用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂及血液灌流装置

摘要

本发明公开了一种用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂及血液灌流装置，所述吸附剂的载体为阳离子交换树脂或经过活化的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂，配基为Nisin素、聚赖氨酸或蜂毒肽类似物。本发明通过选择载体类型，在其上固载对革兰氏菌具有特异性作用的Nisin素、聚赖氨酸或蜂毒肽类似物，从而达到治疗的革兰氏菌感染的目的。本发明的血液灌流装置包括装填有所述用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂的灌流器，进一步还可以包括装填有用于吸附炎性因子吸附剂的灌流器，能够有效清除血液中的炎性因子，达到缓解、治疗的效果。进而，还包括滴注乳酸钠注射液的装置，可以对革兰氏菌的抑制和吸附产生协同作用，达到更好的治疗革兰氏菌感染的效果。

权利要求

1.一种用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂，包括作为吸附剂基质的载体和利用化学反应固定在所述载体表面的配基，其特征在于：所述载体为阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂是经过长链极性分子改性的，所述配基为Nisin素、聚赖氨酸或蜂毒肽，所述载体的孔径为50～250nm，比表面积≥30m2/g。

2.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述阳离子交换树脂的离子交换容量为

2～12mmol/g。

3.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述长链极性分子改性是采用己二胺和己二酸进行长链极性分子改性。

4.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述配基为蜂毒肽，利用化学反应固定配基时在反应体系中加入钙离子。

5.一种血液灌流装置，包括血泵、血液管路和若干血液灌流器，所述血泵和血液灌流器串联于血液管路上；依照血液流向，自人体动脉引出为上游，经静脉回注体内为下游，所述血液灌流器中装填有吸附剂，其特征在于：所述至少其中一个血液灌流器中装填的吸附剂为权利要求1～4任一项所述的治疗革兰氏菌感染的吸附剂。

6.根据权利要求5所述的血液灌流装置，其特征在于：包括至少两个血液灌流器，其中串联于血液管路上游的血液灌流器中装填有如权利要求1～4任一项所述的治疗革兰氏菌感染的吸附剂；串联于血液管路下游的血液灌流器中装填有用于吸附炎症因子的吸附剂。

7.根据权利要求5或6所述的血液灌流装置，其特征在于：还包括滴注装置，所述滴注装置串联于血液管路，位于所有血液灌流器的上游，所述滴注装置内装有乳酸钠注射液。

说明书

用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂及血液灌流装置

技术领域

[0001] 本发明涉及血液净化和医用材料领域，具体是一种用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂及含有该吸附剂的血液灌流装置。

背景技术

[0002] 革兰氏菌

[0003] 革兰氏菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病；而大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌(Streptococcus)、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。以往很多研究者更关注革兰阴性菌感染及内毒素血症的研究，而对革兰氏阳性菌脓毒症鲜有问津。

[0004] 大规模流行病学资料显示，近年来由革兰阳性菌引起的脓毒症和脓毒性休克明显增多，目前已达脓毒症发病率的50%以上。其中金黄色葡萄球菌（金葡菌）感染的发病率位居首位，是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭和血源性肾炎等疾病的主要病原菌。其致病的严重程度及致死率与革兰阴性菌相当，且通常与革兰阴性菌脓毒症同时发生、协同作用，使脓毒症的病理生理过程进一步恶化，严重威胁着患者的生命。此外炎性因子的急剧增多也与革兰氏阳性菌感染的脓毒症等疾病关系紧密。脓毒症常见的并发症包括休克、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、深静脉血栓形成、应激性溃疡、代谢性酸中毒、弥漫性血管内凝血（DIC）甚至多器官功能不全。

[0005] 革兰氏阳性菌细胞壁较厚，约20～80nm。肽聚糖含量丰富，有15～50层，每层厚度1nm,约占细胞干重的50～80%。另外，还有大量带负电荷的特殊组份磷壁酸。

[0006] 在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）。但近二十年来，我国医院临床上对抗生素的滥用，特别是第三代头孢菌素的过度滥用，不仅造成了医疗费用的快速上涨，而且引发了我国革兰菌阳性菌感染发生率快速上升与蔓延的态势。

