一株深绿木霉TA-9菌株及其在水稻病害防控中的应用

摘要

一种深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA‑9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.9698。本发明深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA‑9可以作为生物农药防治多种水稻病害。深绿木霉TA‑9对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)表现出较强的重寄生能力。本发明还涉及深绿木霉TA‑9高产厚垣孢子和分生孢子液体发酵技术，其发酵液稀释50倍后，对立枯丝核菌引起的水稻纹枯病和稻绿核菌引起的稻曲病均具有较好的防控作用。

权利要求

1.深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9菌株在水稻病害防控中的应用，其特征在于，所述深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9，已保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.9698；

所述植物病害包括由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病和稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)引起的稻曲病。

2.权利要求1所述深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9菌株在水稻病害防控中的应用，其特征在于，深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9菌株厚垣孢子高产发酵的方法，(1)液体发酵培养基：15g玉米粉、20g燕麦粉，调节pH至5.0，用水定容至1L；每200mL装入1L三角培养瓶中，121℃湿热灭菌30min；

(2)将深绿木霉TA-9移入PDA斜面培养基上，在28-30℃下培养7d；用无菌水洗下PDA斜6

面培养基上的分生孢子，用血球计数板计数后将孢子液体调至1.0×10 个/mL；每200mL液体发酵培养基中加入上述分生孢子孢子液2mL；在黑暗条件下，30℃，160r/min摇培7-9d，发酵液中厚垣孢子和分生孢子浓度可分别达到5.4×107个/mL和1.6×108个/mL，稀释后加入表面活性剂可用于喷雾施药。

说明书

一株深绿木霉TA-9菌株及其在水稻病害防控中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株深绿木霉菌(Trichoderma atroviride)TA-9及其在水稻病害防控中的应用。技术背景

[0002] 目前，使用化学农药是农作物病害防治的主要措施之一。化学农药在提高农产品产量和品质方面起到了重要作用，但大量使用化学农药也导致了如环境污染、生态破坏、农产品农药残留和病原菌产生抗药性等一系列问题。充分利用综合防控措施对植物病害进行防治，减少化学农药使用，已成为植保工作者的共识。利用环境中的有益微生物防控植物病害是热点研究方向之一。木霉作为植物病害生防因子一直收到普遍关注。木霉常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，对多种植物病原真菌，如立枯丝核菌、腐霉、疫霉、轮枝菌、镰刀菌等具有拮抗和寄生作用，目前已形成商业化木霉生防制剂，如，美国的Topshield(哈茨木霉T22)、以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)、新西兰的木霉制剂Trichodry和Trichoflow等。鉴于木霉菌来源广泛，对不同植物病原菌的拮抗和寄生能力有不同，其应用植物对象也有差异，因此仍需针对某些重要植物病害进行木霉菌株的筛选和开发应用。

[0003] 水稻在其生长季受多种真菌病害的威胁。如，随着优质高产水稻品种在我国大面积推广种植，为水稻纹枯病和稻曲病等真菌病害提供了较好的流行发生条件，病害发生呈现上升趋势。其中水稻纹枯病为我国水稻上的主要病害之一，目前抗病育种中尚缺乏有效的抗病基因。水稻纹枯病为土传病害，病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，病原菌先侵入茎基部叶鞘随后扩展。生产上主要使用微生物源杀菌剂井冈霉素和三唑类化学杀菌剂如丙环唑、苯醚甲环唑、己唑醇等进行防治。其中，井冈霉素长期超量单一使用防治水稻纹枯病，已有部分地区水稻纹枯病菌产生抗药性且防治效果有所下降的报道。

[0004] 稻曲病在我国各大稻区均有发生，已成为水稻上的重要病害之一，其病原菌为稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)，可侵入谷粒形成稻曲球，并产生对人畜有毒的毒素，降低水稻产量和品质，影响食品安全。稻曲病防治最佳时期为水稻破口前5～7天，目前水稻生产上也长期主要使用井冈霉素进行防治。

