一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用

摘要

本发明公开了一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用，属于动物源成分特异性检测技术领域。本发明所提供的引物组包括一对蓝狐物种成分检测引物、一对貉物种成分检测引物和一对犬物种成分检测引物，利用本发明所提供的引物组可以同时检测蓝狐、貉和犬物种成分。同时本发明还提供了一种利用引物组进行同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的方法以及含有引物组的试剂盒。本发明所提供的方法具有较高的特异性和敏感性、简单可靠、快速安全的特点，适用于肉制品、饲料和皮毛制品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测和鉴定。

权利要求

1.一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组，其特征在于，所述蓝狐物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；所述貉物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；所述犬物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述引物组，其特征在于，所述蓝狐物种扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述貉物种成分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述犬物种成分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.权利要求1所述引物组用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。

4.一种利用权利要求1所述引物组同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的方法，其特征在于，通过提取待测样品DNA，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示蓝狐特异性引物对序列、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示貉特异性引物对序列、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示犬特异性引物对序列为引物，进行PCR扩增，最后对扩增产物进行电泳检测和/或序列分析。

5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述待测样品DNA为线粒体基因组DNA。

6.权利要求4所述方法，其特征在于，所述蓝狐特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述貉特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述犬特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

7.权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR扩增，反应体系为50μL：DNA模板3μL；上游引物和下游引物各1.0μL；rtaq mix 2x酶25μL，纯水25μL；PCR反应程序为：预变性：94℃，

3min；进入循环：94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；终止延伸：72℃，

7min；4℃保存反应产物。

8.权利要求4所述方法用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。

9.一种含有权利要求1所述引物组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10×PCR缓冲液、10umol/L蓝狐物种成分正向引物、10umol/L蓝狐物种成分反向引物、10umol/L貉物种成分正向引物、10umol/L貉物种成分反向引物、10umol/L犬物种成分正向引物、10umol/L犬物种成分反向引物、10umol/L dNTP和5U/uLTaqDNA聚合酶；其中，蓝狐物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO.1所示，蓝狐物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO.2所示，貉物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO.3所示，貉物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO.4所示，犬物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO.5所示，犬物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO.6所示。

10.权利要求9所述试剂盒用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。

说明书

一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用，属于动物源成分特异性检测技术领域。

背景技术

[0002] 蓝狐也称北极狐，是属于犬科、北极狐属的毛皮动物，在我国作为特种养殖动物已有几十年的历史。蓝狐皮张性能优良，深受裘皮市场的青睐。近年来，蓝狐的毛皮制品市场需求量很大，养殖数量也不断扩大。貉属于犬科貉属动物，皮张作为主要的产品，冬季取皮后，蓝狐肉和貉肉经常被应用到动物饲料甚至是食品中。目前我国畜牧业行业中针对于毛皮动物肉的检验检疫相关管理规定仍处于空白阶段，对于毛皮动物肉营养价值的研究很少，并且人们对于食用毛皮动物肉存在认识上的误区，有些地区受到风俗习惯的影响，从心理上很难接受毛皮动物肉制品。

[0003] 近年来，羊肉卷市场比较混乱，很多压制的羊肉卷中掺杂着水貂肉、狐狸肉、貉子肉以及其他肉类，从感官上难以去分辨，也曾有调查发现，因为貉和犬都属于犬科动物，貉肉有被冒充为狗肉的现象，为了能快速、特异性检测出肉制品或者饲料中的貉的成分，有必要开发出一种基于分子水平貉源性成分的检测方法，为检验检疫部门或者消费者提供便利的技术服务，并且要求方法简便易于操作，检测成本低廉。

[0004] 目前，国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、驴、马、鹿属、狮、虎、豹等源性成分鉴定进行了研究报道。但是，在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上，对蓝狐、貉源性成分鉴别检测的研究很少，尤其是缺乏能够同时、有效检测和区分犬科动物成分的方法。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组，采取的技术方案如下：

[0006] 本发明的目的在于提供一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组，该引物组种蓝狐物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；所述貉物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；所述犬物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示。

[0007] 所述蓝狐物种扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述貉物种成分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述犬物种成分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

[0008] 所述引物组用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。

[0009] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物组同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的方法，该方法是通过提取待测样品DNA，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示蓝狐特异性引物对序列、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示貉特异性引物对序列、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示犬特异性引物对序列为引物，进行PCR扩增，最后对扩增产物进行电泳检测和/或序列分析。