[0007] 专利CN102112125公开了用于治疗革兰氏阳性菌感染的抗菌联合治疗法，其中有粘菌素、乳酸链球菌肽、D-环丝氨酸、磷霉素、磷霉素氨基丁三醇、磷霉素二钠和多粘菌素B以及它们的衍生物中的一种或多种所组成的组合。但大部分阳离子抗菌肽具有溶血副作用，且抗生素的滥用导致人体内对抗生素产生抗性，迫使治疗药物需要不断更新换代。

[0008] 在临床应用较多的治疗方法是采用血液净化方法，即将血液引入装有固定吸附剂的容器中，以吸附清除某些外源性和内源性的毒物，达到血液净化的目的。现有的血液净化技术中大多采用以聚苯乙烯纤维为载体、多粘菌素B作为配基的吸附剂，来治疗革兰氏菌感染，例如，日本专利公开号的6-11331，其主要用于治疗受革兰氏阴性菌感染的疾病，但其配基多粘菌素B具有肾毒性和神经毒性，其脱落具有安全性风险。也有少量应用于治疗受革兰氏阳性菌感染的疾病的研究；而专门用于治疗受革兰氏阳性菌感染的疾病的灌流器的技术产品比较少。

[0009] Nisin素

[0010] Nisin素是一种乳酸链球菌素（亦称乳链菌肽）的天然生物活性抗菌肽，利用生物技术提取的一种纯天然、高效、安全的多肽活性物质。Nisin也是一种窄谱抗菌剂，其机理主要是通过阳离子表面活性剂，影响细胞膜和抑制革兰氏阳性菌的细胞壁的合成来杀死细菌的，其能有效地杀死和抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌，如乳酸杆菌、肉毒杆菌、葡萄球菌、李斯特菌、耐热腐败菌、棒杆菌、小球菌、明串球菌、分枝杆菌等。特别是对产生孢子的细菌，如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、致死肉毒芽孢杆菌、细菌孢子等有很强的抑制作用。在较酸性的条件下，Nisin素甚至能够杀灭革兰氏阴性菌和其它菌种，健康状态下人体内的体液是一种平衡态，疾患状态下人的体液是不平衡态，整体上多呈现酸性态。这对于有代谢性酸中毒的情况效果尤好。

[0011] 但Nisin素稳定性差，易于降解，而固载Nisin作为配基可以提高稳定性，但由于Nisin素分子内可通过硫醚键形成五个内环，使其分子体积和阻力较大，难以牢固地结合在载体上，甚至堵塞载体孔道，因此固载困难，制备出的吸附剂难以达到良好的吸附治疗效果。

[0012] 蜂毒肽

[0013] 蜂毒肽(Melittin)是意大利蜂毒液的主要活性成分，它由26个氨基酸组成，属于典型的阳离子抗菌肽。蜂毒肽是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍，可以抑制20多种革兰氏阴性和阳性细菌的生长繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗对青霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌。蜂毒肽还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌效力，对多种真菌、病毒也具有毒性。蜂毒肽还能抑制白细胞转移，从而抑制了局部的炎症反应。蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌具有很强的抑制作用，但其具有很强的溶血活性，这限制了它在临床上的应用。

发明内容

[0014] 本发明要解决的技术问题是：提供一种吸附剂，通过选择载体种类，在其上固载Nisin素、聚赖氨酸或蜂毒肽类似物，从而达到治疗的革兰氏菌感染的目的。

[0015] 本发明提供了一种用于治疗革兰氏菌感染的吸附剂，包括作为吸附剂基质的载体和利用化学反应固定在所述载体表面的配基，所述载体为阳离子交换树脂或经过活化的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂，所述配基为Nisin素、聚赖氨酸或蜂毒肽类似物。

[0016] 方案中提到的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂通常可由纯度约80%的二乙烯基苯经悬浮聚合制得；聚苯乙烯二乙烯基苯树脂的活化可以采用本领域技术人员熟知的方法进行活化，如将其加入N-羟甲基-α-氯乙酰胺、硝基苯、浓硫酸和多聚甲醛的混合液中进行活化。活化后，聚苯乙烯二乙烯基苯树脂的表面活性得到提高，便于固载配基，如果不经过活化，则难以在其上固载配基。

