氨苄青霉噻唑酸检测试剂盒和检测方法

摘要

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、杂交瘤细胞株分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体和单克隆抗体在制备检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒方面的应用。一种用于检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒，包括酶标板、封闭液、氨苄青霉噻唑酸标准品、抗体工作液、酶标记抗体、显色液及终止液；所述抗体工作液为所述杂交瘤细胞株分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体的稀释液。本发明还涉及一种杂交瘤细胞和杂交瘤细胞分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体。本发明的有益效果为：采用特异性的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体，定量检测部分青霉素类药物及其代谢产物在动物性食品中的残留；检测结果快速、准确度高、重现性好、检测灵敏度高。

权利要求

1.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC NO.10112。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒方面的应用，所述氨苄氢霉噻唑酸的结构式如下：

4.一种用于检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒，其特征在于：包括酶标板、封闭液、氨苄青霉噻唑酸标准品、抗体工作液、酶标记抗体、显色液及终止液；所述抗体工作液为如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体的稀释液，所述氨苄氢霉噻唑酸的结构式如下：

5.根据权利要求4所述的一种用于检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒，其特征在于：还包括样品稀释液和浓缩洗涤液，所述样品稀释液为pH6.5～8.5的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为样品稀释液与吐温20的混合液。

6.一种利用权利要求4-5任一项所述的用于检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒在检测动物性食品中的应用。

说明书

氨苄青霉噻唑酸检测试剂盒和检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于酶联免疫试剂盒领域，具体涉及一种氨苄青霉噻唑酸检测试剂盒和检测方法。

背景技术

[0002] 青霉素类抗生素具有杀菌活性强、毒副作用小等特点，在动物饲养中应用非常广泛，主要用于治疗动物疾病，部分产品同时具有促进动物生长的作用。然而，动物性食品中残留的抗生素进入人体后，具有一定的危害作用。一般来说，动物性食品中残留的抗生素对人并不表现为急性毒性作用。人们长期摄入低剂量残留抗生素的食品，随着时间的推移，人体内残留的抗生素逐渐蓄积，从而引起各种慢性毒性作用。某些过敏体质的人在接触残留的抗生素后也可引起过敏(变态)反应。动物性食品中的抗生素残留对人体健康的影响广泛，会造成人体胃肠道菌群失调，导致机会性感染的可能性增加，还可表现为过敏、毒性作用、细菌耐药性、致畸、致突变和致癌作用等多个方面。

[0003] 氨苄青霉素为β-内酰胺类药物，其结构中的β-内酰胺环不稳定，在碱性环境及β-内酰胺酶存在的情况下易发生断裂，生成氨苄青霉噻唑酸，不易被相应氨苄青霉素抗体检出。而用其他检测方法，如薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)检测时，检测结果易受流动相pH值、温度和其他因素的影响而开环，导致TLC和HPLC方法的稳定性和重现性不好，回收率不高。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种氨苄青霉噻唑酸检测试剂盒和检测方法，具有快速高效、灵敏度高、重现性好的特点。

[0005] 本发明所采用的技术方案为：

[0006] 一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC NO.10112，保藏日期为2014年12月5日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0007] 一种由杂交瘤细胞株分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体。

[0008] 氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体在制备检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒方面的应用。

[0009] 一种用于检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒，包括酶标板、封闭液、氨苄青霉噻唑酸标准品、抗体工作液、酶标记抗体、显色液及终止液；所述抗体工作液为所述杂交瘤细胞株分泌的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体的稀释液。

[0010] 一种用于检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒，还包括样品稀释液和浓缩洗涤液，所述样品稀释液为pH6.5-8.5的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为样品稀释液与吐温20的混合液。

[0011] 一种氨苄青霉噻唑酸试剂盒在检测动物性食品中的应用。

[0012] 本发明的有益效果为：采用特异性的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体，定量检测青霉素类药物及其代谢产物在动物性食品中的残留；检测结果快速、准确度高、重现性好、检测灵敏度高。

附图说明

[0013] 图1是本发明进行精密度实验的实验数据。

具体实施方式

[0014] 本实验采用氨苄青霉噻唑酸偶联蛋白作为免疫原，从而获得氨苄青霉噻唑酸特异性抗体。氨苄青霉素结构如(式1)所示，青霉素代谢产物青霉噻唑酸的结构如(式2)所示，氨苄青霉噻唑酸结构式为(式3)所示。

[0015]

[0016] 式1氨苄青霉素结构式

[0017]

[0018] 式2青霉噻唑酸结构式

[0019]

