长柄侧耳菌株及其培养基、培养方法与应用

摘要

本发明涉及真菌栽培领域和真菌液体发酵领域，尤其涉及长柄侧耳菌株及其培养基、培养方法与应用。本发明提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌株，并提供了该菌株的种子培养基、种子培养方法、栽培方法和培养基、液体发酵方法和培养基，并提供了该菌种液体发酵后菌丝菌液(发酵菌丝和发酵液)及其代谢产物的用途。本发明提供的菌种具有良好的稳定性，代谢能力强，传代25代未见老化或退化。采用本发明提供的栽培方法和固体培养基进行栽培，所得长柄侧耳产量高，品质好，生物转化率高。采用本发明提供的液体培养基和发酵方法制备发酵菌丝，菌丝生长迅速，菌丝均匀分枝少，代谢产物丰富。

权利要求

1.一种长柄侧耳菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.7359。

2.一种保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子培养基，其特征在于，包括斜面培养基、摇瓶培养基、种子罐培养基；

其中，所述斜面培养基为PDA培养基；

所述摇瓶培养基中包括如下质量分数的组分：2％～3％碳源、1％～2％氮源、0.1％～

0.15％KH2PO4、0.1％～0.15％MgSO4，自然pH值；

所述种子罐培养基包括如下质量分数的组分：1％～4％碳源、0.2％～4％氮源和0.1％～0.15％KH2PO4，自然pH值；

所述摇瓶培养基中，所述碳源为蔗糖或葡萄糖；所述氮源为蛋白胨或酵母粉；

所述种子罐培养基中，所述碳源为蔗糖、葡萄糖或玉米粉中一种或两者以上的混合物；

所述氮源为麦麸汁、蛋白胨、酵母粉或豆饼粉中一种或两者以上的混合物。

3.一种保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将保藏编号为CGMCC No.7359的菌种接种于如权利要求2所述斜面培养基，25℃±3℃培养90h～96h，获得斜面菌丝；

步骤2：将所述斜面菌丝接种于如权利要求2所述的摇瓶培养基，25℃±3℃，转速160r/min～220r/min，培养140h～150h，获得摇瓶菌液；

步骤3：将所述摇瓶菌液接种于如权利要求2所述的种子罐培养基，25℃±3℃培养100h～150h，获得保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌种子。

4.一种保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的固体培养基，其特征在于，包括如下质量份的组分：碳源60份～90份、氮源5份～38份、石膏0份～2份、蔗糖0份～2份、石灰0份～

2份；

所述碳源为稻草秸秆粉、玉米秸秆粉、麦秸粉、玉米芯粉、锯木屑或棉籽壳中一种或两者以上的组合；

所述氮源为麦麸、米糠或豆饼粉中一种或两者以上的组合。

5.一种保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的栽培方法，其特征在于，培养保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子，接种于如权利要求4所述的固体培养基，经发菌后，子实体生长，采收获得长柄侧耳菌；

所述发菌的条件为：培养基湿度55％～65％，空气相对湿度60％～70％，温度20℃～30℃；

所述子实体生长的条件为：培养基湿度55％～65％，空气相对湿度85％～95％，温度7℃～24℃。

6.根据权利要求5所述的栽培方法，其特征在于，所述子实体生长的条件中，温度为：白天20℃～22℃，夜晚10℃～12℃。

7.一种保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的液体培养基，其特征在于，由以下质量分数的组分组成：碳源1％～4％、氮源0.2％～4％、KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值；

所述碳源为蔗糖、葡萄糖或玉米粉中一种；

所述氮源为麦麸汁、蛋白胨、酵母粉或豆饼粉中一种。

8.一种保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的液体发酵方法，其特征在于，包括：培养保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子，接种于如权利要求7所述的液体培养基，经灭菌后，于25℃±3℃培养100h～150h，放罐，获得发酵菌液；

所述培养的条件为：通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，罐压0.5kg/cm2。

9.根据权利要求8所述的液体发酵方法，其特征在于，所述保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子与如权利要求7所述的液体培养基的质量比为1：(8～12)。