[0005] 生物防治作为一项重要的病害防控措施已得到社会的广泛认可和关注。在水稻病害防治领域，生防制剂仍较缺乏，更多高效、安全、稳定的生物农药亟需开发，而木霉菌作为一类公认的具有生防潜力的真菌具有较好的应用开发前景。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种深绿木霉，它可以作为生物农药防治多种水稻病害。

[0007] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：本发明深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9菌株是从南京市200份被真菌寄生的水稻稻曲球样品中分离获得，已于2014年9月23日被中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC No.9698，以上所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID No.1所示。拉丁学名为：
Trichoderma atroviride TA-9。

[0008] 菌株培养特性记载为：在PDA培养基上最适生长温度为25-30℃，最高生长温度为37℃。30℃培养2d，菌落直径可达到6.1cm。在PDA上培养4d，中央可形成绿色的分生孢子产孢区域，有椰子气味。

[0009] 菌株形态特征包括：分生孢子梗的可育延伸物没有或很少产生，没有不育的菌毛；分生孢子梗典型分枝方式为单侧分枝，分枝角度近似90°。瓶梗直或弯曲，常为单生，2-4个则呈旋涡状排列。分生孢子绿色，表面光滑，球形或亚球形，3.0～5.0μm×2.3～4.0μm，长宽比值为0.8～1.6，无明显的脱落痕迹。

[0010] 本发明采集江苏省散落稻田中的稻曲球，半埋于湿润的石英砂中，28℃培养15-20d，分离稻曲球上的寄生真菌，分离纯化菌株，然后依次与立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)和稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)进行离体对峙病原菌抑制试验。经过反复筛选，最终选出对立枯丝核菌和稻绿核菌具有强寄生作用、可高产厚垣孢子和分生孢子的木霉菌菌株，编号为TA-9。通过菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征以及内转录基因间区核苷酸序列(ITS)的检测，确定该菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride)。

[0011] 深绿木霉TA-9的厚垣孢子和分生孢子液体发酵物的获得，包括如下步骤：

[0012] (1)菌株活化：将深绿木霉TA-9移至PDA斜面培养基上，在28-30℃下培养7d；

[0013] (2)用无菌水洗下PDA斜面培养基上的分生孢子，用血球计数板计数后将孢子液浓度调节至1.0×106个/mL；

[0014] (3)配制液体发酵培养基，每200mL培养基装入1L三角培养瓶中，121℃湿热灭菌30min；

[0015] (4)每200mL液体发酵培养基中加入步骤(2)中所述木霉分生孢子液2mL；

[0016] (5)在黑暗条件下，30℃，160r/min摇培7-9d，将发酵培养物用组织捣碎机打碎后获得含有5.4×107个/mL的厚垣孢子和1.6×108个/mL分生孢子的发酵混合液；

[0017] 步骤(1)中，PSA培养基组分：200g马铃薯煮液、20g葡萄糖，琼脂20g，用水定容至1L。分装后121℃湿热灭菌备用。

[0018] 步骤(2)中，液体发酵培养基组分：15g玉米粉、20g燕麦粉，调节pH至5.0，用水定容1L。

[0019] 本发明有益效果：

[0020] (1)本发明提供一种新的生防菌株——深绿木霉TA-9菌株，该木霉菌株对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)具有较强的寄生能力；该菌株的液体发酵物可作为生防菌剂用于防治由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病和由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)引起的稻曲病。

[0021] (2)该菌株发酵工艺简单易行，其中厚垣孢子含量高，将有利于长时间贮藏。

附图说明

[0022] 图1为深绿木霉菌株TA-9在菌落对峙培养中重寄生立枯丝核菌和稻绿核菌的照片。

[0023] 图2为深绿木霉菌株TA-9对水稻纹枯病的防效。

[0024] 图3为深绿木霉菌株TA-9对稻曲病的防效。

具体实施方式

[0025] 以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0026] 实施例1：分离获得深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9菌株的方法。