[0020] 式3氨苄青霉噻唑酸结构式

[0021] 下面通过具体的实施例对本发明进行进一步的说明。

[0022] 实施例1杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备

[0023] 采用碳化二亚胺法，将氨苄青霉噻唑酸与匙孔嘁血蓝蛋白(mcKLH)进行偶联，合成免疫原。对5只6周龄的Balb/c小鼠进行免疫，共进行6次常规免疫及一次加强免疫，剂量为100μg/只，免疫时间间隔为2周，加强免疫的时间为第六次常规免疫后的三天。免疫结束后，获得小鼠的免疫脾细胞。骨髓瘤细胞取用SP2/0细胞，因为其在HAT选择性培养基中不能生长，且本身不能合成免疫球蛋白，因此用它进行细胞融合所获得的杂交瘤细胞只分泌均一的、完全来自于脾细胞的抗体分子，是较理想的可供融合的骨髓瘤细胞，并且具有容易培养、融合率高等优点。应用细胞融合技术建立杂交瘤细胞，采用间接ELISA法筛选出能够稳定分泌氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，进行传代、冻存。

[0024] 将生长状态处于对数期的阳性杂交瘤细胞从细胞瓶中吹洗下来，以1000rpm/min的速度离心l0min，弃上清液，收集细胞沉淀，用DMEM基础培养液将细胞沉淀悬浮，混匀细胞数调至106/mL对6周龄大的Balb/c小鼠进行腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.5mL。5～10天后获得含有氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体的腹水，对收集到的腹水采用辛酸-饱和硫酸铵法(辛酸用量：100μl/mL腹水)进行纯化，以除去腹水中含有的脂蛋白、脂质或细胞碎片等杂质，从而获得实验所需氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体。

[0025] 实施例2本发明的所述试剂盒的检测原理

[0026] 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原。其中，偶联抗原采用碳化二亚胺(EDC、DIC、DCC)法，将氨苄青霉噻唑酸标准品与载体蛋白(采用牛血清白蛋白、人血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白或卵清蛋白)进行偶联，形成本试剂盒所使用的包被原。样本中的残留氨苄青霉噻唑酸与微孔条上预包被的偶联抗原竞争氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体，充分反应后，加入酶标记抗体，酶标记抗体与残留的包被原特异性结合，然后用TMB底物显色液显色，标记在包被原上的酶与显色液反应，加入终止液后溶液由蓝色变成黄色。检测样品在450nm可见光下的吸光值，吸光度值与其所含残留氨苄青霉噻唑酸的含量成负相关，通过绘制标准曲线进行计算，即可得出相应样品中残留的氨苄青霉噻唑酸的含量。

[0027] 实施例3检测氨苄青霉噻唑酸的试剂盒的制备

[0028] 一、试剂盒所含成分：酶标板、封闭液、酶标记抗体、抗体工作液、显色液、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液、氨苄青霉噻唑酸标准品。

[0029] 配制试剂盒内的各溶液

[0030] 1.样品稀释液(磷酸盐缓冲液)：取磷酸二氢钾与十二水磷酸氢二钠，配制成pH6.5～8.5的磷酸盐缓冲液。

[0031] 2.封闭液：取血清蛋白(牛血清白蛋白、人血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血 清蛋白或卵清蛋白)，制成浓度为0.8～1.5％的封闭液。

[0032] 3.浓缩洗涤液(10X)：量取100ml样品稀释液(1X)，加入40～60μL的吐温20，混匀，即得。

[0033] 4.抗体工作液：取氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体稀释100000～150000倍，即得。

[0034] 5.酶标记抗体：酶标记中的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记物为羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗。酶标记抗体可通过市场采购获得，将采购的酶标记抗体稀释10000～20000倍。

[0035] 6.底物显色液：显色A液、显色B液

[0036] 显色A液：为1.5～2.5％的过氧化氢的水溶液：显色B液：为0.5～2.5％的四甲基联苯胺的水溶液；

[0037] 7.系列标准溶液：取氨苄噻唑酸标准品，分别制成浓度为0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb、24.3ppb、72.9ppb、218.7ppb、500ppb的标准品溶液。

[0038] 8.终止液：选用1.5～2.5M的硫酸溶液。

[0039] 二、试剂盒包装

[0040]96孔酶标板 2块
封闭液 50mL
样品稀释液(10X) 100mL
浓缩洗涤液(10X) 100mL
抗体工作液 20mL
酶标记抗体 30mL
显色A液 15mL
显色B液 15mL
终止液 15mL
系列标准溶液 每个浓度各500μL

[0041] 三、氨苄青霉噻唑酸检测试剂盒的操作步骤

[0042] 1、将试剂盒从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min左右后使用，所有试剂使用前应充分摇匀；

[0043] 2、根据实验需求取出所需要的板条，将不用的板条放入自封袋内，置于4℃保存；

[0044] 3、配制洗涤液和样品稀释液：将浓缩洗涤液(10X)与样品稀释液(10X)分别用去离子水按照1：9稀释；

[0045] 4、将所取用酶标板中孔内液体甩干，加入洗涤液200μl孔，洗涤3次，每次2min，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)待用；

