一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗的制备

摘要

本发明涉及一种重组法氏囊(Infectious Bursal Disease，IBD)蛋白工程疫苗的制备与应用。所述疫苗以IBDV主要结构蛋白VP2、VP3的B细胞中和表位和T细胞免疫表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与细胞因子禽白介素15(chIL‑15)串联，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的法氏囊蛋白工程疫苗。本发明还涉及该疫苗的使用方法。动物实验表明，重组法氏囊蛋白工程疫苗在体液免疫与细胞免疫水平上效果与活毒苗相当，可以在细胞水平上刺激产生T淋巴细胞增殖免疫反应，体液水平上产生具有病毒中和活性的抗体免疫反应，攻毒保护试验表明重组法氏囊蛋白工程疫苗组效果明显好于活疫苗组。

权利要求

1.一种预防禽法氏囊病的蛋白工程疫苗，其特征在于疫苗的主要抗原成分为人工设计的重组法氏囊主要结构蛋白的B细胞表位、中和表位、T细胞表位与细胞因子禽白介素IL-15串联结构的融合蛋白，其特征在于具体氨基酸序列为SEQ ID No.2。

2.一种核酸分子，其特征在于编码权利要求1所述融合蛋白。

3.一种载体，其特征在于含有权利要2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求3所述的载体。

5.权利要求2所述的核酸分子，其特征在于具体序列如下：

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6.权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体在禽法氏囊病的蛋白工程疫苗制备中的应用。

说明书

一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗的制备

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白VP2、VP3的表位与细胞因子禽IL-15串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到重组法氏囊蛋白工程疫苗以及该疫苗在预防禽传染性疾病法氏囊病毒病中的应用。

背景技术

[0002] 鸡传染性法氏囊病(Infeetious Bursal Disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒IBDV所引起的一种急性、高度接触性传染病，是目前危害养鸡业最为严重的传染病之一(Ikuta et al.，2001；van den Berg，2000)。本病毒无囊膜，呈二十面体立体对称。有单层衣壳，核衣壳由32个直径为12nm的壳粒组成，直径约60nm。除完整病毒粒子外，还常见有空衣壳，在感染细胞内，病毒常呈晶格状排列。

[0003] IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段(大节段)和B节段(小节段)(Lombardo et al.，2000)，两个节段均包括5′端非编码区(5′non-coding region，5′-NCR)、编码区和3′端非编码区(3′-NCR)。IBDV基因组A、B节段共编码5种蛋白。B节段编码VP1蛋白(95kDa)，在病毒粒子作为基因组连接蛋白称为VPg(Delmas et al.，2011，Muller et al.，2003)。A节段包括两个部分重叠的ORF，小ORF编码VP5蛋白(17kDa)，大ORF编码一个分子量为108kDa的多聚蛋白，该蛋白通过自剪切产生VP2前体蛋白pVP2(48kDa)、VP3(32kDa)、VP4(28kDa)，pVP2通过羧基端进一步处理成为成熟的VP2(40kDa)。VP2和VP3是结构蛋白，构成病毒粒子衣壳的内外层，均含有中和表位(Azad et al.，1991；Heine and Boyle，1993；Villegas et al.，2008；Yip et al.，2007)。