[0017] 由于革兰氏阳性菌细胞壁的大小20~80nm，为了实现堵截滞留而清除革兰氏阳性菌的目的，优选地，所述载体，即阳离子交换树脂或经过活化的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂的2
孔径为50~250nm，比表面积≥30m/g。

[0018] 为了更好的实现对配基的交换活化，优选地所述阳离子交换树脂的离子交换容量为2~12mmol/g；通过阳离子交换树脂提供阳离子，可有效提高配基的清除能力。

[0019] 优选地，所述阳离子交换树脂是经过长链改性的。利用长链极性分子的缠绕作用提高配基的活动能力、固载强度、静电和疏水作用吸附能力，提高其固载强度以减少其使用过程中的脱落。

[0020] 进一步优选地，所述长链改性是采用己二胺和己二酸进行长链改性。

[0021] 优选地，为了提高蜂毒肽类似物表面的阳离子浓度，促进其与细菌细胞膜的静电结合作用，提高抑菌效果，在利用化学反应固定蜂毒肽类似物配基时，在反应体系中加入钙离子。

[0022] 本发明的另一方面，还提供了一种血液灌流装置，包括血泵、血液管路和若干血液灌流器，所述血泵和血液灌流器串联于血液管路上，依照血液流向，自人体动脉引出为上游，经静脉回注体内为下游，所述血液灌流器中装填有吸附剂，所述至少其中一个血液灌流器中装填有上述的治疗革兰氏菌感染的吸附剂。

[0023] 进一步地，所述血液灌流装置包括两个血液灌流器，其中串联于血液管路上游的血液灌流器中装填有上述的治疗革兰氏菌感染的吸附剂；串联于血液管路下游的血液灌流器中装用于吸附炎症因子的吸附剂。以便和上游的治疗革兰氏菌感染的吸附剂相结合，达到更好的治疗目的。

[0024] 所述的用于吸附炎症因子的吸附剂为本领域内熟知的用于吸附炎症因子的吸附剂，如常用的以聚苯乙烯二乙烯基苯中性大孔吸附树脂作为载体，将其经醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮或甲基丙烯酸羟乙酯水溶性单体接枝改性，制备而成的炎症因子吸附剂。

[0025] 进一步地，所述血液灌流装置还包括滴注装置，所述滴注装置串联于在血液管路，位于所有血液灌流器的上游，所述滴注装置内装有乳酸钠注射液。这样，在灌流治疗过程中通过在体外血液循环回路中滴注乳酸钠注射液，使其产生类似色谱柱的动态流动效果以增大与吸附剂、血液的接触面，以对清除革兰氏阳性菌产生协同作用。

[0026] 本发明的有益效果是：本发明通过选择载体类型，选用阳离子交换树脂或聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂作为载体，在其上固载对革兰氏菌具有特异性作用的Nisin素、聚赖氨酸或蜂毒肽类似物，从而达到治疗的革兰氏菌感染的目的。进一步地，还对阳离子交换树脂进行长链改性，以提高配基的固载强度，减少其中使用过程中的脱落；同时本发明还提供了具有该吸附剂的血液灌流装置，所述装置中还可以包括装填有用于吸附炎性因子吸附剂的灌流器，能够有效清除血液中的炎性因子，达到缓解、治疗的效果。进而，还包括滴注乳酸钠注射液的装置，可以对革兰氏菌的抑制和吸附产生协同作用，达到更好的治疗革兰氏菌感染的效果。

附图说明

[0027] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。

[0028] 图1是本发明的实施例的血液灌流装置示意图。

具体实施方式

[0029] 以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

[0030] 吸附剂

[0031] 实施例1  阳离子交换树脂固载Nisin素

[0032] 取阳离子交换树脂10g（孔径100nm，比表面积60㎡/g，离子交换容量为10mmol/g），加入2.5g Nisin素的水溶液50mL，室温震荡8小时。然后用注射水清洗干净，得到S1。

[0033] 实施例2 长链改性阳离子交换树脂固载Nisin素

[0034] 2-1 阳离子交换树脂的长链改性

[0035] 取阳离子交换树脂10g（孔径100nm，比表面积60㎡/g，离子交换容量为10mmol/g），加入30mL 10%的己二胺溶液，调节pH为4.8，加入0.4g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，再慢慢加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），在25℃中震荡反应4小时。反应完成后用酒精、纯化水清洗。