[0046] 5、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号并记录标准孔和样本孔所在的位置；6、样品前处理：取2～5ml待测样品(如牛奶，或者其他动物性食品)，除去其中动物性蛋白后，用样品稀释液稀释10倍，即得样品待测液；

[0047] 若用于间接检测动物性食品中残留β-内酰胺类药物原型及其代谢产物，则用0.2mol/L NaOH与处理后的样品原液按照1:1比例添加，充分混匀，用1mol/LNaOH溶液调pH值至大于12，室温下充分搅拌30min，用1mol/L HCL调节溶液pH值至8左右，纪录样品处理后终体积，30℃水浴48h后将样品中残留β-内酰胺类药物原型转换成相应药物代谢产物，用样品稀释液稀释10倍，即得样品待测液；

[0048] 7、加样：分别移取系列标准溶液的各浓度对照溶液、处理好的样本到各自标号的微孔(即50μl/孔)中，然后加抗体工作液50μL/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。在温度37℃环境中反应30min；

[0049] 8、取出酶标板，将孔内液体甩干，加入洗涤液200μL/孔，洗涤3次，每次2min，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)；

[0050] 9、加酶标记抗体：每个微孔中分别加入酶标记抗体100μL，盖板膜盖板后，置37℃环境中反应30min。然后将微孔内液体甩干，加入洗涤液200μL/孔，洗涤3次，每次2min，用吸水纸拍干；

[0051] 10、显色：将显色A液与显色B液按照1：1比例充分混合，每个微孔中加入混匀后的显色液100μL，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色20min；

[0052] 11、测定：每个微孔中加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光光度值(OD值)；导出数据进行计算。

[0053] 实施例4氨苄青霉噻唑酸试剂盒的检测结果

[0054] 一、精密度试验

[0055] 试验方法：

[0056] 采用间接竞争ELISA法测定不同浓度(0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、72.9ppb、218.7ppb、500ppb)氨苄青霉噻唑酸标准品的OD值，方法同本试剂盒的检测方法，以标准品吸光值百分比为纵坐标，以氨苄青霉噻唑酸标准品浓度(ng/mL)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，验证本检测方法的精密度。试验数据见附图1。

[0057] 结论：从实验数据看出，本检测方法精密度较高，标准曲线线性相关R2值为 0.9779(>0.95)，符合检测基本要求。

[0058] 二、准确度实验

[0059] 实验方法：

[0060] 取空白牛奶，按4ng/mL、10ng/mL的浓度添加氨苄青霉噻唑酸，按照样品处理方法提取样品液，进行间接竞争ELISA检测，每个添加浓度分别做5倍及10倍稀释并做三个平行重复孔。读取OD450吸光值后根据抑制率计算方程计算添加样品提取液中氨苄青霉噻唑酸含量，并计算其添加回收率。

[0061]

[0062] 实验数据：

[0063]

[0064] 结论：本试剂盒检测结果均大于87％，回收率较高。

[0065] 三、最低定量限：采用间接竞争ELISA法测定不同浓度氨苄青霉噻唑酸标准品的OD450，当浓度为0.1ppb时，可得到结果重现性好的数据，因此，最顶定量限为0.1ppb。

[0066] 四、交叉反应率试验

[0067] 实验方法：

[0068] 采用采用间接竞争ELISA法测定并计算相关β-内酰胺类药物及其代谢产物(具体检测药物如下)的IC50值，根据交叉反应率计算方程进行计算。

[0069]

[0070] 药物的处理方法：

[0071] 取β-内酰胺类药物标准品0.2g，加入0.2mol/L NaOH 2mL，充分混合溶解后，用1mol/L NaOH调溶液pH值至大于12，室温下充分搅拌30min后，用1mol/L HCL调节溶液pH值至8.7，30℃水浴48h后生成相应药物代谢产物，4℃保存。

[0072] 实验结果：

[0073] 药物原型之间的交叉反应率：

[0074]

[0075] 药物代谢产物直接的交叉反应率：

[0076]

[0077] 五、稳定性试验

[0078] 保存稳定性试验试验周期为1周、2周、4周、8周、12周、24周、48周。分别进行标准曲线的建立及添加回收实验，检测试剂盒内试剂的有效性及试剂盒的保存稳定性。结果表明，保存稳定性时间为48周。

[0079] 六、结果测定

[0080] 1、百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(阴性对照)的吸光度值，再乘以100％，即得，[0081]

[0082] B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

[0083] B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

[0084] 2、标准曲线的绘制与计算

[0085] 以标准品百分吸光率为纵坐标，以氨苄青霉噻唑酸标准品浓度(ng/mL)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中残留氨苄青霉噻唑酸实际浓度。

[0086] 本发明采用特异性的氨苄青霉噻唑酸单克隆抗体，采用间接竞争ELISA法定量检测青霉素类药物及其代谢产物在动物性食品中的残留；可在短时间内完成若干批样品的同时检测，且检测结果快速、准确度高、重现性好、检测灵敏度高。

[0087] 本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其方法或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。