[0004] VP2由IBDV的A节段VP2基因编码，是IBDV的主要结构蛋白，约占病毒总蛋白的51％，构成病毒的外衣壳。VP2与另一主要结构蛋白VP3-起构成IBDV核衣壳的骨架。VP2带有IBDV依赖于蛋白质三维立体构象的保护性中和抗原位点，可以诱导产生保护性中和抗体，并具有血清特异性其诱导的中和抗体被动地保护宿主不受IBDV的感染(Lukert and Saif，
2003)。VP2含有血清型特异性的能诱导产生中和抗体的构象依赖性(不连续)抗原决定簇，其诱导的中和抗体可保护宿主不受IBDV的感染，因此VP2是IBDV的宿主保护性抗原(Azadetal.，1991。因此，一般认为VP2是IBDV 的宿主保护性抗原，不同毒株间VP2氨基酸序列的差异主要集中存在于第206～350位共145位氨基酸残基，称为VP2高变区，该区域恰好位于两个酶切位点AccI和Spel的间(Rautenschlein et al.，2005)。含两个亲水的peak A(第210～225位)和peak B(第312～324位)及之间的区域，紧接在第二亲水区后的七个氨基酸组成的七肽区，通常称这一区域为VP2高变区，属中和表位，能识别弱毒和强毒。第一个亲水区有助于多肽构象的稳定，第二个亲水区对病毒中和性单克隆抗体的识别有关。中和单克隆抗体所识别的抗原决定位点是个三维的立体构象(Coulibaly et al.，2005)。能够引起抗原决定位点三维构象发生微小变化的氨基酸变异都会使IBDV的抗原性发生变化(Letzel et al.，2007，Martinez-Torrecuadrada et al.，2003)。不同毒株在高变区内的变异较大，分子结构的改变会导致病毒毒力的改变以及宿主对疫苗应答的改变，使得传统的疫苗株不能控制其流行(Pitcovski et al.，2003；Rong et al.，2007)。另外，VP2是细胞感染IBDV后引起细胞凋亡主要因素之一(Ikuta et al.，2001；van den Berg，2000)。

[0005] VP3蛋白是IBDV主要的结构蛋白之一，分子质量约为32kD，占病毒总量的40％，位于病毒粒子的内表面，在IBDV核衣壳骨架形成的过程中起重要作用。VP3含有群特异性抗原决定簇，可诱导中和抗体的产生，但反应能力极弱，免疫保护性不强。VP3对于病毒样颗粒的形成是必要的，VP3对于病毒衣壳的形成和形态的完整是必需的(Lee et al.，2003)。VP3至少存在两个独立非重叠的非中和性抗原表位，其中一个是两个血清型所共有的，另一个是血清型特异的(Martinez-Torrecuadrada et al.，2003)。不同血清亚型IBDV的VP3基因相对保守，VP3的存在是病毒样颗粒(VLPs)能够正确形成的前提，它是IBDV衣壳的形成以及形态的完整是必需的，它的作用是稳定病毒RNA。此外，因VP3多个区段具有亲水性，使其在病毒与抗体反应时发挥促进作用(Lee et al.，2003)。

[0006] 白介素15(interleukin 15，IL.15)是新近发现的一种细胞因子，IL-15的许多性质和功能被认为是同IL-2相似的，如诱导T细胞增殖、提高自然杀伤细胞(NK)的细胞毒性、促进活化的B细胞增殖和分化等(Grabstein K H，1994)。Lillehoj等人于细胞cDNA文库中克隆到了一个新基因，其5’端非编码区含有两个框外ATG起始密码子，编码蛋白含有较长的信号肽(由66个氨基酸组成)，成熟蛋白含有四个高度保守的半胱氨酸残基。该蛋白在体外能维持ConA活化的鸡T淋巴细胞的生长和增强NK细胞的杀伤活性，这与已报道的哺乳动物IL-15的基因与蛋白特征相似，由此确定该基因编码ChIL-15(Lillehoj H S etal，2001)。IL-15是一种多功能的细胞因子，包括(1)维持T细胞株CTL-2的生长，诱导细胞毒性T细胞活性，诱导预致敏T细胞的活化、分化，促进肠粘膜淋巴细胞特别是TCR细胞分化生长，而且与IL-2协同在较低浓度即能导致T细胞的迅速增殖(Chu C L etal，1999；Schluns K S etal，
2002)(2)对正常B细胞，在用PMA和抗IgM抗体预活化后，IL-15可诱导其增殖反应，当将IL-
15与CD40L联合应用时，可使B细胞分泌IgG(Armitage R T，1995)；(3)可以诱导NK细胞的分化成熟，增强其杀伤活性，也可显著增进NK细胞表达IFγ和TNFα(Wei X Q，2001；Waldmann T A，2001)；(4)能够刺激正常外周血单核细胞PBMC增殖；(5)高浓度的IL-15能增加LPS活化的单核巨噬细胞产生促炎症因子如IL-1，IL-6和TNFα，低浓度的IL-15能选择性的抑制促炎症因子的产生，对抗炎性因子无影响。(6)抑制淋巴细胞发生凋亡，且可抑制IL-2介导的细胞死亡(Waldmann T A，2001)。

