAGGCCACATCC

[0022] R:CTATACAGTCCGAGGACCAC

[0023] Pom46 F:CTTCCTCCTACCGAACTATG

[0024] R:CCCACTTTGACACTTCTACC

[0025] Pom55 F:GAGACAATTGGGATCAGAAA

[0026] R:AGTCGACGAACTGTGAAATC

[0027] Pom56 F:CTCGCCATACTACTGAAAGG

[0028] R:ATTGGGTGAGATATGTTTGG

[0029] 本发明的另一个目的是提供一种利用SSR引物组鉴定石榴品种的方法，包括如下步骤：

[0030] (1)提取各样品石榴种质DNA；

[0031] (2)利用设计的11对石榴SR引物，扩增石榴的基因组DNA；

[0032] (3)电泳检测每个样品的扩增条带；

[0033] (4)记录每个样品每对引物的DNA扩增带型；

[0034] (5)根据DNA扩增带型区分鉴定石榴品种；

[0035] 进一步，所述步骤（2）中PCR扩增程序为94℃预变性5min ;94℃变性45s,60℃复性45s,72℃延伸lmin,35个循环；最后72℃延伸lOmin,4℃保存。

[0036] 进一步，所述步骤（2）中PCR扩增体系包括20ng模板DNA，2.5 mmol/L Mg2+，0.2mmol/L dNTPs，lU TaqDNA聚合酶，每条引物250 nmol/L，10 X Buffero，体系中余量用ddH2O补齐。

[0037] 进一步，所述步骤(5)结果判定时，如果两个品种在两个或两个以上SSR标记位点具有不同等位，则判定为不同品种。

[0038] 本发明的有益技术效果是：本发明的引物特异性高，扩增效率好，能快速鉴定石榴的不同品种，具有周期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源特点。

[0039] 附图说明：

[0040] 图1本发明方法SSR引物经PCR扩增后产物检测图。引物Pom21和Pom46在石榴种质中的扩增图。

[0041] 图2利用本发明方法产生的不同品种聚类分析树形图。

[0042] 图3利用引物Pom14检测不同品种聚丙烯酰胺电泳结果图。

[0043] 图4利用引物Pom55检测不同品种聚丙烯酰胺电泳结果图。

[0044] 具体实施方式：

[0045] 下面结合具体实施实例对本发明做进一步的说明：

[0046] 实施实例

[0047] 材料与方法

[0048] 材料

[0049] 供试材料均采自安徽省水果产业技术体系蚌埠市水果综合试验站石榴品种园。收集蚌埠市怀远县栽培的石榴主要品种。其中包括大笨子及其芽变新品种（‘73-06’）。对各品种编号标记见表1。

[0050] 表1 石榴品种名称、编号

[0051]

[0052] 方法

[0053] 基因组DNA的提取

[0054] 石榴基因组DNA的提取采用改良CTAB法。

[0055] 石榴基因组DNA含量和纯度测定

[0056] 分光光度计法

[0057] 核酸因含有共轭的苯环而吸收紫外光，DNA和RNA的最大紫外光吸收波长为260nm，蛋白质的最大吸收波长为280nm。dsDNA的大致纯度可由260nm和280nm处的光吸收的比值来确定。纯dsDNA的OD260/OD280为1.8，纯RNA的OD260/OD280为2.0，如果DNA样品的OD260/OD280大于1.8说明有RNA污染。小于1.8说明有蛋白质污染。将提取好的DNA样品每份吸取15 µL用去离子水稀释至3mL，然后在紫外分光光度计上分别测定其OD260、OD280值，通常OD260=1，DNA浓度相当于50µg/mL，因此DNA浓度可用如下公式计算：DNA浓度（µg/mL）=OD260×50×200（稀释倍数）

