一种喘可治注射液4种黄酮类有效成分检测方法

摘要

本发明涉及一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，通过液相色谱质谱联用，能够同时分离并测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷四种有效成分，该方法稳定可靠并能够真实反映产品的质量，适合产业化的日常生产检验。

权利要求

1.一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)对照品溶液的制备：取对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，用甲醇或流动相溶解即得；

2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，用甲醇或流动相溶解即得；

3)供试品溶液的制备：取喘可治注射液用甲醇或流动相稀释即得；

4)检测方法：高效液相色谱质谱联用，所述的高效液相色谱条件，C18色谱柱50～150×

2.1mm,3.0～5.0μm；流动相：乙腈:0.1％～1％甲酸水溶液30:70～40:60，等度洗脱，进样量：5～20μl；柱温：35～45℃；流速：0.2～0.3ml/min；所述的质谱条件，辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7000～8000CC/min，雾化气流量：6～10L/min，气帘气流量：5～8L/min，离子源喷雾电压：‐3800～‐4500V，离子源雾化温度：350～400℃。

2.如权利要求1所述的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷分别配置成1mg/ml的对照品储备液；再分别精密量取对照品储备液置于同一量瓶中，加入甲醇稀释配制成朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均为1000ng/ml的混合对照品储备液。

3.如权利要求1所述的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的柚皮苷对照品配制成1mg/ml的内标储备液，通过稀释步骤配制成2μg/ml内标溶液。

4.如权利要求3所述的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于：所述的稀释步骤是指取内标储备液置于量瓶中，加入甲醇或流动相配制成100μg/ml内标次级储备溶液，精密吸取内标次级储备液置于量瓶中，加入甲醇或流动相配制成2μg/ml内标溶液。

5.如权利要求1所述的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于：步骤(3)用流动相稀释喘可治注射液，精密量取1000-2000μl并加入1/5倍内标溶液混合均匀，过滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

6.如权利要求1所述的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种1mg/ml对照品储备液；分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液；

2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，精密称定，置于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/ml内标储备液；精密量取内标储备液适量，置于量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液；精密吸取内标次级储备液置量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液2μg/ml；

3)供试品溶液制备：用乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液；

4)检测条件：

色谱条件

色谱柱C18 150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65、等度洗脱3.5min、进样量10μl、柱温40℃、流速0.22ml/min；

质谱条件

辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 

721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

说明书

一种喘可治注射液4种黄酮类有效成分检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种喘可治注射液有效成分的检测方法。

背景技术

[0002] 喘可治注射液是国家二类中药新药，系由淫羊藿和巴戟天药材组成，具有温和补肾，平喘止咳，有抗过敏、增强体液免疫与细胞免疫的功能，且毒副反应小，药用机理明确，在免疫功能紊乱性疾病如哮喘、慢性支气管炎的临床应用前景广阔。

[0003] 喘可治注射液中含有主要成分为黄酮苷，黄酮苷分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷的含量，这些黄酮苷来自淫羊藿药材。淫羊藿药材来源多，成分复杂质量不好控制。目前喘可治注射液所用的箭叶淫羊藿药材未见对朝藿定A、朝藿定B的定量分析，现行的喘可治注射液含量测定方法只需考察朝藿定C与淫羊藿苷的量，还没有对其它黄酮类成分的含量分析。

[0004] 液相质谱联用技术因分析快速、样品处理简洁、灵敏度高而越来越频繁地用于中药质量分析中。因此本研究采用高效液相色谱-串联质谱法快速、准确测定喘可治注射液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷这4种黄酮苷的含量，为喘可治注射液提供更加完备可靠的质量控制手段。

发明内容

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种喘可治注射液4种黄酮类有效成分检测方法，该方法稳定可靠，能够真是反映产品的内在质量，操作简单，适合产业化的日常检验工作。

[0006] 本发明的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，包括如下步骤：

[0007] (1)对照品溶液的制备：取对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，用甲醇或流动相溶解即得；

[0008] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，用甲醇或流动相溶解即得；

[0009] (3)供试品溶液的制备：取喘可治注射液用甲醇或流动相稀释即得；

[0010] (4)检测方法：色谱质谱联用，所述的色谱条件，色谱柱C18、流动相：乙腈-酸水溶液；所述的质谱条件，辅助气化电喷雾离子源ESI、多反应离子监测MRM模式负离子检测。