10.如权利要求8或9所述方法制备的发酵菌液在制备食品、饮品、药品或保健品中的应用。

说明书

长柄侧耳菌株及其培养基、培养方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及真菌栽培领域和真菌液体发酵领域，尤其涉及长柄侧耳菌株及其培养基、培养方法与应用。

背景技术

[0002] 长柄侧耳为担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属Pleurtus spodotecus Fr.的子实体。别名为灰白侧耳，可食用。此菌在自然界中侵害白杨、白桦树木，使倒木、伐木等形成白色腐木。其子实体肉质，中等大小，散生或丛生。菌盖扁半球形，渐平展为扇形，宽3-10cm；菌面光滑，白色，中央淡黄色，干后黄褐色。菌肉厚，柔软，白色，菌柄偏生至侧生，近圆柱形，中实，白色，长4-12cm，粗0.5-1.5cm。菌褶白色，延生，稍稀。孢子无色，光滑，圆柱形，8-10.5μm×3-4μm。秋季于阔叶树枯干上丛生。分布地区于吉林、云南、西藏等。长柄侧耳肉质细腻，味鲜可口，营养丰富，子实体干品含有丰富的蛋白质、粗多糖、粗纤维等，还含有多种氨基酸、维生素和矿物元素，其粗多糖具有抗肿瘤、提高免疫力的功效，据文献报道长柄侧耳子实体的水提液对小白鼠的抑瘤率为72％。长柄侧耳中还含有麦角甾醇、洛伐他汀、甘露醇等次级代谢物。麦角甾醇具有抗炎和抗癌作用；洛伐他汀具有降血脂和预防组织纤维化的作用；甘露醇具有脱水、利尿作用。甘露醇可以降低颅内压、眼内压、防止肾小管坏死等；长柄侧耳多糖为免疫增强剂和免疫激活剂，提高人体的免疫力，增强抗病的能力。

[0003] 由于长柄侧耳是一种美食，同时又具有一定的药效作用，目前市场对长柄侧耳的需求越来越大，但是长柄侧耳野生资源较少，近年来的大量采摘已导致其种植资源濒临枯竭。因此，为了开发新资源，维护生态平衡，做到既保护资源，又利用资源，利用真菌的生物学特性、结合长柄侧耳生长发育过程中靠菌丝体吸收营养繁殖的特点，进行分离、纯化和选育出优良菌种并将其用于长柄侧耳的栽培或发酵具有重要的经济意义和社会意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种长柄侧耳菌株及其培养基、培养方法与应用。本发明提供的长柄侧耳菌株生长发育快，培养得到的子实体产量高，发酵得到的菌丝代谢产物丰富。

[0005] 本发明提供了一种长柄侧耳菌，其保藏编号为CGMCC No.7359。

[0006] 本发明提供的菌株系从吉林省德惠市朱城子乡杨树枯木上生长的长柄侧耳子实体中经过分离、纯化、筛选，并通过系统选育而得到的性能稳定的菌株。本发明提供的长柄侧耳菌株菌落呈白色，菌丝为白色棉絮状，茂密洁白。菌丝生长发育速度快，适宜条件下4天可长满全斜面。摇瓶培养或种子罐培养后菌液澄明，黄褐色，菌丝呈放射状球体，有较浓的水果香味。通过16×100倍生物显微镜检查，菌丝淡黄色，粗壮，均匀，分枝多，锁状联合明显可见，无杂菌污染。本发明提供的长柄侧耳菌株具有良好的稳定性，代谢能力高，安全性高，其传代25代未见老化或退化，发酵培养时间短，栽培生长速度快，次生代谢产物含量高，具有良好的食用和药用价值。实验证明，经发酵培养获得的发酵菌丝干燥后，长柄侧耳多糖的质量分数不少于3％；洛伐他汀含量不少于188.00μg/g；麦角甾醇含量不少于70.00μg/g。

[0007] 本发明提供的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的菌种保存于2℃～4℃，长期保存的菌种，须在180天左右转管一次。如发现菌种的菌落稀薄，白色絮状菌丝纤细、颜色变深，说明菌种已老化，则需进行菌种复壮。

