重组低毒力1型牛疱疹病毒(BoHV‑1)疫苗载体

摘要

本公开内容教导一般属于牛科动物的疫苗接种和疾病控制领域。提供了重组1型牛疱疹病毒(BoHV‑1)疫苗载体来有效控制一种或更多种牛病原体如与牛呼吸道疾病综合症相关的那些牛病原体，例如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，并且其改善了由此引起的疾病病症。本文还包括用于管理受限或成群牛科动物的方案。

权利要求

1.一种针对来自牛病原体的至少一种抗原的疫苗，所述疫苗包含来自低毒力BoHV-1的

1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码所述至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入不下调所述BoHV-1基因的表达，并且其中编码所述至少一种抗原的遗传物质在以下位点插入两个会聚基因的聚腺苷酸化信号之间，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的16600至

16612、22449至22493、40734至40768、58229至58563、67037至67091、74994至75041、84496至84528、90732至90760和96870至96882。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中编码所述至少一种抗原的遗传物质经由GET重组插入所述BoHV-1基因组中。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述至少一种抗原在选自16600至16612的位点插入两个会聚基因之间。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种抗原选自来自牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抗原、来自3型牛副流感病毒的抗原、来自牛呼吸道合胞体病毒的抗原和来自微生物的抗原。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述BVDV抗原选自糖蛋白E0和糖蛋白E2。

6.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述微生物选自：牛支原体(Mycoplasma bovis)、沙门氏菌(Salmonella)种、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannhiemia haemolytica)和睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)。

7.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述低毒力BoHV-1毒株是毒株V155。

8.兽医用药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的疫苗和一种或更多种可药用载体、赋形剂和/或稀释剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其配制成适于经鼻施用。

10.来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组在制备用于针对来自牛病原体的至少一种抗原对牛科动物接种疫苗的药物中的用途，其中所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码所述至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入不下调所述BoHV-1基因的表达，并且其中编码所述至少一种抗原的遗传物质在以下位点插入两个会聚基因的聚腺苷酸化信号之间，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的16600至16612、22449至22493、40734至40768、58229至58563、67037至

67091、74994至75041、84496至84528、90732至90760和96870至96882。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物配制成用于经鼻内、经口、肌内、舌下、静脉内、皮下、动脉内、皮肤喷雾、阴道内或直肠内途径施用。

12.一种制备针对来自牛病原体之至少一种抗原的疫苗的方法，所述方法包括：

(i)将来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组并入细菌人工染色体(BAC)载体中以形成BoHV-1预载体BAC构建体；

(ii)经由GET重组将编码所述至少一种抗原的遗传物质插入所述BoHV-1预载体BAC构建体中以产生重组BoHV-1-BAC(rBoHV-1-BAC)载体，将编码所述至少一种抗原的所述遗传物质在以下位点插入两个会聚基因的聚腺苷酸化信号之间，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的16600至16612、22449至22493、40734至40768、58229至58563、

67037至67091、74994至75041、84496至84528、90732至90760和96870至96882；

(iii)在细菌宿主中转化和扩增所述rBoHV-1-BAC载体；以及

(iv)从所述细菌宿主中纯化并分离所述rBoHV-1-BAC载体并且将所述载体配制成疫苗组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述至少一种抗原在选自16600至16612的位点插入两个会聚基因之间。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种抗原选自来自牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抗原、来自3型牛副流感病毒的抗原、来自牛呼吸道合胞体病毒的抗原和来自微生物的抗原。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述BVDV抗原选自糖蛋白E0和糖蛋白E2。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述微生物选自：牛支原体、沙门氏菌种、多杀巴斯德氏菌、溶血性曼氏杆菌和睡眠嗜血菌。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述低毒力BoHV-1毒株是毒株V155。

18.用根据权利要求12所述的rBoHV-1-BAC载体转染的培养细胞。

说明书

重组低毒力1型牛疱疹病毒(BoHV-1)疫苗载体

[0001] 申请数据

[0002] 本申请相关于并要求于2011年7月5日提交的题为“A vaccine”的澳大利亚临时专利申请No.2011902660的优先权，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

[0003] 本公开内容教导一般属于牛科动物(bovine animals)的疫苗接种和疾病控制领域。提供了疫苗载体来有效控制一种或更多种牛病原体(例如牛呼吸道疾病综合症(bovine respiratory disease complex)相关的那些牛病原体)并且改善了由此引起的疾病病症。本文还包括用于管理受限或成群牛科动物的方案。

背景技术

[0004] 作者在本说明书中引用的出版物文献目录细节按字母顺序汇总于说明书的结尾处。

[0005] 本说明书中对任何现有技术的引用不是也不应被认为是承认或以任何形式提示该现有技术构成任何国家的公知常识的一部分。

[0006] 牛呼吸道疾病综合症(BRDC)为澳大利亚饲育牛(feedlot cattle)最显著的传染性疾病。BRDC因为发病率、死亡率、饲料资源的损耗、药物购买、增加的饲养时间和相关劳动力成本而造成经济损失。BRDC的病因复杂，原因在于至少四种病毒类和三种细菌类以及使动物易患疾病的环境条件。

[0007] 与BRDC相关的四种病毒是1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus 1,BoHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV或牛瘟病毒(bovine pestivirus))、3型牛副流感病毒(bovine parainfluenza 3)和牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus)。血清学研究已经表明，所有这些病毒都会感染澳大利亚饲育牛。BRDC中还涉及到多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida)、溶血性曼氏杆菌(Manhiemia haemolytica)和睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)这三种细菌菌种。

[0008] 在北美洲和欧洲，使用活疫苗和灭活疫苗两者来控制由BoHV-1引起的疾病。这些疫苗基于与澳大利亚所见的BoHV-1基因型不同的BoHV-1基因型。北美洲和欧洲BoHV-1毒株通常被归入亚群1.1而澳大利亚毒株构成亚群1.2。与BoHV-1.2病毒相比，BoHV-1.1病毒导致更严重的临床疾病。尚不知晓该表型差异的准确分子机制。

[0009] BoHV-1是疱疹病毒(Herpesviridae)科的病毒，其在世界范围导致牛的多种疾病，包括鼻气管炎、阴道炎、阴茎头包皮炎、流产、结膜炎和肠炎。BoHV-1还是航运热的影响因素。其通过性接触、人工授精和空气传染(aerosol transmission)传播。如同其他疱疹病毒一样，BoHV-1导致终生潜伏性感染并且释放病毒。坐骨神经和三叉神经为潜伏部位。