[0007] 传统的灭活和活毒苗接种都曾作为防控IBDV主要手段。然而，灭活苗缺乏诱导机体产生坚实的免疫力的能力，尤其是在细胞介导的免疫效力方面。面对vvlBDV威胁，灭活苗并不能使鸡在整个生长期内得到保护。由于致弱毒株疫苗往往未完全减毒，免疫后可能对法氏囊的淋巴滤泡造成一定的病理损伤，甚至有的还可以引起免疫抑制(Rautenschlein et al.，2005)，亦会导致高毒力或变异株的出现(Snyder，1990)。而且，有些IBDV变异株活疫苗导致免疫抑制和亚临床继发感染(Fussell，1998；Donnelly et al.，2000)。因此，开发一种安全有效适合大规模免疫的新型IBDV疫苗势在必行。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明以主要结构蛋白VP3B细胞表位以及VP2B细胞中和抗原表位和T细胞表位作为疫苗框架结构，与禽细胞因子白介素15(chIL-15)基因串联，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组疫苗。本疫苗免疫靶动物后可诱导有效的体液免疫和细胞免疫反应。

[0010] 本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防禽法氏囊病的重组蛋白工程疫苗多肽及其疫苗组合物；本发明的目的之二在于提供了所述法氏囊蛋白工程疫苗的构建及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述法氏囊蛋白工程疫苗的基因工程菌株；本发明的目的之四在于提供了所述蛋白工程疫苗的制备方法；本发明的目的之五在于提供了所述法氏囊蛋白工程疫苗在预防法氏囊病中的用途。

[0011] 在第一方面，本发明提供了一种用于预防法氏囊病的重组法氏囊蛋白工程疫苗多肽及其组合物。其含有主要结构蛋白VP3蛋白B细胞表位、VP2蛋白B细胞中和抗原表位和T细胞表位及禽细胞因子白介素15(chIL-15)。所述的法氏囊蛋白工程疫 苗蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。重组法氏囊蛋白工程疫苗多肽氨基酸序列如下：

[0012] LGMAQPTQNSAGARRRPESQKTHVKSICLQYQLYLLLNSYFFCLLKNKTGLTIFFLCAYVPKTEANHCKWSDVLKDLELIKTSEDIDVSLYTANTYEDIECQEPVMRCFFLEMKVILHECDIKKCSRKHDVRNIWKNGNARFATYQLNSTTAKKCKECEEYEEKNFTEFIQSFVKVIQRECRKYANGDIPGCKTNLQDQTQGGTTGPASIPDDTLEKHTLRSETSTGSGLQSNGNYKFGGVATCDSSDRPRIYTIAAANDYQFSSQYQADGGSGPNPELAKNLITEYGRFDPGAMNYTKLILSERDRLGIKTVWPTREYTDFREYFMEGGPSCDPNAHRMRNFLANAPQAGSKSQRAKYGTAGYGVEARGPTPEEAQREKDTRISKKMEGSGNGHRGPSPGQLKYWQNTREIPDPNEDYLDYVHAEKSRLASEEQIGSGNHGRGPNQEQMKDLLLTAMEMKHRNPRRAPPKPKPKPNAPTQRPPGRLGR

[0013] 在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的法氏囊蛋白工程疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列和细胞因子序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得法氏囊蛋白工程疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下：