[0011] 进一步优选步骤(1)中所述的对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷分别配置成1mg/ml的对照品贮备液；再分别精密量取对照品储备液置于同一量瓶中，加入甲醇稀释配制成朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均为1000ng/ml的混合对照品储备液。

[0012] 更进一步优选步骤(1)所述的对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液；
再分别精密量取4种对照品储备液置于同一10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度配制成朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均为1000ng/ml的混合对照品储备液。

[0013] 上述步骤(2)中内标溶液的制备，进一步地，步骤(2)所述的柚皮苷对照品配制成1mg/ml的内标贮备液，通过稀释步骤配制成2μg/ml内标溶液。

[0014] 上述步骤(2)中所述的稀释步骤是指取内标储备液置于量瓶中，加入甲醇或流动相配制成100μg/ml内标次级储备溶液，精密吸取内标次级储备液置于量瓶中，加入甲醇或流动相配制成2μg/ml内标溶液。

[0015] 进一步地，步骤(2)取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0016] 本发明步骤(3)所述供试品制备，进一步地，用流动相稀释喘可治注射液，精密量取1000-2000μl并加入1/5倍内标溶液混合均匀，滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0017] 更进一步，步骤(3)用流动相稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0018] 本发明所述的步骤(4)检测方法，其中所述的色谱条件：C18色谱柱(50-150)×2.1mm,粒径3.0～5.0μm；流动相：乙腈:0.1～1％甲酸水溶液，等度洗脱(30-40:60-70)进样量：5～20μL，柱温：35～45℃，流速0.2～0.3mL/min。所述的质谱条件：辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7000～8000CC/min，雾化气流量：6～10L/min，气帘气流量：5～8L/min，离子源喷雾电压：-3800～-4500V，离子源雾化温度：350-400℃。

[0019] 上述步骤(1)-(4)中所述的流动相是乙腈-0.1～1％酸水溶液，所述的酸包括但不限于为甲酸、乙酸中一种或以上。优选流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液。

[0020] 本发明最佳的检测方法，包括如下步骤：

[0021] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种1mg/ml对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液；

[0022] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，精密称定，置于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至 刻度，配制成1mg/ml内标储备液。精密量取内标储备液适量，置于量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液置量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)；

[0023] (3)供试品溶液制备：用乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液；

[0024] (4)检测条件：

[0025] 色谱条件

[0026] 色谱柱C18150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65、等度洗脱3.5min、进样量10μl、柱温40℃、流速0.22ml/min；

[0027] 质谱条件

[0028] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

[0029] 有益效果

[0030] 为了更好的阐述本发明的有益效果，通过下述试验证明

[0031] 试验例一、方法学考察

[0032] 1材料、试剂与仪器

[0033] 1.1标准品

[0034]

[0035] 它们的化学结构式见图1。

[0036] 1.2试剂

[0037] 甲醇(色谱级美国Fisher Scientific公司)、乙腈(色谱级美国Fisher Scientific公司)甲酸广州化学试剂厂、纯水、超纯水(Milli-Elix,Milli-Q制水系统)[0038] 1.3供试品

[0039] 喘可治注射液(批号：13052501，13052801，13052601，11121001，13022502，13052702，12081502，13052902，13042702，12072001，12092301，12071902，13053002，
13030102， 20110305)由广州万正药业有限公司提供。

[0040] 1.4仪器

[0041]

[0042] 2、实验方法

[0043] 2.1分析方法

[0044] 2.1.1色谱条件

[0045] 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(150×2.1mm,5.0μm)。流动相：乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)，等度洗脱3.5min。进样量：10μl；柱温：40℃；流速：0.22ml/min。

[0046] 2.1.2质谱条件

[0047] 辅助气化电喷雾离子源(ESI)；多反应离子监测(MRM)模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2(朝藿定A)，m/z 853.5→645.3(朝藿定B)，m/z 867.4→659.4(朝藿定C)，m/z 721.3→513.2(淫羊藿苷)，m/z 579.2→271.1(柚皮苷)，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

[0048] 2.2工作溶液的配制

[0049] 2.2.1系列浓度混合对照品溶液的配制

[0050] 取4个黄酮对照品各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。2.2.2内标溶液的配制

