绿盲蝽特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体提供了绿盲蝽特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。本发明根据绿盲蝽mtDNA的保守序列，设计了一对绿盲蝽特异性COI引物AluF1和AluR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)，经检测，该对引物仅对绿盲蝽具有特异性扩增能力，扩增产物大小为323bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.15625ng/μL。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。

权利要求

1.绿盲蝽特异性COI引物，其特征在于，其包括：正向引物AluF1：5’-TTTGGAAATTGACTAGTACCA-3’；

反向引物AluR1：5’-GGAAGTGATAATAATAACAGTAGG-3’。

2.用于检测绿盲蝽的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测绿盲蝽中的应用。

6.绿盲蝽的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物AluF1和AluR1进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μL计为：

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。

说明书

绿盲蝽特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及绿盲蝽特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。

背景技术

[0002] 绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)属于同翅目盲蝽科，体绿，善躲藏，反应敏捷，其若虫和成虫以刺吸式口器刺吸植物嫩芽、嫩叶、花蕾、幼果。绿盲蝽几乎遍布全国各棉区，危害棉花，影响棉花产量。尤其在近些年，随着转Bt基因棉花的大面积种植，其种群数量急剧上升，为害加重，由棉田次要害虫上升为主要害虫，甚至还影响了枣树、葡萄、梨、茶树等多种作物。当前，绿盲蝽已成为我国多种作物上的重要害虫，严重影响作物产量。因此，绿盲蝽防治工作应该受到足够的重视。

[0003] 在田间，绿盲蝽可被捕食性天敌捕食，比如：捕食性蝽类和蜘蛛等，但对这些天敌的捕食控制作用研究还很不充分。了解捕食性天敌对绿盲蝽的控制作用，充分利用和发挥这些天敌的潜力，对于更好地进行生物防治意义重大。又由于常规的肠道解剖、行为观察、血清学分析法或同位素标记等传统研究方法，不仅需要花费大量的时间，且费用昂贵，特异性不强，在使用中受到一定的制约。为了准确评估绿盲蝽捕食性天敌对绿盲蝽的控制作用，需要建立一套快速而准确的分子检测方法，但目前尚未有针对绿盲蝽的标准检测方法。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、高效快速等特点，再加上特异性引物可扩增得到物种特异性的条带，用此检测方法可将物种区分到种，在物种鉴定中发挥着极其重要的作用。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供绿盲蝽特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明根据绿盲蝽的线粒体DNA序列，设计筛选得到一对绿盲蝽特异性COI引物，其包括：

[0006] 正向引物AluF1：5’-TTTGGAAATTGACTAGTACCA-3’

[0007] 反向引物AluR1：5’-GGAAGTGATAATAATAACAGTAGG-3’。

[0008] 本发明还提供含有引物AluF1和AluR1的用于检测绿盲蝽的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

[0009] 本发明还提供所述引物AluF1和AluR1，以及含有引物AluF1和AluR1的试剂盒在检测绿盲蝽中的应用。

[0010] 本发明还提供一种绿盲蝽的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

[0011] 1)提取样品DNA；

[0012] 2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物AluF1和AluR1进行PCR扩增反应；

[0013] 3)分析PCR产物。

[0014] PCR反应体系以20μL计为：

[0015]

[0016] PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。

[0017] 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为323bp的DNA扩增条带(SEQ ID No.3)，则判定样品为绿盲蝽。

[0018] 本发明的有益效果在于：

[0019] 本发明根据GenBank中公布的绿盲蝽线粒体COI基因序列(Accession No.HQ902161.1)，设计一对特异性COI引物，该引物具有物种特异性，仅对绿盲蝽具有扩增效果，扩增产物大小为323bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.15625ng/μL，而对其它物种包括其近源种、盲蝽属的其它盲蝽以及其他昆虫无扩增能力。

[0020] 本发明在绿盲蝽检测方面具有很高的价值，尤其当需要检测大量的样品量时，本发明不仅节省时间而且准确性高，在实际应用中具有重要的意义。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例1中绿盲蝽特异性引物AluF1和AluR1在各昆虫物种中的检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“—”代表阴性对照。

[0022] 图2为本发明实施例2中绿盲蝽特异性引物AluF1和AluR1的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA Marker；1-12为模板DNA浓度依次2倍稀释浓度梯度；“—”为阴性对照。

具体实施方式

[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0024] 实施例1绿盲蝽特异性引物AluF1和AluR1对绿盲蝽的扩增效果

[0025] 1、绿盲蝽基因组的制备

[0026] 将单头绿盲蝽放入1.5mL离心管中将其磨碎进行提取。并将获得的DNA溶液储于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板。

[0027] 2、合成检测绿盲蝽的特异性COI引物

[0028] 绿盲蝽特异性COI引物序列如下：

[0029] 正向引物AluF1:5'-TTTGGAAATTGACTAGTACCA-3'

[0030] 反向引物AluR1:5'-GGAAGTGATAATAATAACAGTAGG-3'

[0031] 3、PCR扩增

[0032] 反应体系为20μL，包括：10×EasyTaq缓冲液2.0μL、dNTPs(2.5mM)0.4μL、EasyTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、正、反向引物(10μM)各0.4μL、模板DNA 1.0μL、ddH2O 15.6μL。

[0033] PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，共40个循环。

[0034] 4、PCR产物鉴定

[0035] 取PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。

[0036] 5、结果

[0037] 利用引物AluF1和AluR1，以绿盲蝽DNA为模板，以其他常见盲蝽和绿盲蝽捕食性天敌以及其他昆虫种类(见表1)为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，仅有7、8泳道对应的绿盲蝽扩增出了323bp的目的条带，说明本发明的引物特异性强。回收上述323bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID No.3所示。

[0038] 表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类

[0039]

[0040]

[0041]

[0042] 实施例2引物AluF1/AluR1对绿盲蝽最低检出量的测定

[0043] 按实施例1提取单头绿盲蝽基因组DNA，按照实施例1中所述反应体系与PCR反应条件进行扩增。然后原模板溶液(DNA溶液浓度为160ng/μL)以2倍进行递减梯度稀释，取1μL稀释后溶液作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。直至稀释到检测不出条带为止。

[0044] 利用引物AluF1/AluR1做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的绿盲蝽基因组DNA为模板进行PCR扩增，如图2中所示，泳道1的DNA浓度为160ng/μL，以2倍法递减稀释的DNA模板进行扩增，结果显示泳道11为DNA浓度最低检出限，DNA浓度检出限为0.15625ng/μL(图2)。

[0045] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。