[0008] 菌种复壮的方法为菌种基内菌丝分离复壮、断桥式脱毒技术或改变菌种培养基的方法复壮菌种。

[0009] 其中，菌种基内菌丝分离复壮：选择无污染、生长旺盛的菌种，用解剖针挑取先端菌丝，接种在PDA培养基上，25℃培养箱中避光培养。

[0010] 断桥式脱毒技术：用常规法制备PDA培养基，在培养基凝固后，在无菌条件下，用接种耙把培养基斜面最前端较薄的培养基断开约1厘米，把待接母种接在试管中间培养基上，当菌丝长到断开处时，则会继续伸长，穿越断开处，伸入前端的小块培养基上，经过断裂又伸长，菌丝显得格外粗壮、有力。转接时，挑取小块培养基最前端的一块组织，按常规接种，这样经过3-4次尖端挑取培养，便可甩掉病毒。

[0011] 改变菌种培养基的方法复壮菌种：将菌种PDA培养基换成马铃薯综合培养基(葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，KH2SO40.3％，MgSO40.15％，VB10.001％，pH自然)或换成完全培养基(葡萄糖2％，蛋白胨0.2％，琼脂1.5％，KH2SO40.046％，MgSO40.05％，，pH自然)培养。选择无污染、生长旺盛的菌种，用解剖针挑取先端菌丝，接种在PDA培养基上，25℃培养箱中避光培养。

[0012] 本发明提供的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的菌种保存过程中的培养基为PDA培养基。

[0013] PDA培养基中各组分的质量分数为：葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。

[0014] 本发明提供的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的菌种用于栽培或发酵罐培养前，需先制备种子。

[0015] 本发明提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子培养基，包括斜面培养基、摇瓶培养基、种子罐培养基；

[0016] 其中，斜面培养基为PDA培养基；

[0017] 摇瓶培养基中包括如下质量分数的组分：2.5％～3.5％碳源、1％～2％氮源、0.1％～0.15％KH2SO4、0.1％～0.15％MgSO4，自然pH值；

[0018] 种子罐培养基包括如下质量分数的组分：1％～4％碳源、0.2％～4％氮源和0.1％～0.15％KH2PO4，自然pH值；

[0019] 摇瓶培养基中，碳源为蔗糖或葡萄糖；氮源为蛋白胨或酵母粉；

[0020] 种子罐培养基中，碳源为蔗糖、葡萄糖或玉米粉中一种或两者以上的混合物；氮源为麦麸汁、蛋白胨、酵母粉或豆饼粉中一种或两者以上的混合物。

[0021] 在一些实施例中，摇瓶培养基中包括如下质量分数的组分：蔗糖2％～3％，蛋白胨1％～2％，KH2SO40.1％～0.15％，0.1％～0.15％MgSO4，自然pH值。

[0022] 在一些实施例中，摇瓶培养基中包括如下质量分数的组分：葡萄糖2％～3％，酵母粉1％～2％，KH2SO40.1％～0.15％，0.1％～0.15％MgSO4，自然pH值。

[0023] 在一些实施例中，摇瓶培养基中包括如下质量分数的组分：蔗糖3％，蛋白胨2％，KH2SO40.1％，MgSO40.1％，自然pH值。

[0024] 在一些实施例中，种子罐培养基中包括如下质量分数的组分：蔗糖1％～3％，麦麸汁1％～3％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0025] 在一些实施例中，种子罐培养基中包括如下质量分数的组分：葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～2％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0026] 在一些实施例中，种子罐培养基中包括如下质量分数的组分：玉米粉2％～4％，酵母粉0.2％～2％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0027] 在一些实施例中，种子罐培养基中包括如下质量分数的组分：玉米粉2％～4％，豆饼粉2％～4％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0028] 在一些实施例中，种子罐培养基中包括如下质量分数的组分：蔗糖3％，麦麸汁2％，KH2PO40.1％，自然pH值。

[0029] 本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子培养方法，包括以下步骤：

[0030] 步骤1：将保藏编号为CGMCC No.7359的菌种接种于本发明提供的斜面培养基，25℃±3℃培养90h～96h，获得斜面菌丝；

[0031] 步骤2：将斜面菌丝接种于本发明提供的摇瓶培养基，25℃±3℃，转速160r/min～220r/min，培养140h～150h，获得摇瓶菌液；

[0032] 步骤3：将摇瓶菌液接种于本发明提供的种子罐培养基，25℃±3℃培养100h～150h，获得保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌种子。