[0014] CTG GGG ATG GCA CAG CCA ACA CAA AAC TCT GCC GGA GCA CGG AGAAGG CCG GAG AGT CAG AAA ACA CAT GTG AAA AGT ATT TGT CTC CAG TACCAA CTG TAT CTA CTT TTG AAC AGC TAT TTC TTT TGC CTT TTA AAG AAT AAGACT GGA CTA ACC ATC TTC TTC CTA TGT GCT TAT GTA CCA AAG ACA GAAGCA AAT CAC TGT AAG TGG TCA GAC GTT CTG AAA GAT TTG GAG CTG ATCAAG ACA TCT GAA GACATT GAC GTCAGT TTA TAT ACT GCA AAC ACA TAC GAG GAT ATA GAA TGC CAG GAA CCT GTA ATG AGA TGT TTT TTT TTA GAGATG AAA GTG ATT CTT CAC GAA TGT GAT ATC AAA AAA TGT AGT AGG AAGCAT GAT GTA CGG AAC ATA TGG AAA AAT GGA AAT GCA AGA TTT GCA ACTTAC CAG TTG AAT TCC ACA ACA GCA AAA AAA TGC AAA GAA TGT GAA GAGTAT GAA GAAAAAAAT TTT ACA GAA TTT ATA CAG AGT TTT GTA AAG GTTATA CAG AGG GAA TGC AGA AAA TAC GCT AAC GGT GAT ATC CCA GGT TGCAAG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC CAA GGT GGT ACA ACC GGA CCG GCGTCC ATT CCG GAC GAC ACC CTA GAG AAG CAC ACT CTC AGG TCA GAG ACCTCG ACC GGT TCT GGT CTG CAG AGC AAT GGG AAC TAC AAG TTC GGT GGTGTA GCA ACA TGT GAC AGC AGT GAC AGG CCC AGA ATC TAC ACC ATA GCTGCA GCC AAT GAT TAC CAA TTC TCA TCA CAG TAC CAA GCA GAT GGA GGTTCT GGT CCA AAT CCT GAA CTA GCA AAG AAC CTG ATC ACA GAA TAC GGCCGA TTT GAC CCA GGA GCC ATG AAC TAC ACA AAA TTG ATA CTG AGT GAGAGG GAC CGT CTT GGT ATC AAG ACC GTA TGG CCA ACA AGG GAG TAC ACTGAC TTT CGC GAG TAC TTC ATG GAG GGT GGT CCA TCT TGT GAC CCC AACGCC CAT CGG ATG CGT AAT TTT CTC GCA AAC GCA CCA CAG GCA GGC AGCAAG TCG CAA AGA GCC AAG TAC GGG ACA GCA GGC TAC GGA GTG GAG GCCCGA GGC CCC ACA CCA GAG GAG GCA CAG AGG GAA AAA GAC ACA CGG ATCTCA AAG AAG ATG GAG GGT TCT GGT AAT GGG CAC AGG GGG CCT AGC CCCGGC CAG CTA AAG TAC TGG CAG AAC ACA CGA GAA ATA CCT GAT CCA AACGAG GAC TAC CTA GAC TAC GTG CAT GCA GAG AAG AGC CGG TTG GCA TCAGAA GAA CAA ATC GGT TCT GGT AAC CAT GGG CGT GGC CCC AAC CAA GAACAG ATG AAA GAT CTG CTC TTG ACT GCG ATG GAG ATG AAG CAT CGC AATCCC AGG CGG GCT CCA CCA AAG CCC AAG CCA AAA CCC AAT GCT CCA ACACAGAGACCC CCT GGT CGG CTG GGC CGC

[0015] 在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码法氏囊蛋白工程疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。本发明中优选大肠杆菌BL21(DE3，Plys)作为表达载体。

[0016] 在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的法氏囊蛋白工程疫苗多肽。

[0017] 在第五方面，本发明提供了一种法氏囊蛋白工程疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达法氏囊疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。

[0018] 在第六方面，本发明提供了一种用于预防禽法氏囊病的重组法氏囊蛋白工程疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述法氏囊蛋白工程疫苗能够预防禽法氏囊病的爆发。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。

[0019] 在第七方面，本发明提供了第六方面所述的重组法氏囊蛋白工程疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射接种动物，能够产生足够量的抗体及细胞因子(如IFN等)，提供抗病毒活性，保护动物免于法氏囊病毒流行毒株的攻击。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物攻毒对比试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的重组法氏囊蛋白工程疫苗是安全的(见实施例四)，能够保护动物免受法氏囊病毒感染(见实施例五、六、七、八、九、十)。