[0010] 由BoHV-1引起的呼吸道疾病通常被称为传染性牛鼻气管炎。症状包括发热、鼻流出物(discharge from the nose)、咳嗽、呼吸困难和食欲丧失。口和鼻中通常发生溃疡。死亡率可达到10％。生殖器疾病导致母牛传染性脓疱性外阴阴道炎和公牛传染性阴茎头包皮炎。症状包括发热、抑郁、食欲丧失、排尿疼痛、母牛阴门肿胀并伴有脓疱和流出物并且在与公牛性接触时疼痛。在这两种情况下，病变通常在两周内消退。在感染后一至三个月可能发生流产和死产。BoHV-1还导致新生小牛的全身性疾病，特征为肠炎和死亡。

[0011] 类似地，BVDV是降低牛的繁殖力并提高其死亡率的疾病。其由来自黄病毒科(Flaviviridae)的瘟病毒引起。瘟病毒能够在妊娠期间建立持续的感染。持续感染瘟病毒通常不易被察觉。BVDV还常常进行非同源RNA重组，这导致出现了使宿主致死的在遗传上独特的病毒。

[0012] 粘膜糜烂与以急性形式的牛病毒性腹泻发生的腹泻的临床体征(clinical sign)对那些被感染的动物有显著影响，但是被持续感染的动物的代价更大。通常，这样的动物不能实现其遗传潜力，其表现出体重增加减少，疾病易感性增加以及生育率降低。它们释放病毒，从而导致群体中未免疫动物丧失生殖力。

[0013] 暴露于致细胞病变的BVDV变体的母牛(45至125天妊娠)通常将流产。更早暴露于任一变体导致早期胚胎死亡。暴露天数在妊娠125至175天之间会导致出生缺陷(例如视觉缺陷和脑积水)并且暴露超过175天通常将导致小牛在出生时被完全免疫。

[0014] 因此，由于BRDC的严重性及其对畜牧业的显著影响，需要改进疫苗接种。与灭活病毒相比，减毒病毒提供更好的保护，原因是减毒病毒向宿主的免疫系统呈递更多的病毒抗原。减毒病毒的另一个重要优点是其施用于鼻内的潜力，即在感染后野生型病毒的第一繁殖部位。

[0015] 长期以来已经认识到BVDV的抗原变异性使得很难确定针对何种病毒来进行疫苗接种。可采用两种方法来进行BVDV特异性疫苗接种。一种是对防止靶病毒感染细胞的中和抗体的诱导。第二种是诱导靶向破坏被病毒感染细胞的细胞介导免疫(CMI)，由此降低病毒感染作用。BVDV的主要中和表位是结构糖蛋白，并且由于免疫选择，这些蛋白质的变异性也最大。因此，设计基于糖蛋白的疫苗需要包含最常见的抗原类型。BVDV的非结构蛋白通常更加保守，原因是其特定酶功能限制了蛋白质序列可能发生的变化。

[0016] 对于合适的BRDC控制项目而言，有必要具有可与野生型病毒相区分的有效且安全的疫苗。此前使用BoHV-1开发的疫苗被构建为缺失糖蛋白和/或包含胸苷激酶缺失突变体。这些疫苗还存在一些问题，如胸苷激酶基因参与病毒复制并且复制越少可造成保护越小，原因是参与产生体液免疫的糖蛋白的水平较低。

[0017] 需要开发能够控制BRDC和与此相关的特定病原体之改进的并且更有效的疫苗。

发明内容

[0018] 通过序列标识符(SEQ ID NO)引用核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO以数字对应序列标识符<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)等。表1提供了序列标识符总览。在权利要求书之后提供了序列表。

[0019] 牛呼吸道疾病综合症(BRDC)是牛科动物(尤其是饲养在受限环境例如饲养场和乳制品厂中的那些)的一种显著疾病风险。被BRDC相关病原体感染可迅速传播并且可导致显著的发病率、死亡率以及降低的繁殖力。本文中教导了改进的疫苗载体，其包含被修饰为携载编码牛病原体中的一个或更多个抗原之遗传物质的来自BoHV-1低毒力(virulence)毒株的基因组。

[0020] 因此，本文的疫苗能够针对至少一种来自牛病原体的抗原，所述疫苗包含来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组，其具有与BoHV-1异源、插入两个会聚(converging)BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0021] 所述疫苗在刺激对BoHV-1以及其他牛病原体(例如BVDV、支原体(Mycoplasma)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、曼氏杆菌(Manhiemia)和嗜血菌(Haemophilus))相关抗原之免疫应答的方面的能力是多价的。BVDV抗原的实例包括糖蛋白E0和E2。

[0022] 在一个实施方案中，使用诱导型重组系统(例如GET重组)来引入异源遗传物质。

[0023] 本文教导的另一个方面是针对来自牛病原体的至少一种抗原而对牛科动物接种疫苗的方法，所述方法包括对牛科动物施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0024] 本文的方法能够制备针对来自牛病原体的至少一种抗原的疫苗，所述方法包括：

[0025] (i)将来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组并入细菌人工染色体(BAC)载体以形成BoHV-1预载体(pre-vector)BAC构建体；

[0026] (ii)经由诱导型重组系统将编码至少一种抗原的遗传物质插入所述BoHV-1预载体BAC构建体中以产生重组BoHV-1-BAC(rBoHV-1-BAC)载体；

[0027] (iii)在细菌宿主中转化或扩增所述rBoHV-1-BAC载体；以及

[0028] (iv)从所述细菌宿主中纯化并分离所述rBoHV-1-BAC载体并且将所述载体配制成疫苗组合物。

[0029] 还提供了针对牛呼吸道疾病综合症(BRDC)对牛接种疫苗的方法，所述方法包括对牛施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0030] 本公开内容包括来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组在制造对牛接种疫苗的针对牛病原体之药物中的用途，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0031] 本文的方法能够制备针对来自牛病原体的至少一种抗原的疫苗，所述方法包括：

[0032] (i)将来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组并入细菌人工染色体(BAC)载体以形成BoHV-1预载体BAC构建体；

[0033] (ii)经由诱导型重组系统将编码至少一种抗原的遗传物质插入所述BoHV-1预载体BAC构建体中以产生重组BoHV-1-BAC(rBoHV-1-BAC)载体；