[0010] 优选地，所述待测样品DNA为线粒体基因组DNA。

[0011] 所述方法中所述蓝狐特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述貉特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述犬特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

[0012] 所述PCR扩增，反应体系为50μL：DNA模板3μL；上游引物和下游引物各1.0μL；rtaq mix 2x酶25μL，纯水25μL；PCR反应程序为：预变性：94℃，3min；进入循环：94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；终止延伸：72℃，7min；4℃保存反应产物。

[0013] 所述方法应用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。

[0014] 本发明的另一目的在于提供一种含有所述引物组的试剂盒，该试剂盒包括10×PCR缓冲液、10umol/L蓝狐物种成分正向引物、10umol/L蓝狐物种成分反向引物、10umol/L貉物种成分正向引物、10umol/L貉物种成分反向引物、10umol/L犬物种成分正向引物、10umol/L犬物种成分反向引物、10umol/L dNTP和5U/uLTaqDNA聚合酶；其中，蓝狐物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO.1所示，蓝狐物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO.2所示，貉物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO.3所示，貉物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO.4所示，犬物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO.5所示，犬物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO.6所示。

[0015] 所述试剂盒用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。

[0016] 本发明针对线粒体基因组序列进行分析比对，从NCBI查找与蓝狐同属不同种的其他动物的线粒体基因组，获得遗传物质DNA信息序列，利用软件Clustal X进行序列比对，寻找蓝狐的特异性片段序列，在此基础上设计引物，目标是该引物只能扩增出蓝狐的特异性条带，不能扩增出其他动物的成分，利用电泳图谱比对，从而将蓝狐成分检测出来。从蓝狐肝脏组织中提取线粒体基因组，利用设计好的引物，摸索适宜的PCR反应条件，检测结果用电泳验证，同时将扩增条带进行测序分析，与已知相近物种序列进行比对来验证扩增条带的正确性。应用相同方法，设计了貉特异性引物和犬特异性引物。并且权衡比较引物扩增序列的大小，选取蓝狐的扩增序列如SEQ ID NO.7所示，貉的扩增序列如SEQ ID NO.8所示，犬的扩增序列如SEQ ID NO.9所示，便于在电泳图片中清晰地区分开来。PCR特异扩增产物进行测序分析，获得序列信息。

[0017] 本发明取得的有益效果如下：

[0018] 本发明所采用的方法，与其他涉及到方法相比较，具有以下3个显著特点：一是快速，从提取基因组到PCR扩增检验，历时1.5～2.0小时；较其他实时定量PCR以及蛋白质电泳等方法，时间上节约一倍以上。二是高度特异性，经实验反复验证，PCR反应体系中特异性引物只能扩增出目标物种条带，且清晰易于分辨；相比较传统感官判定，以及其他方法，特异性高是本发明的一大优势；三是灵敏性，本发明涉及到的方法，模板基因组DNA检出限为0.05mg/mL，能够用于小样本测试检验。

[0019] 此外，本发明所提供的方法实现了在同一反应体系中快速同时检测蓝狐、貉和犬物种成分，从而解决了实际中针对肉制品以及饲料等涉及到犬科动物成分的鉴定。该发明成果的应用能够为毛皮动物附属产品生产领域以及质量检测监督部门提供有效的甄别手段，且具有时效性高、成本低廉等特点。具有很好的潜在经济效益和社会效益。

附图说明

[0020] 图1为同时检测蓝狐、貉和犬的多重PCR电泳图；

[0021] (M为Marker2000；条带1、2、3为貉和犬双重PCR条带；条带4为蓝狐、貉和犬三重PCR条带)。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

[0023] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

[0024] 实施例1动物蓝狐、貉和犬线粒体基因组DNA的提取及引物设计

[0025] 分别取3种动物肌肉组织200mg，采用线粒体基因组DNA提取试剂盒，北京百浩生物科技有限公司购买。提取的DNA溶解于TE缓冲液中，保存于-20度备用。

[0026] 1.样本处理

[0027] a.组织匀浆：称取100～200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0mL冰预冷的细胞裂解液，0℃冰浴上下研磨组织20次；