[0051] 取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。2.2.3供试品溶液的制备

[0052] 用乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0053] 2.2.4标准曲线和质控样品的制备

[0054] 取4种黄酮的标准品储备液，根据各自具体浓度取精确的体积置于同一个10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)至刻度，配制成4种黄酮均为1000ng/ml的混合标准品溶液。然后再按照下示流程逐级稀释，配制800,300,100,30,10,3,1ng/ml。

[0055]

[0056] 将配制好的样品分装好，放入-80℃保存。

[0057] 用于分析方法验证的质控样品，是将4种黄酮的标准品储备液加入到流动相中配制而成。其配制过程也按上述方法同法逐步稀释配制成含浓度为3，30，300，800ng/ml的低、中、高四个浓度的质控样品，各质控样品配6份。精密量取1000μl各浓度标准曲线样品及质控样品加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得标准曲线和质控样品溶液。2.3方法学考察

[0058] 2.3.1标准曲线的建立

[0059] 取配制好的8个浓度的标准曲线待测样品，从低浓度1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml依次连续进样，以被测物浓度值(X)为横坐标，被测物与内标物的峰面积之比(Y)为纵坐标，得标准曲线线性方程和线性相关系数r值。

[0060] 2.3.2精密度考察

[0061] 将上述制备的浓度为3，30，300，800ng/ml的质控样品，按上述方法测定。每个浓度6 份样品于同批分别制备并测定。日内精密度及准确度实验中质控样品连续测定6次；日间精密度及准确度实验中质控样品于不同天检测，测定3天。测得化合物的峰面积与内标峰面积的比值代入随行标准曲线，计算测定浓度。

[0062] 精密度用质控样品的日内和日间相对标准差(RSD)表示，相对标准差要求小于15％。准确度为质控样品的测定浓度与真实浓度的百分比，要求准确度在85-115％范围内。

[0063] 2.3.3重复性考察

[0064] 取同一批喘可治注射液样品6份，按供试品制备方法制备，并依上述色谱和质谱条件测定样品中4种黄酮苷的含量，代入随行生物标准曲线，计算测得浓度的准确度和RSD值。

[0065] 2.3.4稳定性考察

[0066] 取上述供试品溶液，在室温(25℃)下分别放置0，2，4，8，12，18，24h后分别依上述相同的色谱和质谱条件测定样品中4种成分的含量，代入随行的标准曲线，计算测得浓度的准确度和RSD值，考察室温(25℃)放置稳定性，放置时间应该超过单个批次样品等待分析所需要的时间。

[0067] 2.3.5加样回收率考察

[0068] 取已测得含量的喘可治注射液样品6份，分别精密加入约等同于成药样品含量的4种黄酮苷化学对照品，代入随行标准曲线，按供试品溶液制备方法制备，依照上述色谱和质谱条件测定并计算加样回收率。

[0069] 3实验结果

[0070] 3.1分析条件的确定

[0071] 应用全扫描和子离子扫描模式获得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和柚皮苷的全扫描和子离子扫描质谱图，选择灵敏度高的母子离子对进行定量分析，质谱相关参数见表1。按优化的液相色谱分离条件，喘可治注射液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和柚皮苷的保留时间分别为1.86，1.95，2.02，2.37和1.65min，各测定物质及内标互不干扰，在3.5min内可以完成一个样品中4个成分的测定。各物质质谱扫描图见图2，MRM质量色谱图见图3。

[0072] 表1 4种黄酮及内标的母子离子对和相关电压参数

[0073]

[0074]

[0075] 3.2线性范围及定量限、检测限

[0076] 取含4个黄酮的系列浓度混合对照品溶液，按照上述色谱和质谱条件进行检测。以各成分峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标(Y)，各成分浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得朝藿定A、B、C、淫羊藿苷的回归方程及定量下限数据见表2。

[0077] 表2 4种黄酮的标准曲线及定量下限

[0078]

[0079] 4种黄酮成分在1.0-1000.0ng/ml范围内，线性关系良好，4种物质定量下限为1ng/ml时精密度及准确度均较好。

[0080] 3.3精密度

[0081] 取四个浓度分别为3，30，300和800ng/ml的质控溶液进行日间和日内精密度考察。日内精密度，每个浓度的质控样品连续进样6次；日间精密度，采用同法测定3天，计算其含量的相对标准偏差(RSD)。日内和日间精密度结果见表3，日内精密度RSD﹤5.57％，日间精密度RSD﹤5.76％。