[0034] (iii)在细菌宿主中转化或扩增所述rBoHV-1-BAC载体；以及

[0035] (iv)从所述细菌宿主中纯化并分离所述rBoHV-1-BAC载体并且将所述载体配制成疫苗组合物。

[0036] BoHV-1基因组来自低毒力BoHV-1，当其表达时产生能够对其产生免疫应答的抗原，所述BoHV-1基因组还包含与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种其他抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达并且其中异源抗原诱导免疫应答。

[0037] 因此，本文教导的是包含来自低毒力BoHV-1之BoHV-1基因组的疫苗载体，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0038] 本文能够实现多价疫苗，其包含：

[0039] (1)包含来自低毒力BoHV-1之BoHV-1基因组的第一价；以及

[0040] (2)包含编码至少一种抗原的遗传物质的第二价，其与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达；

[0041] 其中所述第一价和第二价产生两个或更多个在牛宿主中对其产生免疫响应的抗原。

[0042] 本文的BoHV-1疫苗载体还包含来源于BoHV-1菌株V155的BoHV-1基因组，其具有来自牛病原体的编码至少一种抗原的异源遗传物质，所述遗传物质在BoHV-1基因组上插入的位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的核苷酸16600至16700；22400至22500；40700至40800；58000至59000；67000至68000；74000至76000；84000至85000；90000至91000以及96000至97000或其他BoHV-1中的功能等效位点。例如，参考表2。

[0043] 还教导了药物组合物、治疗和疫苗接种方案，本公开内容为用于管理受限或成群牛科动物的商业方法。

[0044] 表2提供了在会聚基因之间插入BoHV-1基因组的位点总览。序列坐标是指存入GenBank登记号AJ004801的BoHV-1参考序列。

[0045] 表1

[0046] 序列标识符总览

[0047]序列ID NO： 描述
1 Tkleft 5′引物的核苷酸序列
2 Tkleft 3′引物的核苷酸序列
3 Tkright 5′引物的核苷酸序列
4 Tkright 3′引物的核苷酸序列
5 ChloramF引物的核苷酸序列
6 ChloramR引物的核苷酸序列
7 gE-KanF引物的核苷酸序列
8 gE-KanR引物的核苷酸序列
9 BHV1.3引物的核苷酸序列
10 BHV1.6引物的核苷酸序列
11 KanR fwd引物的核苷酸序列
12 KanR rev引物的核苷酸序列

[0048] 表2

[0049] 1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组的整合基因之间插入位点1的列表

[0050]插入位点 起始 结束 注释
插入位点1 16600 16612 整合基因UL46&UL44
插入位点2 22449 22493 整合基因UL41&UL40
插入位点3 40734 40768 整合基因UL36&UL35
插入位点4 58229 58563 整合基因UL27&UL26
插入位点5 67037 67091 整合基因UL22&UL21
插入位点6 74994 75041 整合基因UL19&UL15
插入位点7 84496 84528 整合基因UL11&UL10
插入位点8 90732 90760 整合基因UL8&UL7
插入位点9 96870 96882 整合基因UL4&UL3.6

[0051] 1序列坐标是指具有GenBank登记号AJ004801的BoHV-1参考序列或其等效物附图说明

[0052] 图1A至图1C图示了感染后24小时时，被亲本1型牛疱疹病毒或携带来自牛病毒性腹泻病毒之糖蛋白E2的重组牛疱疹病毒感染的多种来源于哺乳动物的细胞系的病毒产量的比较。(A)灵长类来源的细胞；(B)牛来源的细胞；(C)兔和小反刍动物来源的细胞。通过实时PCR扩增来测定病毒的产量(进行三次)。

[0053] 发明详述

[0054] 贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则应理解词语“包含”或其变化形式例如“包括”或“含有”意味着包含所述要素或整数或方法步骤或者要素或整数或方法步骤的组，而不排除任何要素或整数或方法步骤或者要素或整数或方法步骤的组。

[0055] 本说明书中使用的无数量词修饰的名词包括复数方面，除非上下文中明显另有说明。因此，例如，提及“病毒”包括一种病毒以及两种或更多种病毒；提及“抗原”包括一种抗原以及两种或更多种抗原；提及“公开内容”包括本文所教导的一个或多个方面。

[0056] 本公开内容教导了来自病毒低毒力毒株的BoHV-1形式的重组疫苗载体。在一个实施方案中，所述低毒力毒株是指BoHV-1V155(Snowden(1964)Australian Veterinary Journal 40:277-288)。将所述重组疫苗载体用作载剂(vehicle)来表达与来自牛病原体的BoHV-1异源的蛋白质，对该蛋白质寻求免疫应答。BoHV-1载体本身的基因组部分也可表达诱导抗BoHV-1免疫应答的蛋白质。在一个实施方案中，牛科动物的免疫应答被认为是保护性免疫应答，原因是该免疫应答靶向蛋白质或通过病原体产生，并且这有利于降低疾病的感染、定植(colonization)和/或症状和/或病原体的传播和/或感染的结果，例如发病率或死亡率。所述免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。

[0057] 在一个实施方案中，对BoHV-1载体进行遗传操作以将来自牛病原体的基因插入BoHV-1基因组上的会聚基因之间。在一个实施方案中，所述插入基本不使BoHV-1的两个侧翼基因或BoHV-1基因组中的任何其他基因的表达下调。在牛科动物的细胞感染重组疫苗载体之后，病原体基因进行表达从而形成蛋白质抗原并且引发针对一种或更多种病原体抗原的免疫应答。如上所述，BoHV-1载体本身为针对BoHV-1的免疫刺激提供了靶标。因此，本公开内容教导了双重疫苗方法的实现，所述方法基于刺激针对BoHV-1的免疫应答和针对被遗传改造为由BoHV-1疫苗载体表达之异源蛋白的免疫应答。

[0058] 因此，本文的疫苗能够针对来自牛病原体的至少一种抗原，所述疫苗包含来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0059] 该疫苗能够表达异源抗原以促进针对该抗原免疫应答的刺激。此外，BoHV-1载体本身可促进对BoHV-1蛋白质的免疫应答。使用低毒力BoHV-1而非灭活毒株或减毒毒株改进了其感染、复制和产生非病原感染的能力以及针对BoHV-1和任意异源抗原的有效免疫应答。

[0060] 本文教导了针对来自牛病原体的两种或更多种抗原的多价疫苗，所述疫苗包含来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，当其表达时产生对其产生免疫应答的抗原，所述BoHV-1基因组还包含与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达并且其中所述异源抗原诱导免疫应答。

[0061] 术语“多价”和“多个价”可交替使用以描述本文的该方面。

[0062] 本文所教导的疫苗也被视为疫苗载体。

[0063] 因此，本文的另一个方面是疫苗载体，其包含来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0064] 本文的又一个方面是多价疫苗载体，其包含：