[0033] 作为优选，步骤1中培养的温度为25℃±1℃。

[0034] 在一些实施例中，斜面菌丝在接种于摇瓶培养基前可于2℃～4℃保存。

[0035] 在一些实施例中，斜面菌丝的保存时间不大于30d。

[0036] 作为优选，步骤2中斜面菌丝与摇瓶培养基的比例为1:6。

[0037] 具体的，步骤2中每个斜面培养基接种6个摇瓶。

[0038] 作为优选，步骤2中培养的温度为25℃±1℃，时间为144h。

[0039] 作为优选，经步骤2培养，每升发酵液中菌丝干重不小于12g。

[0040] 经步骤2培养，菌液澄明，黄褐色，菌丝呈放射状球体，有较浓的水果香味，无杂菌污染。

[0041] 作为优选，步骤3中，摇瓶菌液与种子罐培养基的质量比为1:10。

[0042] 作为优选，步骤3中培养的条件为通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin。

[0043] 作为优选，步骤2中培养的温度为25℃±1℃，时间为120h。

[0044] 作为优选，经步骤3培养，每升发酵液中菌丝干重不小于15g，pH值为5.5～6，还原糖的质量分数为3％～5％，氨基氮的质量分数为10％～20％。

[0045] 经步骤3培养，镜检菌丝均匀，粗壮，分枝多，锁状联合明显可见；发酵液呈黄棕色、澄明，有淡淡的水果香味；无杂菌污染。

[0046] 采用本发明提共的方法活化培养种子，得到的种子生命力强，活性高，长势好，代谢产物多。

[0047] 一种保藏编号为CGMCC No.7359的柄侧耳菌的固体培养基，包括如下质量份的组分：碳源60份～90份、氮源5份～38份、石膏0份～2份、蔗糖0份～2份、石灰0份～2份；

[0048] 碳源为稻草秸秆粉、玉米秸秆粉、麦秸粉、稻草粉、玉米芯粉、锯木屑或棉籽壳中一种或两者以上的组合；

[0049] 氮源为麦麸、米糠或豆饼粉中一种或两者以上的组合。

[0050] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：稻草秸秆粉80份～90份，麦糠8份～16份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0051] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：玉米秸秆粉80份～90份，米糠8份～16份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0052] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：麦秸粉80份～90份，麦麸8份～16份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0053] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：稻草粉80份～90份，麦麸10份～20份。

[0054] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：稻草粉80份～90份，米糠10份～20份。

[0055] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：稻草粉90份～95份，豆饼粉5份～10份。

[0056] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：玉米芯粉60份～70份，麦麸30份～38份，石膏1份～2份。

[0057] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：玉米芯粉60份～70份，米糠30份～38份，石膏1份～2份。

[0058] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：锯木屑75份～80份，麦麸16份～21份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0059] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：锯木屑75份～80份，米糠16份～21份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0060] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：棉籽壳80份～90份，麦麸8份～16份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0061] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：棉籽壳80份～90份，米糠8份～16份，石膏1份～2份，蔗糖1份～2份。

[0062] 在一些实施例中，固体培养基中包括如下质量份的组分：稻草粉87份、麦麸10份、石膏2份、蔗糖2份。

[0063] 本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的栽培方法，为培养保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子，接种于本发明提供的固体培养基，经发菌后，子实体生长，采收获得长柄侧耳菌；

[0064] 发菌的条件为：培养基湿度55％～65％，空气相对湿度60％～70％，温度20℃～30℃；

[0065] 子实体生长的条件为：培养基湿度55％～65％，空气相对湿度85％～95％，温度7℃～20℃。

[0066] 在一些实施例中，发菌的条件为：培养基湿度55％～65％，空气相对湿度60％～70％，温度24℃～26℃。

[0067] 在一些实施例中，子实体生长的条件为：培养基湿度55％～65％，空气相对湿度85％～95％，温度10℃～20℃。

[0068] 在一些实施例中，保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子与固体培养基的体积-质量比为1：10。