[0027] PDA培养基配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，水1L，琼脂20g/L(固体培养基)。将马铃薯去皮后切成小块，加1L水后煮沸30min，用2层纱布过滤，滤液加葡萄糖，加水补足至1L，如制作固体培养基需加入琼脂后并煮沸，分装后121℃湿热灭菌。

[0028] 包括以下步骤：

[0029] (1)菌株分离、纯化和保存。在南京市多处水稻田中的收集水稻采收后7-10天散落在田间的稻曲球共200个，阴干后，半埋于湿润的灭菌石英砂中，28℃培养15-20d，待稻曲球表面生长寄生真菌，小心挑取稻曲球表面寄生真菌至含有50μg/mL氯霉素的PDA平板上，连续2次以上挑取菌落边缘菌丝接种至PDA培养，待菌落培养性状较为稳定后接种至PDA液体培养基中28℃摇培3-5天，获得分生孢子后进行单孢分离，单孢菌株转移到PDA斜面中培养好后放入4℃冰箱中备用。

[0030] (2)将步骤(1)中描述的真菌菌株转移至PDA平板中活化，采用菌落对峙法筛选立枯丝核菌和稻绿核菌的重寄生菌株：打取直径为5mm的菌碟分别置于直径为9cm的PDA平板 直径1/4处和3/4处，在28℃下黑暗培养，根据重寄生效果评定菌株的生防活性。其中，立枯丝核菌与候选生防菌株须同时接种，而须先接种稻绿核菌菌至PDA平板并在28℃下培养5天后接种候选生防菌株。接种候选生防菌株5-7d后观察其重寄生能力。

[0031] (3)对立枯丝核菌和稻绿核菌的同时具有较强重寄生能力的菌株进行分子和形态鉴定，鉴定结果显示菌株为深绿木霉(Trichoderma atroviride)，将其命名为TA-9，将深绿木霉(Trichoderma atroviride)TA-9菌株的分生孢子液加入终浓度为20％的灭菌甘油，-70℃冻存。TA-9菌株寄生立枯丝核菌和稻绿核菌如附图1所示。

[0032] (4)上述木霉菌株菌落和显微特征为：在PDA培养基上最适生长温度为25-30℃，最高生长温度为37℃。30℃培养2d，菌落直径可达到6.1cm。在PDA上培养4d，中央可形成绿色的分生孢子产孢区域，有椰子气味。分生孢子梗的可育延伸物没有或很少产生，没有不育的菌毛；分生孢子梗典型分枝方式为单侧分枝，分枝角度近似90°。瓶梗直或弯曲，常为单生，2-4个则呈旋涡状排列。分生孢子绿色，表面光滑，球形或亚球形，3.0～5.0μm×2.3～4.0μm，长宽比值为0.8～1.6，无明显的脱落痕迹。

[0033] (5)本发明涉及的深绿木霉菌株TA-9的ITS特征序列如SEQ ID No.1所示。

[0034] 实施例2：深绿木霉TA-9菌株的厚垣孢子和分生孢子发酵物的制备。

[0035] 将深绿木霉TA-9移入PDA斜面培养基上，在28-30℃下培养7d；用无菌水洗下PDA斜面培养基上的分生孢子，用血球计数板计数后将孢子液浓度调节至1.0×106个/mL；配制液体发酵培养基，其组分为：15g玉米粉、20g燕麦粉，调节pH至5.0，用水定容至1L，每200mL装入1L三角培养瓶中，121℃湿热灭菌30min。每200mL液体发酵培养基中加入上述分生孢子孢子液2mL，在黑暗条件下，30℃，160r/min摇培7-9d，将发酵培养物打碎后获得含有5.4×107个/mL的厚垣孢子和1.6×108个/mL分生孢子的发酵液，可稀释后加入表面活性剂用于喷雾施药。