[0020] 另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

[0021] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1重组法氏囊蛋白工程疫苗表达载体pRSETB-IBDV(VP2/3)-chIL15构建图；图2pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)载体质粒酶切图，其中泳道1为DNAmarker，从上至下分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp， 泳道2为空质粒，泳道3为质粒酶切图，泳道4为未酶切对照；图3SDS-PAGE检测图，其中泳道1为蛋白Marker，从上至下依次为
97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道2为未诱导样品，泳道3为诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白；图4Westernblot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为97KD、66KD、43KD、31KD、20KD、14KD，泳道2为目的蛋白。图5为发酵样品SDSPAGE图：其中泳道1为蛋白Marker，从上至下依次为97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道2为未诱导样品，泳道3为诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白；图6为重组疫苗蛋白与野毒感染血清多抗的反应结果图，其中泳道1为预染蛋白marker，从上至下依次为116KD、
66KD、45KD、35KD、25KD、20KD、10KD，泳道2为野毒与重组疫苗抗血清westernblot结果，泳道
3为重组VP2/3-IL15蛋白与野毒抗血清westernblot结果；图7为靶动物IgY抗体滴度检测；
图8为免疫抗血清与IBDV疫苗株的结合反应结果；图9为重组蛋白VP2/3-IL15与活疫苗K85株抗血清的结合反应结果；图10重组VP2/3-IL15蛋白抗原刺激T细胞增殖反应；图11 K85疫苗毒抗原刺激T细胞增殖反应。

具体实施方式

[0022] 实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。

[0023] 实施例一 法氏囊蛋白工程疫苗蛋白的设计思路

[0024] 本发明根据目前国内法氏囊主要流行株结构蛋白VP2、VP3氨基酸序列，利用相关生物信息学软件DNASTAR、BIMAS和SYFPEITHI对流行株进行B细胞中和表位和T细胞表位分析，同时引入禽细胞因子白介素15(IL-15)作为佐剂分子。将所设计法氏囊病毒B细胞和T细胞表位以及白介素15分子多肽串联后在大肠杆菌中共表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的法氏囊蛋白工程疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防法氏囊病。

[0025] 综合分析国内法氏囊病毒流行株基因组序列，抗原结构、流行病学研究进展，对重组法氏囊蛋白工程疫苗进行了优化设计。本发明利用生物信息学软件对其结构蛋白进行的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，预测可能的B细胞抗原表位以及T细胞表位的基础上，根据表位位置和氨基酸序列的相似性，分析各流行毒株共有抗原表位，并参考GenBank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性，从而确定与VP2结构蛋白T细胞优势抗原表位多肽1段，B细胞表位2段，VP3结构蛋白B细胞表位3段。将所有表位串联后形成疫苗的骨架结构，同时在骨架氮末端加入分子佐剂。该疫苗的总体结构为：

[0026] Molecular Adjuvant(chIL15)-VP2T Cell Epitope-VP2B Cell Epitope 1-VP2B Cell Epitope 1-VP2 B Cell Epitope 2-VP3B Cell Epitope 1-VP3B Cell Epitope 2-VP3B Cell Epitope 3

[0027] 实施例二 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

[0028] 将设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamH I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，把这片段合成后分别克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为pMD18T-IBDV(VP2/3)-chIL15。用相应的限制性内切酶将两种质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETB质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New England Biolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.86kb pRSETB质粒和1467bp IBDV(VP2/3)-IL15片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1：2-3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒分别命名为pRSETB-IBDV(VP2/
3)-chIL15，(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

[0029] 转化：将pRSETB-IBDV(VP2/3)-chIL15置冰上融化，加入2μl链接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1ml LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

[0030] 鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，可以切出相应法氏囊疫苗基因大小片段的克隆，1467bp，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

[0031] 诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.2mM IPTG，继续培养4小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在56KD(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名pRSETB-IBDV(VP2/3)-IL15/BL21(DE3，Plys)。