[0069] 即，每100g固体培养基接种经本发明提供方法活化的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子(培养液)10mL。

[0070] 在一些实施例中，发菌的时间为19～21天。

[0071] 在一些实施例中，子实体生长的时间为10～20天。

[0072] 在一些实施例中，子实体生长的条件中，温度为：白天20℃～22℃，夜晚10℃～12℃。生产的子实体菌盖洁白，质地脆嫩而肥厚，可收4-5潮菇，总的生物转化率可达150％。

[0073] 当菇盖展开度达八成，菌盖边缘没有完全平展时，及时采收。

[0074] 实践表明，采用本发明提供的固体培养基并采用本发明提供的栽培方法，所得长柄侧耳品质佳、产量高、生物转化率较高，菌盖白色至灰白色，质地脆嫩而肥厚。

[0075] 本发明提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的液体培养基，其特征在于，包括：碳源1％～4％、氮源0.2％～4％、KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值；

[0076] 碳源为蔗糖、葡萄糖或玉米粉中一种或两者以上的组合；

[0077] 氮源为麦麸汁、蛋白胨、酵母粉或豆饼粉中一种或两者以上的组合。

[0078] 在一些实施例中，液体培养基中包括如下质量分数的组分：蔗糖1％～3％，麦麸汁1％～3％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0079] 在一些实施例中，液体培养基中包括如下质量分数的组分：葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～2％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0080] 在一些实施例中，液体培养基中包括如下质量分数的组分：玉米粉2％～4％，酵母粉0.2％～2％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0081] 在一些实施例中，液体培养基中包括如下质量分数的组分：玉米粉2％～4％，豆饼粉2％～4％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。

[0082] 在一些实施例中，液体培养基中包括如下质量分数的组分：蔗糖3％，麦麸汁2％，KH2PO40.1％，自然pH值。

[0083] 本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的液体发酵方法：培养保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子，接种于本发明提供的液体培养基，经灭菌后，与25℃±3℃培养100h～150h，放罐，获得发酵菌液；

[0084] 培养的条件为：通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，罐压0.5kg/cm2。在一些实施例中，保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子与液体培养基的质量比为1:(8～12)。

[0085] 即，每100mL液体培养基接种经本发明提供方法活化的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌的种子(培养液)8～12mL。

[0086] 作为优选，液体培养基为无菌的液体培养基。

[0087] 在一些实施例中，培养的温度为24℃±1℃，时间为120h。

[0088] 在一些实施例中，灭菌采用高压灭菌。

[0089] 作为优选，灭菌的条件为：压力1.3kg/cm2～1.5kg/cm2，时间1h。

[0090] 本发明提供的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌经液体发酵后，产生的发酵菌液中包括发酵菌丝和发酵液，其中菌丝成发射状球形，菌液呈黄色澄明。

[0091] 在一些实施例中，接种后培养基的pH值为自然pH值，经培养100h～150h，发酵菌液的pH值为5.5～6，其中还原糖的质量分数为2％～3％，氨基氮的质量分数不大于20％。

[0092] 采用本发明提供的液体培养基和发酵方法制备发酵菌丝，所得菌丝生长迅速，生物量大，代谢产物丰富。发酵结束后，菌丝干重不低于12g/L；通过16×100倍生物显微镜检查，菌丝均匀，较细，分枝减少，锁状联合少见，偶见空泡；菌液澄明，黄色，菌丝体呈放射状球形，有淡淡的水果香味。发酵菌丝干燥后“长柄侧耳多糖”含量不少于3％；洛伐他汀含量不少于188.00μg/g；麦角甾醇含量不少于70.00μg/g。

[0093] 发酵菌液在制备食品、饮品、药品或保健品中的应用。

[0094] 长柄侧耳饮料的制备方法为：将以本发明提供方法制得的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌发酵菌丝，利用水提取，提取液和发酵液合并，与水、柠檬酸、蔗糖混合，经均质制得长柄侧耳饮料。