[0036] 然后再加入30mL 10%的己二酸溶液，调节pH为4.8，加入0.6g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，再慢慢加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），在25℃中震荡反应4小时。反应完成后用酒精、纯化水清洗。

[0037] 2-2固载Nisin素

[0038] 取改性的阳离子交换树脂10g，加入2.5g Nisin素的水溶液50mL，再加入0.2g EDC，室温震荡8小时。然后用注射水清洗干净。得到革兰氏菌吸附剂S2。

[0039] 实施例3  长链改性阳离子交换树脂固载聚赖氨酸

[0040] 3-1阳离子交换树脂的长链改性

[0041] 同实施例2步骤2-1

[0042] 3-2固载聚赖氨酸

[0043] 取改性阳离子交换树脂10g，加入2.5g 聚赖氨酸的水溶液50mL，再加入0.2g EDC，室温震荡8小时。然后用注射水清洗干净。得到革兰氏菌吸附剂S3。

[0044] 实施例4  阳离子交换树脂固载蜂毒肽类似物

[0045] 取阳离子交换树脂10g（孔径200nm，比表面积35㎡/g，离子交换容量为5mmol/g），加入1.8g 蜂毒肽类似物的水溶液50mL，室温震荡8小时。然后用注射水清洗干净，得到S4。

[0046] 实施例5长链改性阳离子交换树脂固载蜂毒肽类似物

[0047] 5-1阳离子交换树脂的长链改性

[0048] 取阳离子交换树脂10g（孔径200nm，比表面积35㎡/g，离子交换容量为5mmol/g），加入30mL 10%的己二胺溶液，调节pH为4.8，加入0.4g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，再慢慢加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），在25℃中震荡反应4小时。反应完成后用酒精、纯化水清洗。

[0049] 5-2固载蜂毒肽类似物

[0050] 取改性后的阳离子交换树脂10g，加入含2g 蜂毒肽类似物、0.2mol/L CaCl2的水溶液50mL，再加入0.1g EDC，室温震荡8小时。然后用注射水清洗干净。得到革兰氏菌吸附剂S5。

[0051] 实施例6活化聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂固载Nisin素

[0052] 6-1聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂的活化

[0053] 取10g聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂（孔径50nm，比表面积150㎡/g，由纯度80%的的二乙烯基苯悬浮聚合制得），加入20gN-羟甲基-α-氯乙酰胺、100g硝基苯、100g 98%浓硫酸、0.2g多聚甲醛，在20℃反应2小时，然后依次用冰水、纯化水、乙醇洗完后烘干。

[0054] 6-2固载Nisin素

[0055] 取经过活化改性的聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂10g，加入2.5g Nisin素的水溶液100mL，震荡反应4小时。然后用注射水清洗干净。革兰氏菌吸附剂S6。

[0056] 实施例7活化聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂固载聚赖氨酸

[0057] 7-1聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂的活化

[0058] 同实施例6步骤6-1。

[0059] 7-2固载聚赖氨酸

[0060] 取经过活化改性的聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂10g，加入2g 聚赖氨酸的水溶液100mL，震荡反应4小时。然后用注射水清洗干净。得到革兰氏菌吸附剂S7。

[0061] 吸附剂性能测试：

[0062] 吸附剂革兰氏阳性菌清除效果

[0063] 取试管加入制得的实施例1-7中制备得到的革兰氏菌吸附剂0.05g，再加入革兰氏阳性菌呈强阳性的血浆1.5mL，震荡吸附2小时后（温度37℃，震荡速率100±10rpm）。经测定所有试样的革兰氏阳性菌呈弱阳性，则革兰氏阳性菌已大部分被清除，表明本发明实施例1-7中合成的吸附剂S1-S7都具有良好的革兰氏阳性菌吸附效果，可以有效的治疗革兰氏菌感染。

[0064] 吸附剂固载强度评价

[0065] 取实施1、实施例2和实施例4-6中得到的革兰氏菌吸附剂S1、 S2、S4、S5、S6测试其固载量后，填装350mL进行灭菌处理（121℃，1h），检测填装容器内注射水配基的脱落浓度，以评价其配基的固载强度和稳定性，结果如表1所示。