[0028] 2.将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g离心5min；

[0029] 3.取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g再次离心5min。

[0030] 4.取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

[0031] 5.在线粒体沉淀中加入0.5mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min；

[0032] 6.取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

[0033] 7.加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ul DNASE I溶液(见准备工作)，混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，12,000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200ul TE重悬线粒体沉淀，4℃，12,000×g离心5min，洗去残留的DNA酶。

[0034] 8.得到的沉淀，用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10ul RNase A。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀(不可吹打)，放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12,000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。

[0035] 9.取上清，加入一新的离心管中(如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验)，加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管)及5-10ul核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右(此步可省)，4℃，12,000×g离心10min。

[0036] 10.弃上清，再加入1ml70％乙醇清洗，4℃，12,000×g离心5min。重复用70％乙醇洗一次。

[0037] 11.弃上清，再次离心1min吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-105min。

[0038] 12.加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。

[0039] 13.进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。

[0040] 从公共数据库Genbank中下载已经登录的犬科动物相关的的线粒体基因组序列，利用CLUSTAL软件进行比对分析，查找序列中特异的核苷酸位点，分别针对3种动物设计相应的引物，目的是扩增出每一种动物的特异性条带。同时兼顾3种物种你扩增目的条带片段大小相差100-200bp，便于电泳检测条带错开，肉眼观察即可区分。因此分别设计并且筛选了特异性强的3对引物，如核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。

[0041] 实施例2：PCR扩增及扩增产物鉴定

[0042] 将提取好的蓝狐、貉和犬科动物线粒体基因组DNA进行PCR扩增；

[0043] PCR检测的反应体系为50μL：提取的样品DNA模板3μL；所述的上游引物和下游引物各1.0μL；rtaq mix 2x酶25μL，纯水25μL。

[0044] PCR反应程序为：预变性：94℃，3min；进入循环：94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；终止延伸：72℃，7min；4℃保存反应产物。

[0045] PCR产物电泳检测及产物序列分析：将PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，15分钟后，凝胶成像系统观察，通过物种特异性条带大小，即可初步区分鉴定犬科3种动物。

[0046] 扩增条带核苷酸序列分析：将每一个物种特异性扩增电泳条带回收，进行序列测定分析，所得序列信息与Genbank登录已有相近物种序列信息进行序列比对，进一步从分子水平鉴定所获得实验结果即是针对目标物种的特异性条带。

[0047] 实施例3肉制品中同时检测蓝狐、貉和犬物种成分

[0048] 市场购买羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉、狗肉；实验站采集毛皮动物蓝狐、貉的肌肉样本。提取各个样本线粒体基因组，电泳检测。并且用分光广度计和核酸分析仪检测浓度和纯度。
符合要求的样品进行冷冻保存，做后续实验用。

[0049] 1、单一PCR检测

[0050] 将所获得的模板DNA，分别单一的加入3种动物中的任何一对引物，其结果为：羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉模板对于任何引物对均未能扩增出特异性条带。蓝狐、貉和犬均针对自我物种的引物出现特异性条带，而蓝狐和貉的引物未能在犬中获得特异条带。因此，所述的蓝狐、貉和犬特异引物对均具有本物种的特异性，而在其他涉及到的物种中不具备扩增条件。

[0051] 2、3重PCR检测。

[0052] 将蓝狐、貉和犬线粒体基因组等量混合，按照上述反应体系和条件，在同一体系中同时加入上述3对引物。结果表明，在上述反应条件下，同一体系中能够分别扩增3个特异条带(如图1所示)，即针对蓝狐、貉和犬。PCR检测的反应体系为50μL：提取的样品DNA模板3μL；所述的上游引物和下游引物各1.0μL；rtaq mix 2x酶25μL，纯水25μL。

[0053] PCR反应程序为：预变性：94℃，3min；进入循环：94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；终止延伸：72℃，7min；4℃保存反应产物。

[0054] 实施例4饲料中同时检测蓝狐、貉和犬物种成分

[0055] 提取饲料样品中线粒体基因组DNA，提取方法同上述，使用试剂盒方法。提取之后后续的单一PCR检测和多重PCR检测参照实施例3。

[0056] 将实验所涉及到的模板DNA混合后进行逐级稀释，稀释倍数分别为50％，20％，10％，1％，0.5％和0.1％。分别用稀释的模板使用相同的体系和条件进行PCR扩增，结果表明，模板稀释倍数为0.5％时，依然可以明显扩增出条带，此时浓度为0.05mg/mL。

[0057] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。