[0065] (1)包含来自低毒力BoHV-1之BoHV-1基因组的第一价；以及

[0066] (2)包含编码至少一种抗原的遗传物质的第二价，所述遗传物质与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达；

[0067] 其中所述第一价和第二价产生两种或更多种在牛宿主中对其产生免疫应答的抗原。

[0068] 关于下调的术语“基本”意指表达不下调或表达仅有微小下降。“微小”意指从功能角度来看，表达的任何改变不会不利地影响病毒的功能。

[0069] 如上所述，“免疫应答”可以是体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。

[0070] 本文的疫苗能够治疗或预防在成批或成群牛的疾病中尤为普遍的牛呼吸道疾病综合症(BRDC)。“成批牛(lot cattle)”包括用于喂养、饲育或乳品业目的的受限牛。BRDC是多因素疾病。通常，牛科动物感染有BoHV-1、BVDV、3型牛副流感病毒和/或牛呼吸道合胞体病毒中的一种或更多种。这通常导致第二病毒或微生物感染并且导致例如肺炎的病症。

[0071] 本文所涵盖的微生物病原体包括支原体(Mycoplasma)属、沙门氏菌(Salmonella)属、巴斯德氏菌(Pasteurella)属、曼氏杆菌(Manhiemia)属和嗜血菌(Haemophilus)属，例如牛支原体(Mycoplasma bovis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏菌(Manhiemia haemolytica)和睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)。可将来自任意或所有这些或其他细菌之编码抗原的遗传物质用在BoHV-1疫苗载体中。BVDV抗原包括糖蛋白E0和E2。

[0072] 因此，本公开内容涉及针对来自牛病原体的至少一种抗原对牛科动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括向牛科动物施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0073] 本公开内容教导了用于针对BRDC对牛接种疫苗的方法，所述方法包括向牛施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0074] 对BoHV-1疫苗载体遗传操作以插入异源核酸物质一般通过诱导型重组系统进行。在一个实施方案中，诱导型重组系统是GET重组，其利用recE和recT的瞬时表达而能够在大肠杆菌(Escherichia coli)中同源重组(参见Orford等.Nucleic Acids Research 28(18):e84；Mahoney等.(2002)Journal of Virology 76(13):6660-6668；Narayanan等.(1999)Gene therapy 6:442-447；Schumacher等.(2000)Journal of Virology 74:11088-
11098)。

[0075] 在一个实施方案中，将所述异源遗传物质在以下位点插入两个会聚基因的聚腺苷酸化信号之间，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的16600至16700和22400至22500或其他BoHV-1中的功能等效位点。在一个实施方案中，将所述异源遗传物质插入选自核苷酸16600至16700和22400至22493之间的位点，所述位点基于BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801或其等效物的序列坐标(sequence coordinate)。提及“16600至
16700”包括：16600、16601、16602、16603、16604、16605、16606、16607、16608、16609、16610、
16611、16612、16613、16614、16615、16616、16617、16618、16619、16620、16621、16622、
16623、16624、16625、16626、16627、16628、16629、16630、16631、16632、16633、16634、
16635、16636、16637、16638、16639、16640、16641、16642、16643、16644、16645、16646、
16647、16648、16649、16650、16651、16652、16653、16654、16655、16656、16657、16658、
16659、16660、16661、16662、16663、16664、16665、16667、16668、16669、16670、16671、
16672、16673、16674、16675、16676、16677、16678、16679、16680、16681、16682、16683、
16684、16685、16686、16687、16688、16689、16690、16691、16692、16693、16694、16695、
16696、16697、16698、16699和16700。提及“22400至22500”包括：22400、22401、22402、
22403、22404、22405、22406、22407、22408、22409、22410、22411、22412、22413、22414、
22415、22416、22417、22418、22419、22420、22421、22422、22423、22424、22425、22426、
22427、22428、22429、22430、22431、22432、22433、22434、22435、22436、22437、22438、
22439、22440、22441、22442、22443、22444、22445、22446、22447、22448、22449、22450、
22451、22452、22453、22454、22455、22456、22457、22458、22459、22460、22461、22462、
22463、22464、22465、22466、22467、22468、22469、22470、22471、22472、22473、22474、
22475、22476、22477、22478、22479、22480、22481、22482、22483、22484、22485、22486、
22487、22488、22489、22490、22491、22492、22493、22494、22495、22496、22497、22498、22499和22500。