[0066]

[0067] 按照固载量范围将吸附剂分为两组进行对比，分别是第一组：S1、S2和S6，固载量40~50μmol/g；第二组：S4和S5；固载量30~40μmol/g。通过对比第一组可以看出，经过长链改性后的阳离子树脂对Nisin配基的固载量没有明显提高，但固载强度比未经改性的树脂强度要大，尤其是经过长链极性分子改性后的树脂固载的配基稳定性较高，相对于普通的固载其脱落浓度从84mg/L下降到11mg/L。同样第二组，吸附剂S4、S5进行对比，也可以发现改性后的树脂固载的蜂毒肽类似物的配基稳定性也有提高。

[0068] 固载蜂毒肽类似物的吸附剂的溶血活性测试

[0069] 经测试，经过固载后的吸附剂S5的溶血率为2.8%，远低于国家标准溶血率低于5%的要求。

[0070] 也表明，通过固载后的蜂毒肽类似物的固载强度较高，溶液中因脱落导致的游离的蜂毒肽类似物浓度较低，所以溶血率较低。

[0071] 血液灌流装置

[0072] 实施例8

[0073] 如图1所示，一种血液灌流装置，包括血泵1、血液管路2、血液灌流器A 3、血液灌流器B 4和滴注装置5，血泵1、血液灌流器A 3、血液灌流器B 4和滴注装置5串联于血液管路2上，依照血液流向，自人体动脉引出为上游，经静脉回注体内为下游，血液灌流器A 3位于上游，装填有治疗革兰氏菌感染的吸附剂；血液灌流器B 4位于下游，装填有炎症因子吸附剂；滴注装置5位于所有血液灌流器的上游。

[0074] 在血液灌流器A 3中装填350mL实施例2中制得的革兰氏菌吸附剂S2 ；在血液灌流器B 4中装填350mL聚苯乙烯二乙烯基苯中性大孔吸附树脂作为载体的炎症因子吸附剂；滴注装置5滴注乳酸钠注射液（300mL，1小时滴完）。

[0075] 实施例9

[0076] 去除滴注装置5，其他条件与实施例8相同。

[0077] 对比例1

[0078] 去除血液灌流器A3和血液灌流器B 4，其他条件与实施例8相同。

[0079] 实施例10

[0080] 去除血液灌流器B 4和滴注装置5，在血液灌流器A 3中装填350mL实施例5中制得的革兰氏菌吸附剂S5，其他条件同实施例8。

[0081] 实施例11

[0082] 去除血液灌流器B 4，在血液灌流器A 3中装填350mL实施例6中制得的革兰氏菌吸附剂S6，其他条件同实施例8。

[0083] 血液灌流装置性能测试：

[0084] 血液灌流装置模拟实验

[0085] 以革兰氏阳性菌呈强阳性的4.8L溶液为循环液，流速180mL/min，分别采用实施例8、实施例9和对比例1中的血液灌流装置进行模拟实验，灌流2小时后检测循环液中的革兰氏阳性菌活性。

[0086]

[0087] 模拟实验结果表明，实施例8中，同时具有装填有本发明的革兰氏菌吸附剂S2的血液灌流器A 3，装填有炎症因子吸附剂的血液灌流器B 4和乳酸钠滴注装置5的血液灌流装置的对革兰氏阳性菌的清除效果最好，其次是实施例9，最差的是对比例1，仅具有乳酸钠滴注装置5的血液灌流装置。一方面说明，本发明实施例的血液灌流装置具有治疗革兰氏阳性菌感染的效果，另一方面，通过对比，也说明乳酸钠滴注装置5的加入，可以和吸附剂一起对清除革兰氏阳性菌具有协同作用。

[0088] 血液灌流装置人体实验

[0089] 将实施例8、实施例10和实施例11的血液灌流装置安置在革兰氏菌感染患者的体外循环血路中，均可以吸附并清除患者血液中革兰氏菌，缓解以至于治愈革兰氏菌感染的疾病，说明本发明的吸附剂及血液灌流装置对革兰氏菌感染有良好的治疗效果。

[0090] 以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。