[0082] 表3 4种黄酮苷的日间及日内精密度

[0083]

[0084]

[0085] 3.4重复性

[0086] 取同一批喘可治注射液样品6份，按供试品制备方法制备，并依上述色谱和质谱条件测定样品中4种黄酮苷的含量，同批样品中朝藿定A含量为84.8μg/ml(RSD 2.73％,n＝6)；朝藿定B含量为88.2μg/ml(RSD 1.06％,n＝6)；；朝藿定C含量为895.6μg/ml(RSD 
0.83％,n＝6)；淫羊藿苷含量为156.4μg/ml(RSD 0.70％,n＝6)。

[0087] 3.5稳定性

[0088] 取上述供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，18，24h进样测定，考察稳定性，其测定结果朝藿定A(RSD 3.81％,n＝7)；朝藿定B(RSD 2.95％,n＝7)；朝藿定C(RSD 2.95％,n＝7)；淫羊藿苷(RSD 2.71％,n＝7)，表明样品溶液24h内稳定。

[0089] 3.6加样回收率

[0090] 取已测得含量的喘可治注射液样品6份，分别精密加入约等同于成药样品含量的4种黄酮苷化学对照品，按供试品溶液制备方法制备，依照上述色谱和质谱条件测定并计算加样回收率，结果见表4。

[0091] 表4 喘可治注射液中4种黄酮苷的加样回收率

[0092]

[0093]

[0094] 3.7样品测定结果

[0095] 将15批喘可治注射液按供试品溶液制备方法制备，依照上述色谱和质谱条件测定，测定结果见表5和图4。

[0096] 表5 15批次喘可治注射液中4种黄酮成分的含量测定

[0097]

[0098] 本研究建立了同时测定喘可治注射液中4种黄酮苷的LC-MS/MS定量方法，完善了注射液质量评价体系。经系统适用性实验表明，该方法稳定可靠、灵敏准确，3.5min即可完成一个样品的测定，且样品前处理简单，可用于实际生产中喘可治注射液的质量监控。国家食品药品监督管理局国家药品标准规定喘可治注射液每1ml含朝藿定C与淫羊藿苷的总量在0.50-1.00mg。本实验检测了15批喘可治注射液，结果显示四种黄酮苷在15批注射液中的含量比较稳定，且每批所含的朝藿定C与淫羊藿苷的总量均在国家药品标准要求的范围内。

[0099] 试验例二、流动相的选择筛选试验

[0100] 本研究对流动相系统进行了优化，比较了甲醇-水(35:65)、乙腈-水(35:65)系统对喘可治注射液中4种黄酮苷分离的影响，结果表明乙腈-水(35:65)系统可以获得较好的峰形和较高灵敏度；考虑到所测化合物的特性，本研究在流动相系统中加入了适量有机酸以改善峰形和提高灵敏度，研究比较了加入甲酸和乙酸对试验结果的影响，结果表明在流动相系统中加入甲酸，且加入甲酸的百分比在0.1％范围内时各化合物峰形对称、灵敏度较高。当流动相(乙腈-甲酸水)在30:70～40:60比例范围内，各成分可以达到较好的分离，且分析时间适宜。

附图说明

[0101] 图1 4种黄酮及内标的结构式(A是朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷结构式、B柚皮苷结构式)

[0102] 图2 4种黄酮及内标的全扫描和子离子扫描图(A-1至A-5分别为朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷及内标的全扫描质谱图；B-1至B-5分别为朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷及内标的子离子扫描质谱图)

[0103] 图3 4种黄酮及内标物的质量色谱图(A为空白溶剂，B-1至B-5分别为朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷及内标对照品峰；C-1至C-4分别为样品中朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C及淫羊藿苷)

[0104] 图4 4种黄酮苷在15批次喘可治注射液中的分布

具体实施方式

[0105] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不对本发明的权利要求范围进行限制。

[0106] 实施例1

[0107] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。

[0108] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0109] (3)供试品溶液制备：用乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0110] (4)检测条件：

[0111] 高效液相色谱条件

[0112] 色谱柱C18150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65、等度洗脱3.5min、进样量10μl、柱温40℃、流速0.22ml/min；