[0095] 长柄侧耳保健品的制备方法为：将以本发明提供方法制得的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌发酵菌丝和发酵液干燥，粉碎后，与保健品上可接受的辅料混合，压片制得长柄侧耳保健品。

[0096] 长柄侧耳食品的制备方法为：将以本发明提供方法制得的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌发酵菌丝和发酵液干燥，粉碎后，与蜂蜜混合，制得长柄侧耳食品。

[0097] 长柄侧耳药品的制备方法为：将以本发明提供方法制得的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌发酵菌丝干燥，提取麦角甾醇，与药学上可接受的辅料混合，制得长柄侧耳药品。

[0098] 长柄侧耳药品的制备方法为：将以本发明提供方法制得的保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌发酵菌丝干燥与药学上可接受的辅料混合，制得长柄侧耳药品。

[0099] 本发明提供了保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌株，并提供了该菌株的种子培养基、种子培养方法、栽培方法和培养基、液体发酵方法和培养基，并提供了该菌种液体发酵后菌丝和发酵液的用途。本发明提供的菌种具有良好的稳定性，代谢能力强，传代25代未见老化或退化。采用本发明提供的栽培方法和固体培养基进行栽培，所得长柄侧耳产量高，品质好，生物转化率高。采用本发明提供的液体培养基和发酵方法制备发酵菌丝，菌丝生长迅速，菌丝均匀分枝少，代谢产物丰富。

[0100] 生物保藏说明

[0101] 长柄侧耳菌Pspo-1，分类命名：Pleurtus spodotecus，于2013年03月20日保藏在保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.7359。

具体实施方式

[0102] 本发明提供了长柄侧耳菌株及其培养基、培养方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0103] 本发明采用的原料皆为普通市售品，皆可由市场购得。

[0104] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0105] 实施例1种子的生产

[0106] (1)斜面菌种：

[0107] 培养基：PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。

[0108] 将保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌种接种于PDA培养基，培养温度23℃～25℃，90～96小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。

[0109] (2)二级摇瓶菌种

[0110] 培养基：蔗糖3％，蛋白胨2％，KH2SO40.1％，MgSO40.1％，自然pH值。灭菌备用。

[0111] 取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌的摇瓶培养基(按1:6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，23℃～25℃温控培养，摇瓶转速为160～220r/min(旋转式)，当发酵液每100ml获得菌丝干重1.2g以上；镜检达到菌种项下标准，味感有淡淡的水果香味，无杂菌污染，培养时间为144小时，可转入种子罐发酵培养。

[0112] (3)三级种子罐菌种

[0113] 培养基：蔗糖3％，麦麸汁2％，KH2PO40.1％，自然pH值。灭菌备用。

[0114] 取新鲜摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的种子罐培养基中，23℃～25℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin。发酵时间为120小时。

[0115] 实施例2种子的生产

[0116] (1)斜面菌种：

[0117] 培养基：PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。

[0118] 将保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌种接种于PDA培养基，培养温度23℃～28℃，90～96小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。

[0119] (2)二级摇瓶菌种

[0120] 培养基：蔗糖2％～3％，蛋白胨1％～2％，KH2SO40.1％～0.15％，0.1％～0.15％MgSO4，自然pH值。灭菌备用。

[0121] 取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌的摇瓶培养基(按1:6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，23℃～28℃温控培养，摇瓶转速为160～220r/min(旋转式)，当发酵液每100ml获得菌丝干重1.2g以上；镜检达到菌种项下标准，味感有淡淡的水果香味，无杂菌污染，培养时间为140小时，可转入种子罐发酵培养。

[0122] (3)三级种子罐菌种

[0123] 培养基：蔗糖1％～3％，麦麸汁1％～3％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。灭菌备用。

[0124] 取新鲜摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的种子罐培养基中，23℃～28℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin。发酵时间为150小时。

[0125] 实施例3种子的生产

[0126] (1)斜面菌种：

[0127] 培养基：PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。

[0128] 将保藏编号为CGMCC No.7359的长柄侧耳菌种接种于PDA培养基，培养温度22℃～25℃，90～96小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。