[0032] 实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化

[0033] 发酵取生产菌种，接种于2m1LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝
3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在
40％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.2mM)诱导表达，连续诱导5个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况(见图5)。

[0034] 纯化将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，
20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；
即得重组法氏囊蛋白工程疫苗半成品原液。

[0035] 乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至100μg/ml。取法国赛比克公司的Montanide ISA 50V2佐剂，经过121℃，灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。

[0036] 实施例四 重组法氏囊蛋白工程疫苗安全性试验

[0037] 1试验动物 30日龄SPF鸡20羽。

[0038] 2疫苗 由公司研发中心提供，批号为131024、131027、131031。

[0039] 试验采用单因子完全随机化的试验设计，随机将20只30日龄试验动物随机分为4组，3个批号组和对照组，每组5只，组间无体重差异。免疫组于每只鸡腿部肌肉注射疫苗0.3ml/头，观察至10日，对照组使用生理盐水乳化液0.3ml。免疫后，观察各实验动物的采饲、饮水、精神是否正常、是否有中毒症状、是否产生过敏反应、是否死亡或出现其他异常情况。免疫前及试验结束后，全部动物称重。对称重结果进行统计学分析。

[0040] 3 结果

[0041] 3.1 临床观察

[0042] 3个免疫组动物免疫后均未观察到任何过敏反应或中毒症状，SPF鸡的精神、采饲、饮水、活动、粪便等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，且无死亡发生。

[0043] 3.2 体重变化

[0044] 结果见表1，与对照相比，三个免疫组动物体重增长与对照组差异不显著(P＞0.05)，表明免疫重组法氏囊蛋白工程疫苗对动物的体重无不良影响。

[0045] 表1重组法氏囊蛋白工程疫苗对SPF鸡体重变化的影响

[0046]批号 免疫前体重(g) 免疫后10天体重(g) 日增重(g) P
131024 252.17±24.56 426.35±44.78 17.42±2.18 ＞0.05
131027 244.62±26.33 419.83±42.41 17.57±1.89 ＞0.05
131031 255.34±24.92 434.27±39.36 17.89±2.04 ＞0.05
对照组 260.28±25.75 435.52±44.75 17.53±2.11 -

[0047] 实施例五 动物试验分组及免疫

[0048] 1 疫苗与攻毒用病毒

[0049] 重组法氏囊蛋白工程疫苗由红桥明勤研发中心提供，批号为131024、131027、131031，K85株中等毒力活疫苗由广东永顺制药研发中心惠赠，批号为2013005。

[0050] 2 实验动物

[0051] 一日龄抗体阴性SPF鸡50只，分为5组，每组10只。免疫前用ELISA方法检测母源抗体，所有的试验鸡均为IBDV抗体阴性，预饲两周，适应环境。

[0052] 两周龄SPF免疫组分别肌肉注射蛋白工程疫苗和中等毒力活疫苗(K85株)，2ml/只，首免后14天相同剂量加强免疫。免疫后每两周采血一次，至84天结束，共采集6次，分离血清并于-20℃保存。

[0053] 实施例六 IgY滴度检测

[0054] IBDV活毒疫苗和疫苗抗原蛋白免疫反应，尤其是血清中IgY的水平用传统间接ELISA方法检测。微孔板(Nunc Maxisorp，Nalge Nunc International，Denmark)用抗原蛋白或IBDV疫苗(1μg/孔)包被，2-8℃过夜；5％脱脂牛奶于37℃封闭1h，将抗血清作1∶500，1∶1000，1；2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000倍稀释，同时用免疫PBS的血清作为阴性对照，加入微孔板，100ul/孔，于37℃孵育1h，然后用兔抗鸡IgY-HRP的酶标二抗(1∶10000，Sigma，St louis)，加入微孔板，100ul/孔，于37℃孵育1h。TAB底物避光显色10min，2MH2SO4终止反应，于450nm波长下检测吸光度值。以最高血清稀释度的倒数作为抗体滴度，其平均吸光值(≥0.2)高于免疫前血清的平均吸光值+2SD，作为cutoff值。