[0036] 实施例3：深绿木霉TA-9发酵物对水稻纹枯病的防治效果。

[0037] 本试验在盆栽水稻上进行。将育好的水稻品种金刚30的秧苗移栽到盆钵(直径30cm、高度40cm)中，每盆栽3穴，每穴5株苗，肥水按照常规管理，并保证每盆的肥水条件一致。

[0038] 将直径为5mm立枯丝核菌野生型菌株RH-2的菌碟接种至PDA平板上，28℃培养3-4d，将培养基划碎后接种至装有灭菌火柴梗的三角瓶中，28℃继续培养3-4d，期间每天摇混
1次，可使立枯丝核菌菌丝附着在疏松的火柴梗上。

[0039] 将带有立枯丝核菌的火柴梗插入至分蘖盛期水稻的倒数第3-4片叶的叶鞘，每个重复接种10个水稻健株。接种后喷施深绿木霉TA-9菌株的发酵物稀释液(加入终浓度为0.1％的 表面活性剂平平加O-20)和对照药剂5％井冈霉素(250倍稀释使用)，施药量为
2
50L/667m ，每个处理4次重复，药剂对照处理喷施清水。在孕穗末期随机调查每个处理中的
5株接种水稻的发病情况，并计算防治效果。方法如下：先测量出接菌稻株的病斑扩展长度和该稻株本身的高度，然后按下面公式计算病斑长度与稻株高比值：比值＝病斑的扩展长度/对应稻株的高度；根据比值计算防治效果；防治效果(％)＝[(未施药对照比值-施药处理比值)/未施药处理比值]×100。

[0040] 深绿木霉TA-9对水稻纹枯病具有较好的防治效果。结果见表1，TA-9发酵物的20倍稀释液对水稻纹枯病的平均防效可达66.49％，50倍稀释液对水稻纹枯病的平均防效可达61.51％，100倍稀释液对水稻纹枯病的平均防效可达59.88％，均与对照药剂井冈霉素的平均防效64.57％无显著差异(P＜0.05)。

[0041] 表1深绿木霉TA-9发酵液对水稻纹枯病的防治效果

[0042]

[0043] 注：数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(P＜0.05)

[0044] 实施例4：深绿木霉TA-9发酵物对稻曲病的防治效果。

[0045] 本试验在栽培在水泥池中的水稻上进行。将育好的水稻品种两优培九的秧苗移栽到水泥池(长12米、宽1.5米)中，每行栽培6穴，每行间隔25cm，肥水按照常规管理。每3行水稻为一个小区，每2个小区之间间隔2行。

[0046] 将10块直径为5mm的新鲜稻曲病绿核菌野生型菌株P-1的菌碟接种于200mL PDA液体培养基中，28℃，130r/min摇培5-7d，使用组织捣碎机将菌丝打碎，使用PSA液体培养基调节其分生孢子浓度至1×106个/mL，使用喷雾机将稻绿核菌菌悬液喷洒至破口前7-10d的两优培九水稻(50L/667m2)，随后喷施深绿木霉TA-9菌株的发酵物稀释液(加入终浓度为 0.1％的表面活性剂平平加O-20)和对照药剂5％井冈霉素(250倍稀释使用)，施药量为50L/
667m2，每个处理4次重复，药剂对照处理喷施清水。待水稻成熟后调查各小区稻曲病病穗数、病粒数并分级(见表2)，计算病情指数和防效。病情指数＝∑(各级发病穗数×各级代表值)/(调查总穗数×最高级代表值)×100；防效(％)＝(清水对照病情指数一处理区病情指数)/清水对照病情指数×100。

[0047] 表2稻曲病穗病粒数与病级的对应关系

[0048]

[0049] 深绿木霉TA-9发酵物对稻曲病具有良好防效(表3)。深绿木霉TA-9发酵物50倍稀释液对稻曲病的平均防效为63.40％，与对照药剂井冈霉素的平均防效68.40％无显著差异(P＜0.05)。

[0050] 表3深绿木霉TA-9发酵液对稻曲病的防治效果

[0051]

[0052] 注：数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(P＜0.05)。