[0058] 凝胶电泳检测

[0059] 取5 µL DNA提取液，于1.0%的琼脂糖凝胶电泳30~40 min，稳压80 V，照相，检测提取的基因组DNA的分子量大小及条带的清晰程度。

[0060] 分析

[0061] 石榴SSR反应体系包括20ng模板DNA，2.5 mmol/L Mg2+，0.2mmol/L dNTPs，lU TaqDNA聚合酶，每条引物250 nmol/L，10 X Buffero，体系中余量用ddH2O补齐。

[0062] 在紫外透射仪上观察电泳结果，并用黑白相机拍照（调节曝光时间），冲洗照片，并对图片进行扫描。

[0063] 根据图谱上条带的有无编码，有带为“1”，无带为“0”。对于弱带，三次重复中同时出现或者两次出现，认为有带，只是一次出现，认为无带。对于分辨率很差的暗带，弱带不参加编码。

[0064] 电泳图谱分析

[0065] 编码后应用SPSS 11.0 for Windows 软件，进行系统聚类（Hierarchical cluster），聚类系数采用欧氏距离平方（Squared Euclidean distance）和组间连接法（between-groups linkage）进行分析，得到石榴10个分析样本的聚类树状图。

[0066] 结果与分析

[0067] 2.3.1 SSR产物检测

[0068] 经PCR扩增反应后，产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。由图1可以看出，引物Pom21（左）和Pom46（右）经PCR扩增后，经过琼脂糖凝胶电泳，在100-200 bp附近有条带，说明有目的条带产生，反应产生了目的产物，可经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带大小及位点。

[0069] 核心引物筛选

[0070] 不同的引物直接影响试验的结果，为了不对结果产生影响，应选取条带清晰，重复性好，便于统计的引物扩增出的结果进行分析。本试验在所用11对引物中，共筛选出适合的，多态性好的SSR引物8对所选引物（见表2），用于最后的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[0071] 表2SSR引物编号及序列

[0072]

[0073] 注：表中黑体者为筛选出的8个引物。

[0074] 聚类分析

[0075] 对电泳后的条带进行统计，利用SPSS统计软件进行聚类分析(表3)，得出系统树状图（图2）。

[0076] 表3聚类分析表

[0077]

[0078] 基于SSR生成的石榴种质资源系统树状图（见图2），在欧式距离平方系数阈值为14.00-15.00时，所有品种聚为6大类，第1大类共3个品种，由‘73-06’、大笨子和青皮混合组成；第2大类共2个品种，由红玛瑙籽和红粉皮组成；第3大类共2个品种，由云南甜石榴、白玉石籽组成；第4大类共1个品种，为薄皮糙；第5大类共1个品种，为玉石籽；第6大类共1个品种，为酸绿籽。

[0079] 营养系品种‘73-06’变异条带分析

[0080] 通过SSR分析，“大笨子’与其营养系变异品种‘73-06’在筛选的8个引物中，有5个引物扩增出8条特异性条带。与‘大笨子’相比‘，73-06’在引物Pom13扩增图上多1条约490 bp的条带；在引物Pom14上多1条约35 bp的条带（见图3）；在引物Pom21上少3条约62 bp、110 bp、180 bp的条带；在引物Pom39上多1条约140 bp的条带；在引物Pom55上少2条约60 bp、87 bp的条带（见图4）。

[0081] 结论

[0082] 石榴种质资源的亲缘关系分析

[0083] 基于SSR标记的石榴种质资源聚类分析表明，在欧式距离平方系数阈值为14.00-15.00时，所有品种聚为6大类，品种之间有按照系谱聚类的趋势。而大笨子与其营养系变异‘73-06’在欧式距离平方系数阈值10.00即可归为一类，最早聚为一类。

[0084] SSR聚类分析认为，大笨子与其营养系变异‘73-06’归为一类，他们之间的遗传距离短，具有很近的亲缘关系。

[0085] “大笨子”营养系品种‘73-06’变异条带分析

[0086] 使用SSR分子标记技术，“大笨子’与其营养系变异品种‘73-06’在筛选的8对SSR特异引物中，有2对引物扩增出3条特异性条带，变异位点较多‘。73-06’较“大笨子”在DNA水平上出现了较大范围的变异。