[0055] 结果

[0056] 四个免疫组动物的IgY抗体滴度呈现相同的消长趋势，免疫后逐渐升高，42天达到最高值，至试验结束，抗体水平降至免疫后14天的水平。三个重组法氏囊疫苗抗原蛋白产生明显的体液免疫反应，免疫后42天抗体可达1∶32000，最低为1∶8000(见图7)，而IBDV活毒疫苗(K85株)，最高抗体滴度为1∶16000，最低为1∶8000。可见重组法氏囊疫苗的蛋白特异性IgY水平明显高于传统的商业化活毒苗。

[0057] 实施例七 重组法氏囊疫苗抗原蛋白与野毒的反应

[0058] 用Westernblot方法对重组蛋白与野毒感染血清多抗(1∶2000)的反应进行分析。同样，用分离的野毒株与重组法氏囊疫苗免疫的血清(1∶1000)进行反应。兔抗鸡IgY-HRP(1∶10000)作为二抗，DAB底物显色。

[0059] 结果

[0060] 重组法氏囊疫苗抗血清与VP2蛋白在56KD处有结合反应，表明抗体能够识别天然野毒抗原的表位，野毒感染抗血清与重组蛋白亦可以在56KD发生明显的结合反应(见图6)。

[0061] 实施例八 重组VP2/3-IL15蛋白与商品化疫苗的反应

[0062] 用ELISA方法检测重组VP2/3-IL15蛋白与商品化疫苗抗血清的反应。浓度为1ug/ml VP2/3-IL15蛋白包被96孔酶标板，100μl/孔，2～8℃过夜孵育。PBST洗涤三次，最佳稀释倍数的K85毒株免疫抗体加入酶标板，100μl/孔，于37℃孵育1h，PBST洗涤三次，兔抗鸡IgY-HRP(1∶10000)二抗加入酶标板，100μl/孔，于37℃孵育1h，PBST洗涤三次。此外，K85疫苗株与重组VP2/3-IL15蛋白免疫抗血清(1∶1000)进行同样的操作。TAB底物避光显色10min，2MH2SO4终止反应，于450nm波长下检测吸光度值。将VP2/3-IL15蛋白的免疫结合反应作为两种分析的参照。

[0063] 结果

[0064] 三个批次的VP2/3-IL15蛋白诱导产生的抗血清结合K85疫苗株的能力用ELISA方法进行检测。与免疫前对照抗体相比，VP2/3-IL15蛋白抗血清表现出明显的与IBDV K85疫苗毒株的高反应性(P＜0.01)(见图8)。由于IBDV疫苗株包含全病毒，这表明VP2/3-IL15蛋白诱导产生的抗体能够与IBD全病毒结合。同样用ELISA方法检测VP2/3-IL15蛋白对IBDV疫苗抗血清的反应。与免疫前相比，IBDV疫苗毒株诱导产生的抗血清表现为明显的高反应性(P＜0.05)(见图9)。可见IBDV疫苗诱导的多抗可以与VP2/3-IL15蛋白产生交叉反应，进一步确定了蛋白中含有VP2的主要表位。

[0065] 实施例九 脾细胞的增殖检测

[0066] 将免疫42天SPF鸡处死并无菌摘取脾脏。分离脾细胞并用新鲜RPMI1640培养基(Sigma，St.louis)洗涤两次。用裂解缓冲液(0.1M氯化铵)吹洗两次，除去红细胞。单一细胞悬液放入96孔细胞板，2×105细胞/ml，100μl/孔，含有80μg/ml庆大霉素(Ranbaxy Laboratories)25mM HEPES(Amersham Pharmacia)、2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。将细胞用不同浓度的抗原：0.1、1、5、10、50ug每孔进行体外刺激，同时用1ug/孔的ConA作为阳性对照，培养基孔作为阴性对照。将细胞版放入5％的CO2培养箱(MCO-175SANYO)中培养72h。用MTT法(Promega)检测细胞增殖情况。增殖反应用刺激指数S.I.表示。所有培养物做三个重复，结果表示为平均值。