[0076] 另一些位点包括40700至40800的范围；其涵盖位点：40,700、40,701、40,702、40,703、40,704、40,705、40,706、40,707、40,708、40,709、40,710、40,711、40,712、40,713、40,
714、40,715、40,716、40,717、40,718、40,719、40,720、40,721、40,722、40,723、40,724、40,
725、40,726、40,727、40,728、40,729、40,730、40,731、40,732、40,733、40,734、40,735、40,
736、40,737、40,738、40,739、40,740、40,741、40,742、40,743、40,744、40,745、40,746、40,
747、40,748、40,749、40,750、40,751、40,752、40,753、40,754、40,755、40,756、40,757、40,
758、40,759、40,760、40,761、40,762、40,763、40,764、40,765、40,766、40,767、40,768、40,
769、40,770、40,771、40,772、40,773、40,774、40,775、40,776、40,777、40,778、40,779、40,
780、40,781、40,782、40,783、40,784、40,785、40,786、40,787、40,788、40,789、40,790、40,
791、40,792、40,793、40,794、40,795、40,796、40,797、40,798、40,799、40,800；58,000至
59,000包括：58,001、58,002、58,003、58,004、58,005、58,006、58,007、58,008、58,009、58,
010、58,011、58,012、58,013、58,014、58,015、58,016、58,017、58,018、58,019、58,020、58,
021、58,022、58,023、58,024、58,025、58,026、58,027、58,028、58,029、58,030、58,031、58,
032、58,033、58,034、58,035、58,036、58,037、58,038、58,039、58,040、58,041、58,042、58,
043、58,044、58,045、58,046、58,047、58,048、58,049、58,050、58,051、58,052、58,053、58,
054、58,055、58,056、58,057、58,058、58,059、58,060、58,061、58,062、58,063、58,064、58,
065、58,066、58,067、58,068、58,069、58,070、58,071、58,072、58,073、58,074、58,075、58,
076、58,077、58,078、58,079、58,080、58,081、58,082、58,083、58,084、58,085、58,086、58,
087、58,088、58,089、58,090、58,091、58,092、58,093、58,094、58,095、58,096、58,097、58,
098、58,099、58,100、58,101、58,102、58,103、58,104、58,105、58,106、58,107、58,110、58,
111、58,112、58,113、58,114、58,115、58,116、58,117、58,118、58,119、58,120、58,121、58,
122、58,123、58,124、58,125、58,126、58,127、58,128、58,129、58,130、58,131、58,132、58,
133、58,134、58,135、58,136、58,137、58,138、58,139、58,140、58,141、58,142、58,143、58,
144、58,145、58,146、58,147、58,148、58,149、58,150、58,151、58,152、58,153、58,154、58,
155、58,156、58,157、58,158、58,159、58,160、58,161、58,162、58,163、58,164、58,165、58,
166、58,167、58,168、58,169、58,170、58,171、58,172、58,173、58,174、58,175、58,176、58,
177、58,178、58,179、58,180、58,181、58,182、58,183、58,184、58,185、58,186、58,187、58,
188、58,189、58,190、58,191、58,192、58,193、58,194、58,195、58,196、58,197、58,198、58,
199、58,200、58,201、58,202、58,203、58,204、58,205、58,206、58,207、58,208、58,209、58,
210、58,211、58,212、58,213、58,214、58,215、58,216、58,217、58,218、58,219、58,220、58,
221、58,222、58,223、58,224、58,225、58,226、58,227、58,228、58,229、58,230、58,231、58,
232、58,233、58,234、58,235、58,236、58,237、58,238、58,239、58,240、58,241、58,242、58,
243、58,244、58,245、58,246、58,247、58,248、58,249、58,250、58,251、58,252、58,253、58,
254、58,255、58,256、58,257、58,258、58,259、58,260、58,261、58,262、58,263、58,264、58,
265、58,266、58,267、58,268、58,269、58,270、58,271、58,272、58,273、58,274、58,275、58,
276、58,277、58,278、58,279、58,280、58,281、58,282、58,283、58,284、58,285、58,286、58,
287、58,288、58,289、58,290、58,291、58,292、58,293、58,294、58,295、58,296、58,297、58,
298、58,299、58,300、58,301、58,302、58,303、58,304、58,305、58,306、58,307、58,308、58,
309、58,310、58,311、58,312、58,313、58,314、58,315、58,316、58,317、58,318、58,319、58,
320、58,321、58,322、58,323、58,324、58,325、58,326、58,327、58,328、58,329、58,330、58,
331、58,332、58,333、58,334、58,335、58,336、58,337、58,338、58,339、58,340、58,341、58,
342、58,343、58,344、58,345、58,346、58,347、58,348、58,349、58,350、58,351、58,352、58,
353、58,354、58,355、58,356、58,357、58,358、58,359、58,360、58,361、58,362、58,363、58,
364、58,365、58,366、58,367、58,368、58,369、58,370、58,371、58,372、58,373、58,374、58,
375、58,376、58,377、58,378、58,379、58,380、58,381、58,382、58,383、58,384、58,385、58,
386、58,387、58,388、58,389、58,390、58,391、58,392、58,393、58,394、58,395、58,396、58,
397、58,398、58,399、58,400、58,401、58,402、58,403、58,404、58,405、58,406、58,407、58,
408、58,409、58,410、58、58,411、58,412、58,413、58,414、58,415、58,416、58,417、58,418、
58,419、58,420、58,421、58,422、58,423、58,424、58,425、58,426、58,427、58,428、58,429、
58,430、58,431、58,432、58,433、58,434、58,435、58,436、58,437、58,438、58,439、58,440、
58,441、58,442、58,443、58,444、58,445、58,446、58,447、58,448、58,449、58,450、58,451、
58,452、58,453、58,454、58,455、58,456、58,457、58,458、58,459、58,460、58,461、58,462、
58,463、58,464、58,465、58,466、58,467、58,468、58,469、58,470、58,471、58,472、58,473、
58,474、58,475、58,476、58,477、58,478、58,479、58,480、58,481、58,482、58,483、58,484、
58,485、58,486、58,487、58,488、58,489、58,490、58,491、58,492、58,493、58,494、58,495、
58,496、58,497、58,498、58,499、58,500、58,501、58,502、58,503、58,504、58,505、58,506、
58,507、58,508、58,509、58,510、58,511、58,512、58,513、58,514、58,515、58,516、58,517、
58,518、58,519、58,520、58,521、58,522、58,523、58,524、58,525、58,526、58,527、58,528、
58,529、58,530、58,531、58,532、58,533、58,534、58,535、58,536、58,537、58,538、58,539、
58,540、58,541、58,542、58,543、58,544、58,545、58,546、58,547、58,548、58,549、58,550、
58,551、58,552、58,553、58,554、58,555、58,556、58,557、58,558、58,559、58,560、58,561、
58,562、58,563、58,564、58,565、58,566、58,567、58,568、58,569、58,570、58,571、58,572、
58,573、58,574、58,575、58,576、58,577、58,578、58,579、58,580、58,581、58,582、58,583、