[0113] 质谱条件

[0114] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

[0115] 分别取对照品、内标溶液和供试品溶液按照上述检测条件，测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分别为66.11μg/ml，84.37μg/ml，724.5μg/ml，160.6μg/ml。

[0116] 实施例2

[0117] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(65:35)稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。

[0118] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0119] (3)供试品溶液制备：用乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0120] (4)检测条件：

[0121] 高效液相色谱条件

[0122] 色谱柱C18100×2.1mm,3.0μm、流动相乙腈:0.1％甲酸水溶液40:60、等度洗脱3.5min、进样量5μl、柱温35℃、流速0.2ml/min；

[0123] 质谱条件

[0124] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7000CC/min，雾化气流量：6L/min，气帘气流量：5L/min，离子源喷雾电压：-3800V，离子源雾化温度：350℃。

[0125] 分别取对照品、内标溶液和供试品溶液按照上述检测条件，测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分别为63.47μg/ml，80.35μg/ml，725.1μg/ml，156.3μg/ml。

[0126] 实施例3

[0127] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(65:35)稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。

[0128] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0129] (3)供试品溶液制备：用乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0130] (4)检测条件：

[0131] 高效液相色谱条件

[0132] 色谱柱C18150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:0.1％甲酸水溶液35:65、等度洗脱3.5min、进样量20μl、柱温45℃、流速0.3ml/min；

[0133] 质谱条件

[0134] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：8000CC/min，雾化气流量：10L/min，气帘气流量：8L/min，离子源喷雾电压：-4500V，离子源雾化温度：400℃。

[0135] 分别取对照品、内标溶液和供试品溶液按照上述检测条件，测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷分别为65.33μg/ml，78.95μg/ml，716.4μg/ml，151.7μg/ml。

[0136] 实施例4

[0137] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。

[0138] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(25:75)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0139] (3)供试品溶液制备：用乙腈:1％甲酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液1000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0140] (4)检测条件：

[0141] 高效液相色谱条件

[0142] 色谱柱C18150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:0.5％甲酸水溶液30:70、等度洗脱5.5min、进样量20μl、柱温45℃、流速0.2ml/min；

[0143] 质谱条件

[0144] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

[0145] 分别取对照品、内标溶液和供试品溶液按照上述检测条件，测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分别为62.18μg/ml，81.12μg/ml，718.4μg/ml，152.6μg/ml。

[0146] 实施例5

[0147] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。

[0148] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％乙酸水溶液(25:75)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸 取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.1％甲酸水溶液(25:75)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0149] (3)供试品溶液制备：用乙腈:0.1％甲酸水溶液(25:75)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0150] (4)检测条件：

[0151] 高效液相色谱条件

[0152] 色谱柱C18150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:0.1％乙酸水溶液40:60、等度洗脱3.5min、进样量10μl、柱温40℃、流速0.22ml/min；

[0153] 质谱条件

[0154] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

[0155] 分别取对照品、内标溶液和供试品溶液按照上述检测条件，测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分别为66.33μg/ml，79.39μg/ml，722.8μg/ml，158.3μg/ml。

[0156] 实施例6

[0157] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各约10mg，精密称定，分别置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。

[0158] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置10ml量瓶中，加入乙腈:0.1％甲酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得100μg/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液200μl，置10ml量瓶中，加乙腈:0.5％磷酸水溶液(35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液(2μg/ml)。

[0159] (3)供试品溶液制备：用乙腈:0.5％磷酸水溶液(35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000μl加内标工作液200μl，涡旋40s，过0.22μm滤膜，取续滤液，得供试品溶液。

[0160] (4)检测条件：

[0161] 高效液相色谱条件

[0162] 色谱柱C18150×2.1mm,5.0μm、流动相乙腈:1％乙酸水溶液35:65、等度洗脱4.0min、 进样量15μl、柱温35℃、流速0.2ml/min；

[0163] 质谱条件

[0164] 辅助气化电喷雾离子源ESI；多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为：m/z 883.4→675.2朝藿定A，m/z 853.5→645.3朝藿定B，m/z 867.4→659.4朝藿定C，m/z 721.3→513.2淫羊藿苷，m/z 579.2→271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温度：350℃。

[0165] 分别取对照品、内标溶液和供试品溶液按照上述检测条件，测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分别为66.18μg/ml，77.95μg/ml，726.0μg/ml，155.6μg/ml。