一种青稞生物防治抗病促生方法

摘要

本发明公开了一种青稞生物防治抗病促生方法，包括：将枯草芽孢杆菌制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；将青稞健康秸秆剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施枯草芽孢杆菌高密度菌悬液，经发酵后得到能有效抑制杀灭青稞病理真菌的生物肥，将该生物肥用在青稞生物防治抗病促生上。本发明中，产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌是对青稞起抗病促生作用的植物益生菌，将其加入堆肥中，显著加强对青稞病害真菌的生物防治作用，显示对鞘腐病病原菌有抑制杀灭作用，并提高青稞产量。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。

权利要求

1.一种青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；

2)将青稞健康秸秆剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭青稞病理真菌的生物肥，将该生物肥用在青稞生物防治抗病促生上。

2.根据权利要求1所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为

109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。

3.根据权利要求2所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为

109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。

4.根据权利要求2或3所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：调节pH＝6.5～7.5。

5.根据权利要求4所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：调节pH＝7.0。

6.根据权利要求1所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。

7.根据权利要求6所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。

8.根据权利要求1所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。

9.根据权利要求1所述的青稞生物防治抗病促生方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵采用自然状态下发酵。

说明书

一种青稞生物防治抗病促生方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物防治肥的制备领域，具体涉及一种青稞生物防治抗病促生方法。

背景技术

[0002] 青稞(Hordeum vulgare Linn.var.nudum Hook.f.)是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦，主要产自中国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族主要粮食。青稞在青藏高原上种植约有3500年历史，从物质文化之中延伸到精神文化领域，在青藏高原上形成了内涵丰富、极富民族特色的青稞文化。青稞有广泛药用及营养价值，已推出青稞挂面、青稞馒头、青稞营养粉等青稞产品。青稞是西藏四宝之首糌粑的主要原料。

[0003] 鞘腐病是青稞主要病害，Phoma macdonaldii是病原菌之一。植物病理真菌主要存在于土壤中，在植物生长中感染植物，引起植物病害、造成生产损失。因此，要从生物防治角度消除植物真菌病害，杀灭或抑制土壤中的病理真菌至关重要，而使用具有生物防治功效的生物肥是实现这一目的的有效途径。生物肥发展趋势应是大力发展抗逆性高、能够长期稳定生存的芽孢杆菌。特别是芽孢杆菌能够产生多种抗真菌物质，对植物病原菌有显著抑制作用，并且对人畜无害，也不会污染环境，将在防治植物真菌病害中起重要作用。

[0004] 芽孢杆菌形态上呈直或者近直的杆状，好氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性，在特定环境条件下能产生抗逆性内生孢子。芽孢杆菌在植物中广泛定殖，被认为是公认的食品级安全微生物(generally regarded as safety,GRAS)。枯草芽抱杆菌是一种典型的芽孢杆菌，产生抗菌蛋白、多肽类物质、脂类物质及beta葡聚糖酶等抗菌物质，特别是beta葡聚糖酶等水解酶类与其抗植物病理真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的组成是葡聚糖。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种青稞抗病促生的生物防治法，通过将产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)融入青稞天然菌群中，制成能够通过生物防治途径有效抑制杀灭青稞病理真菌的生物肥。

[0006] 一种青稞生物防治抗病促生方法，包括以下步骤：

[0007] 1)将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；

[0008] 2)将青稞健康秸秆剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭青稞病理真菌的生物肥，将该生物肥用在青稞生物防治抗病促生上。

[0009] 本发明中，将青稞健康秸秆剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康青稞植株本身天然菌群，此菌群与青稞植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。进一步地，将能够产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)加入堆肥中，显著加强对青稞病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对青稞植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，故能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是青稞益生菌，对青稞病理真菌有显著生物防治作用。

[0010] 步骤1)中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为2007年，菌种保持编号为10339。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)可以向中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。

[0011] 将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。

[0012] 进一步优选，将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。

[0013] 所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：

[0014]

[0015]

[0016] 进一步优选，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：

[0017]

[0018] 液体培养基在121℃灭菌20min。

[0019] 步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。

[0020] 堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。

[0021] 步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。所述的发酵采用自然状态下发酵。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0023] 本发明中，将青稞健康秸秆剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康青稞植株本身天然菌群，此菌群与青稞植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。

[0024] 枯草芽孢杆菌(CICC 10339)产beta葡聚糖酶，强力破坏病理真菌细胞壁，对病理真菌有显著抑制杀灭作用。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中富含的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是青稞益生菌，对青稞病理真菌有显著生物防治作用。

[0025] 堆肥过程在自然状态下进行，依靠微生态稳定的青稞植株天然菌群进行发酵，而枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对青稞植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，因此，枯草芽孢杆菌(CICC10339)能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。

具体实施方式

[0026] 实施例1

[0027] 1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.22×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为2％，
37℃振荡培养24h，菌液密度为2.46×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。

[0028] 2)将青稞健康秸秆共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液2L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥，即能有效抑制杀灭青稞病理真菌的生物肥。

[0029] 3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有Beta葡聚糖酶活力，对青稞病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表1。

[0030] 鞘腐病病原菌Phoma macdonaldii购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种编号为2613。

[0031] Beta葡聚糖酶活力测定：采用还原糖测定法，Beta葡聚糖酶能够将Beta葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色深浅与还原糖生成量成正比，而还原糖生成量又与反应液Beta葡聚酶活力成正比，从而利用比色测定反应液的吸光值计算还原糖生成量，得到Beta葡聚糖酶活力。Beta葡聚酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解Beta葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活单位(IU)。

[0032] 平板抑制抑菌宽带：采用平板喷雾法，待测菌株点接在NA平板，每平板2株，各3个重复，28℃培养24h，把蘸有氯仿的滤纸片放进倒置的培养皿底部熏蒸20min，重复一次，杀死待测菌；将病原真菌配成108菌悬液，用无菌喉头喷雾器迅速将其喷在接有待测菌的平板上(0.1ml/皿)，28℃继续培养48-60h后，记录形成抑菌圈大小。

[0033] 平板拮抗：将NA培养基倒入平板，凝固后在培养基上成三角放置牛津杯，向牛津杯内加入发酵液100μL，28℃温箱培养，待病原真菌生长后记录抑菌圈大小。

[0034] 表1

[0035]

[0036] 注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。

[0037] 实施例2

[0038] 1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.80×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，
37℃振荡培养24h，菌液密度为3.34×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。

[0039] 2)将青稞健康秸秆共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥。

[0040] 3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有Beta葡聚糖酶活力，对青稞病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表2。

[0041] 表2

[0042]

[0043]

[0044] 注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。

[0045] 实施例3