58,584、58,585、58,586、58,587、58,588、58,589、58,590、58,591、58,592、58,593、58,594、
58,595、58,596、58,597、58,598、58,599、58,600、58,601、58,602、58,603、58,604、58,605、
58,606、58,607、58,608、58,609、58,610、58,611、58,612、58,613、58,614、58,615、58,616、
58,617、58,618、58,619、58,620、58,621、58,622、58,623、58,624、58,625、58,626、58,627、
58,628、58,629、58,630、58,631、58,632、58,633、58,634、58,635、58,636、58,637、58,638、
58,639、58,640、58,641、58,642、58,643、58,644、58,645、58,646、58,647、58,648、58,649、
58,650、58,651、58,652、58,653、58,654、58,655、58,656、58,657、58,658、58,659、58,660、
58,661、58,662、58,663、58,664、58,665、58,666、58,667、58,668、58,669、58,670、58,671、
58,672、58,673、58,674、58,675、58,676、58,677、58,678、58,679、58,680、58,681、58,682、
58,683、58,684、58,685、58,686、58,687、58,688、58,689、58,690、58,691、58,692、58,693、
58,694、58,695、58,696、58,697、58,698、58,699、58,700、58,701、58,702、58,703、58,704、
58,705、58,706、58,707、58,708、58,709、58,710、58,711、58,712、58,713、58,714、58,715、
58,716、58,717、58,718、58,719、58,720、58,721、58,722、58,723、58,724、58,725、58,726、
58,727、58,728、58,729、58,730、58,731、58,732、58,733、58,734、58,735、58,736、58,737、
58,738、58,739、58,740、58,741、58,742、58,743、58,744、58,745、58,746、58,747、58,748、
58,749、58,750、58,751、58,752、58,753、58,754、58,755、58,756、58,757、58,758、58,759、
58,760、58,761、58,762、58,763、58,764、58,765、58,766、58,767、58,768、58,769、58,770、
58,771、58,772、58,773、58,774、58,775、58,776、58,777、58,778、58,779、58,780、58,781、
58,782、58,783、58,784、58,785、58,786、58,787、58,788、58,789、58,790、58,791、58,792、
58,793、58,794、58,795、58,796、58,797、58,798、58,799、58,800、58,801、58,802、58,803、
58,804、58,805、58,806、58,807、58,808、58,809、58,810、58,811、58,812、58,813、58,814、
58,815、58,816、58,817、58,818、58,819、58,820、58,821、58,822、58,823、58,824、58,825、
58,826、58,827、58,828、58,829、58,830、58,831、58,832、58,833、58,834、58,835、58,836、
58,837、58,838、58,839、58,840、58,841、58,842、58,843、58,844、58,845、58,846、58,847、
58,848、58,849、58,850、58,851、58,852、58,853、58,854、58,855、58,856、58,857、58,858、
58,859、58,860、58,861、58,862、58,863、58,864、58,865、58,866、58,867、58,868、58,869、
58,870、58,871、58,872、58,873、58,874、58,875、58,876、58,877、58,878、58,879、58,880、
58,881、58,882、58,883、58,884、58,885、58,886、58,887、58,888、58,889、58,890、58,891、
58,892、58,893、58,894、58,895、58,896、58,897、58,898、58,899、58,900、58,901、58,902、
58,903、58,904、58,905、58,906、58,907、58,908、58,909、58,910、58,911、58,912、58,913、
58,914、58,915、58,916、58,917、58,918、58,919、58,920、58,921、58,922、58,923、58,924、
58,925、58,926、58,927、58,928、58,929、58,930、58,931、58,932、58,933、58,934、58,935、
58,936、58,937、58,938、58,939、58,940、58,941、58,942、58,943、58,944、58,945、58,946、
58,947、58,948、58,949、58,950、58,951、58,952、58,953、58,954、58,955、58,956、58,957、
58,958、58,959、58,960、58,961、58,962、58,963、58,964、58,965、58,966、58,967、58,968、
58,969、58,970、58,971、58,972、58,973、58,974、58,975、58,976、58,977、58,978、58,979、
58,980、58,981、58,982、58,983、58,984、58,985、58,986、58,987、58,988、58,989、58,990、
58,991、58,992、58,993、58,994、58,995、58,996、58,997、58,998、58,999或59,000；67,000至68,000包括：67,001、67,002、67,003、67,004、67,005、67,006、67,007、67,008、67,009、
67,010、67,011、67,012、67,013、67,014、67,015、67,016、67,017、67,018、67,019、67,020、
67,021、67,022、67,023、67,024、67,025、67,026、67,027、67,028、67,029、67,030、67,031、
67,032、67,033、67,034、67,035、67,036、67,037、67,038、67,039、67,040、67,041、67,042、
67,043、67,044、67,045、67,046、67,047、67,048、67,049、67,050、67,051、67,052、67,053、
67,054、67,055、67,056、67,057、67,067、67,059、67,060、67,061、67,062、67,063、67,064、
67,065、67,066、67,067、67,068、67,069、67,070、67,071、67,072、67,073、67,074、67,075、
67,076、67,077、67,078、67,079、67,080、67,081、67,082、67,083、67,084、67,085、67,086、
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67,098、67,099、67,100、67,101、67,102、67,103、67,104、67,105、67,106、67,107、67,110、
67,111、67,112、67,113、67,114、67,115、67,116、67,117、67,118、67,119、67,120、67,121、
67,122、67,123、67,124、67,125、67,126、67,127、67,128、67,129、67,130、67,131、67,132、
67,133、67,134、67,135、67,136、67,137、67,138、67,139、67,140、67,141、67,142、67,143、
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67,155、67,156、67,157、67,167、67,159、67,160、67,161、67,162、67,163、67,164、67,165、
67,166、67,167、67,168、67,169、67,170、67,171、67,172、67,173、67,174、67,175、67,176、
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67,188、67,189、67,190、67,191、67,192、67,193、67,194、67,195、67,196、67,197、67,198、
67,199、67,200、67,201、67,202、67,203、67,204、67,205、67,206、67,207、67,208、67,209、
67,210、67,211、67,212、67,213、67,214、67,215、67,216、67,217、67,218、67,219、67,220、
67,221、67,222、67,223、67,224、67,225、67,226、67,227、67,228、67,229、67,230、67,231、
67,232、67,233、67,234、67,235、67,236、67,237、67,238、67,239、67,240、67,241、67,242、
67,243、67,244、67,245、67,246、67,247、67,248、67,249、67,250、67,251、67,252、67,253、
67,254、67,255、67,256、67,257、67,267、67,259、67,260、67,261、67,262、67,263、67,264、
67,265、67,266、67,267、67,268、67,269、67,270、67,271、67,272、67,273、67,274、67,275、
67,276、67,277、67,278、67,279、67,280、67,281、67,282、67,283、67,284、67,285、67,286、