[0067] 结果

[0068] 为了评价SPF鸡对重组蛋白疫苗对T细胞表位的识别，进行了脾细胞增殖试验。分别用VP2/3-IL15蛋白抗原和IBDV疫苗抗原对免疫VP2/3-IL15蛋白工程苗和IBDV疫苗的脾细胞进行体外刺激，与对照组相比，即使在10ug/ml的浓度下，VP2/3-IL15蛋白和IBDV活苗免疫组，均产生了明显的高水平的脾细胞增殖反应(S.I.＝7.33～9.52)(见图10)。当VP2/3-IL15蛋白致敏的脾细胞用疫苗抗原刺激时，在50ug/ml浓度下， 与对照相比，表现为显著(P＜0.01)的脾细胞增殖反应(S.I.＝6.48～8.03)。这表明VP2T细胞表位的存在能够产生强烈的细胞免疫反应。阳性对照ConA组在对照组和VP2/3-IL15蛋白免疫组均产生了脾细胞增殖反应(见图11)。

[0069] 实施例十 攻毒保护试验

[0070] 将60只两周龄SPF鸡随机分为6组，每组10只，免疫组肌肉注射免疫。1～3组分别免疫3个批次的20ug/ml重组蛋白工程疫苗，4组肌肉注射1ml商品化疫苗IBDV K85疫苗毒株。5组为攻毒对照组(CC)，6组为非免疫非攻毒对照组(NC)。42日龄时，除NC组，全部免疫试验动物用105.8BLD50/0.25ml的标准强IBDV毒株BC6/85口服攻毒，临床观察10天。如果鸡出现诸如白痢、精神沉郁，食欲下降，羽毛蓬松，翅下垂，闭目打盹等临床症状，立即隔离检查。

[0071] 不同组别的保护水平用宰杀后的法氏囊/体重的比率来(BF/BW)、死亡率和法氏囊炎性反应来表示。期中BF/BW为法氏囊重量×1000/体重，每组表示为平均值±标准差( ±SD)。攻毒后10天的死亡率以死亡数量/总数表示。组织切片检测在试验结束后进行，作为最终的保护结果。法氏囊病变值依据法氏囊病理外观来评价：0为无病变，1为轻微病变，2为分散或部分法氏囊损伤，3为50％毛囊损伤，4为51-75％毛囊损伤，5为76-100％法氏囊损伤。病理炎性反应值大于1表明未保护。分值比率以法氏囊病理病变数量/组总量来计算。保护率以发生法氏囊病理病变值为0和1的动物数量/组总数量表示。

[0072] 结果

[0073] 免疫组动物用标准IBDV毒株攻毒。免疫VP2/3-IL15蛋白组(1～3组)BF/BW比率和非免疫非攻毒组(NC组，6组)无显著差异(P＞0.05)，但明显高于攻毒对照组(5组)(P＜0.05)，这表明VP2/3-IL15蛋白提供了攻毒的保护。商品化IBDV K85组(4组)BF/BW显示高于攻毒对照组，但差异不显著(P＞0.05)(见表2)。

[0074] 所有实验组抵抗IBDV攻毒保护通过法氏囊病理损伤值来衡量(见表2)。表明IBDV攻毒后10天的法氏囊损伤值。重组蛋白工程疫苗免疫组和NC组所有鸡只显示值为0，法氏囊无炎性反应，IBDV活疫苗组只有40％的鸡只获得保护，病变数值为1.7，非免疫攻毒组(5组)显示感染，平均法氏囊病理病变值为4.5。

[0075] 重组蛋白工程疫苗免疫组鸡只全部获得免疫攻毒保护，死亡率为0。但是，4组 免疫商品化IBDV K85死亡率为20％，从法氏囊损伤程度看，保护力明显低于重组蛋白工程疫苗免疫组(P＜0.01)，因为活毒苗本身亦可能导致炎性反应。

[0076] 表2免疫动物攻毒试验保护效力结果

[0077]