[0129] (2)二级摇瓶菌种

[0130] 培养基：葡萄糖2％～3％，酵母粉1％～2％，KH2SO40.1％～0.15％，0.1％～0.15％MgSO4，自然pH值。灭菌备用。

[0131] 取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌的摇瓶培养基(按1:6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，22℃～25℃温控培养，摇瓶转速为160～220r/min(旋转式)，当发酵液每100ml获得菌丝干重1.2g以上；镜检达到菌种项下标准，味感有淡淡的水果香味，无杂菌污染，培养时间为150小时，可转入种子罐发酵培养。

[0132] (3)三级种子罐菌种

[0133] 培养基：玉米粉2％～4％，豆饼粉2％～4％，KH2PO40.1％～0.15％，自然pH值。灭菌备用。

[0134] 取新鲜摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的种子罐培养基中，22℃～25℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin。发酵时间为100小时。

[0135] 实施例4种子品质鉴定

[0136] 取实施例1～3制备的种子液，通过16×100倍生物显微镜检查、观察发酵液情况，称量菌丝干重，并检测发酵液中还原糖、氨基氮含量鉴定所得种子的品质。结果如表1所示：

[0137] 表1种子品质鉴定结果

[0138]

[0139] 可见，本发明实施例1提供的种子最为健壮、活性高。

[0140] 实施例5～9长柄侧耳的栽培

[0141] 取实施例1制得种子，以表2所示固体培养基对长柄侧耳进行栽培。接种量为：10ml种子液接种于100g培养基。发菌培养条件：湿度55％-65％、培养温度20℃～30℃。空气相对湿度60％～70％。

[0142] 子实体生长条件：适当加大昼夜温差，培养温度7℃～20℃。空气相对湿度85％～95％。采收：当菇盖展开度达八成，菌盖边缘没有完全平展，及时采收。

[0143] 表2实施例5～9培养基

[0144]  培养基配方
实施例5 稻草粉870g、麦麸100g、石膏20g、蔗糖20g
实施例6 稻草秸秆粉850g，麦糠120g，石膏15g，蔗糖15g
实施例7 稻草粉850g，麦麸150g
实施例8 玉米芯粉650g，米糠340g，石膏15g

[0145] 采收后，考察实施例5～8所得长柄侧耳的品质、产量及生物转化率。结果如表3所示：

[0146] 生物转化率(％)＝子实体鲜重(g)/培养料干重(g)×100％

[0147] 表3实施例5～8所得长柄侧耳品质(1000g培养料)

[0148]  品质 子实体鲜重(g) 生物转化率(％)
实施例5 菌盖白色，质地脆嫩而肥厚 1400～1500 140～150
实施例6 菌盖白色，质地脆嫩而肥厚 1400～1500 140～150
实施例7 菌盖白色，质地脆嫩而肥厚 1300～1400 130～140
实施例8 菌盖白色，质地脆嫩而肥厚 1300～1500 130～150

[0149] 由表3可知，实施例5所得长柄侧耳品质优良，产量最高。

[0150] 实施例10～12长柄侧耳的液体发酵

[0151] 取实施例1制备的种子，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的液体培养基中，液体培养基如表4所示。25℃±3℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin，罐压：0.5kg/cm2。发酵100～150h，放罐。检测每升发酵液中菌丝的干重、干燥菌丝中长柄侧耳多糖的质量分数，干燥菌丝中洛伐他汀和麦角甾醇的含量，结果见表5.

[0152] 表4实施例10～12培养基

[0153]  培养基配方
实施例10 蔗糖3％，麦麸汁2％，KH2PO40.1％，自然pH值
实施例11 玉米粉3％，豆饼粉3％，KH2PO40.1％，自然pH值
实施例12 葡萄糖2％，蛋白胨1％，KH2PO40.1％，自然pH值。

[0154] 表5品质检测结果

[0155]

[0156] 对比例1～2长柄侧耳的液体发酵

[0157] 取实施例1制备的种子，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的液体培养基中，液体培养基如表5所示。25℃±3℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin，罐压：0.5kg/cm2。发酵100～150h，放罐。检测每升发酵液中菌丝的干重、干燥菌丝中长柄侧耳多糖的质量分数，干燥菌丝中洛伐他汀和麦角甾醇的含量，结果见表6.