67,287、67,288、67,289、67,290、67,291、67,292、67,293、67,294、67,295、67,296、67,297、
67,298、67,299、67,300、67,301、67,302、67,303、67,304、67,305、67,306、67,307、67,308、
67,309、67,310、67,311、67,312、67,313、67,314、67,315、67,316、67,317、67,318、67,319、
67,320、67,321、67,322、67,323、67,324、67,325、67,326、67,327、67,328、67,329、67,330、
67,331、67,332、67,333、67,334、67,335、67,336、67,337、67,338、67,339、67,340、67,341、
67,342、67,343、67,344、67,345、67,346、67,347、67,348、67,349、67,350、67,351、67,352、
67,353、67,354、67,355、67,356、67,357、67,367、67,359、67,360、67,361、67,362、67,363、
67,364、67,365、67,366、67,367、67,368、67,369、67,370、67,371、67,372、67,373、67,374、
67,375、67,376、67,377、67,378、67,379、67,380、67,381、67,382、67,383、67,384、67,385、
67,386、67,387、67,388、67,389、67,390、67,391、67,392、67,393、67,394、67,395、67,396、
67,397、67,398、67,399、67,400、67,401、67,402、67,403、67,404、67,405、67,406、67,407、
67,408、67,409、67,410、67,411、67,412、67,413、67,414、67,415、67,416、67,417、67,418、
67,419、67,420、67,421、67,422、67,423、67,424、67,425、67,426、67,427、67,428、67,429、
67,430、67,431、67,432、67,433、67,434、67,435、67,436、67,437、67,438、67,439、67,440、
67,441、67,442、67,443、67,444、67,445、67,446、67,447、67,448、67,449、67,450、67,451、
67,452、67,453、67,454、67,455、67,456、67,457、67,467、67,459、67,460、67,461、67,462、
67,463、67,464、67,465、67,466、67,467、67,468、67,469、67,470、67,471、67,472、67,473、
67,474、67,475、67,476、67,477、67,478、67,479、67,480、67,481、67,482、67,483、67,484、
67,485、67,486、67,487、67,488、67,489、67,490、67,491、67,492、67,493、67,494、67,495、
67,496、67,497、67,498、67,499、67,500、67,501、67,502、67,503、67,504、67,505、67,506、
67,507、67,508、67,509、67,510、67,511、67,512、67,513、67,514、67,515、67,516、67,517、
67,518、67,519、67,520、67,521、67,522、67,523、67,524、67,525、67,526、67,527、67,528、
67,529、67,530、67,531、67,532、67,533、67,534、67,535、67,536、67,537、67,538、67,539、
67,540、67,541、67,542、67,543、67,544、67,545、67,546、67,547、67,548、67,549、67,550、
67,551、67,552、67,553、67,554、67,555、67,556、67,557、67,567、67,559、67,560、67,561、
67,562、67,563、67,564、67,565、67,566、67,567、67,568、67,569、67,570、67,571、67,572、
67,573、67,574、67,575、67,576、67,577、67,578、67,579、67,580、67,581、67,582、67,583、
67,584、67,585、67,586、67,587、67,588、67,589、67,590、67,591、67,592、67,593、67,594、
67,595、67,596、67,597、67,598、67,599、67,600、67,601、67,602、67,603、67,604、67,605、
67,606、67,607、67,608、67,609、67,610、67,611、67,612、67,613、67,614、67,615、67,616、
67,617、67,618、67,619、67,620、67,621、67,622、67,623、67,624、67,625、67,626、67,627、
67,628、67,629、67,630、67,631、67,632、67,633、67,634、67,635、67,636、67,637、67,638、
67,639、67,640、67,641、67,642、67,643、67,644、67,645、67,646、67,647、67,648、67,649、
67,650、67,651、67,652、67,653、67,654、67,655、67,656、67,657、67,667、67,659、67,660、
67,661、67,662、67,663、67,664、67,665、67,666、67,667、67,668、67,669、67,670、67,671、
67,672、67,673、67,674、67,675、67,676、67,677、67,678、67,679、67,680、67,681、67,682、
67,683、67,684、67,685、67,686、67,687、67,688、67,689、67,690、67,691、67,692、67,693、
67,694、67,695、67,696、67,697、67,698、67,699、67,700、67,701、67,702、67,703、67,704、
67,705、67,706、67,707、67,708、67,709、67,710、67,711、67,712、67,713、67,714、67,715、
67,716、67,717、67,718、67,719、67,720、67,721、67,722、67,723、67,724、67,725、67,726、
67,727、67,728、67,729、67,730、67,731、67,732、67,733、67,734、67,735、67,736、67,737、
67,738、67,739、67,740、67,741、67,742、67,743、67,744、67,745、67,746、67,747、67,748、
67,749、67,750、67,751、67,752、67,753、67,754、67,755、67,756、67,757、67,767、67,759、
67,760、67,761、67,762、67,763、67,764、67,765、67,766、67,767、67,768、67,769、67,770、
67,771、67,772、67,773、67,774、67,775、67,776、67,777、67,778、67,779、67,780、67,781、
67,782、67,783、67,784、67,785、67,786、67,787、67,788、67,789、67,790、67,791、67,792、
67,793、67,794、67,795、67,796、67,797、67,798、67,799、67,800、67,801、67,802、67,803、
67,804、67,805、67,806、67,807、67,808、67,809、67,810、67,811、67,812、67,813、67,814、
67,815、67,816、67,817、67,818、67,819、67,820、67,821、67,822、67,823、67,824、67,825、
67,826、67,827、67,828、67,829、67,830、67,831、67,832、67,833、67,834、67,835、67,836、
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67,848、67,849、67,850、67,851、67,852、67,853、67,854、67,855、67,856、67,857、67,867、
67,859、67,860、67,861、67,862、67,863、67,864、67,865、67,866、67,867、67,868、67,869、
67,870、67,871、67,872、67,873、67,874、67,875、67,876、67,877、67,878、67,879、67,880、
67,881、67,882、67,883、67,884、67,885、67,886、67,887、67,888、67,889、67,890、67,891、
67,892、67,893、67,894、67,895、67,896、67,897、67,898、67,899、67,900、67,901、67,902、
67,903、67,904、67,905、67,906、67,907、67,908、67,909、67,910、67,911、67,912、67,913、
67,914、67,915、67,916、67,917、67,918、67,919、67,920、67,921、67,922、67,923、67,924、
67,925、67,926、67,927、67,928、67,929、67,930、67,931、67,932、67,933、67,934、67,935、
67,936、67,937、67,938、67,939、67,940、67,941、67,942、67,943、67,944、67,945、67,946、
67,947、67,948、67,949、67,950、67,951、67,952、67,953、67,954、67,955、67,956、67,957、
67,967、67,959、67,960、67,961、67,962、67,963、67,964、67,965、67,966、67,967、67,968、
67,969、67,970、67,971、67,972、67,973、67,974、67,975、67,976、67,977、67,978、67,979、
67,980、67,981、67,982、67,983、67,984、67,985、67,986、67,987、67,988、67,989、67,990、
67,991、67,992、67,993、67,994、67,995、67,996、67,997、67,998、67,999或68,000；74,000至76,000包括：74,001、74,002、74,003、74,004、74,005、74,006、74,007、74,008、74,009、
74,010、74,011、74,012、74,013、74,014、74,015、74,016、74,017、74,018、74,019、74,020、
74,021、74,022、74,023、74,024、74,025、74,026、74,027、74,028、74,029、74,030、74,031、
74,032、74,033、74,034、74,035、74,036、74,037、74,038、74,039、74,040、74,041、74,042、
74,043、74,044、74,045、74,046、74,047、74,048、74,049、74,050、74,051、74,052、74,053、
74,054、74,055、74,056、74,057、74,074、74,059、74,060、74,061、74,062、74,063、74,064、
74,065、74,066、74,074、74,068、74,069、74,070、74,071、74,072、74,073、74,074、74,075、
74,076、74,077、74,078、74,079、74,080、74,081、74,082、74,083、74,084、74,085、74,086、
74,087、74,088、74,089、74,090、74,091、74,092、74,093、74,094、74,095、74,096、74,097、
74,098、74,099、74,100、74,101、74,102、74,103、74,104、74,105、74,106、74,107、74,110、
74,111、74,112、74,113、74,114、74,115、74,116、74,117、74,118、74,119、74,120、74,121、
74,122、74,123、74,124、74,125、74,126、74,127、74,128、74,129、74,130、74,131、74,132、
74,133、74,134、74,135、74,136、74,137、74,138、74,139、74,140、74,141、74,142、74,143、
74,144、74,145、74,146、74,147、74,148、74,149、74,150、74,151、74,152、74,153、74,154、
74,155、74,156、74,157、74,174、74,159、74,160、74,161、74,162、74,163、74,164、74,165、
74,166、74,174、74,168、74,169、74,170、74,171、74,172、74,173、74,174、74,175、74,176、
74,177、74,178、74,179、74,180、74,181、74,182、74,183、74,184、74,185、74,186、74,187、
74,188、74,189、74,190、74,191、74,192、74,193、74,194、74,195、74,196、74,197、74,198、
74,199、74,200、74,201、74,202、74,203、74,204、74,205、74,206、74,207、74,208、74,209、
74,210、74,211、74,212、74,213、74,214、74,215、74,216、74,217、74,218、74,219、74,220、
74,221、74,222、74,223、74,224、74,225、74,226、74,227、74,228、74,229、74,230、74,231、
74,232、74,233、74,234、74,235、74,236、74,237、74,238、74,239、74,240、74,241、74,242、
74,243、74,244、74,245、74,246、74,247、74,248、74,249、74,250、74,251、74,252、74,253、
74,254、74,255、74,256、74,257、74,274、74,259、74,260、74,261、74,262、74,263、74,264、
74,265、74,266、74,274、74,268、74,269、74,270、74,271、74,272、74,273、74,274、74,275、
74,276、74,277、74,278、74,279、74,280、74,281、74,282、74,283、74,284、74,285、74,286、
74,287、74,288、74,289、74,290、74,291、74,292、74,293、74,294、74,295、74,296、74,297、
74,298、74,299、74,300、74,301、74,302、74,303、74,304、74,305、74,306、74,307、74,308、
74,309、74,310、74,311、74,312、74,313、74,314、74,315、74,316、74,317、74,318、74,319、
74,320、74,321、74,322、74,323、74,324、74,325、74,326、74,327、74,328、74,329、74,330、
74,331、74,332、74,333、74,334、74,335、74,336、74,337、74,338、74,339、74,340、74,341、
74,342、74,343、74,344、74,345、74,346、74,347、74,348、74,349、74,350、74,351、74,352、
74,353、74,354、74,355、74,356、74,357、74,374、74,359、74,360、74,361、74,362、74,363、
74,364、74,365、74,366、74,374、74,368、74,369、74,370、74,371、74,372、74,373、74,374、
74,375、74,376、74,377、74,378、74,379、74,380、74,381、74,382、74,383、74,384、74,385、
74,386、74,387、74,388、74,389、74,390、74,391、74,392、74,393、74,394、74,395、74,396、
74,397、74,398、74,399、74,400、74,401、74,402、74,403、74,404、74,405、74,406、74,407、
74,408、74,409、74,410、74,411、74,412、74,413、74,414、74,415、74,416、74,417、74,418、
74,419、74,420、74,421、74,422、74,423、74,424、74,425、74,426、74,427、74,428、74,429、
74,430、74,431、74,432、74,433、74,434、74,435、74,436、74,437、74,438、74,439、74,440、
74,441、74,442、74,443、74,444、74,445、74,446、74,447、74,448、74,449、74,450、74,451、
74,452、74,453、74,454、74,455、74,456、74,457、74,474、74,459、74,460、74,461、74,462、
74,463、74,464、74,465、74,466、74,474、74,468、74,469、74,470、74,471、74,472、74,473、
74,474、74,475、74,476、74,477、74,478、74,479、74,480、74,481、74,482、74,483、74,484、
74,485、74,486、74,487、74,488、74,489、74,490、74,491、74,492、74,493、74,494、74,495、
74,496、74,497、74,498、74,499、74,500、74,501、74,502、74,503、74,504、74,505、74,506、
74,507、74,508、74,509、74,510、74,511、74,512、74,513、74,514、74,515、74,516、74,517、
74,518、74,519、74,520、74,521、74,522、74,523、74,524、74,525、74,526、74,527、74,528、
74,529、74,530、74,531、74,532、74,533、74,534、74,535、74,536、74,537、74,538、74,539、
74,540、74,541、74,542、74,543、74,544、74,545、74,546、74,547、74,548、74,549、74,550、
74,551、74,552、74,553、74,554、74,555、74,556、74,557、74,574、74,559、74,560、74,561、
74,562、74,563、74,564、74,565、74,566、74,574、74,568、74,569、74,570、74,571、74,572、
74,573、74,574、74,575、74,576、74,577、74,578、74,579、74,580、74,581、74,582、74,583、
74,584、74,585、74,586、74,587、74,588、74,589、74,590、74,591、74,592、74,593、74,594、
74,595、74,596、74,597、74,598、74,599、74,600、74,601、74,602、74,603、74,604、74,605、
74,606、74,607、74,608、74,609、74,610、74,611、74,612、74,613、74,614、74,615、74,616、
74,617、74,618、74,619、74,620、74,621、74,622、74,623、74,624、74,625、74,626、74,627、
74,628、74,629、74,630、74,631、74,632、74,633、74,634、74,635、74,636、74,637、74,638、
74,639、74,640、74,641、74,642、74,643、74,644、74,645、74,646、74,647、74,648、74,649、
74,650、74,651、74,652、74,653、74,654、74,655、74,656、74,657、74,674、74,659、74,660、
74,661、74,662、74,663、74,664、74,665、74,666、74,674、74,668、74,669、74,670、74,671、
74,672、74,673、74,674、74,675、74,676、74,677、74,678、74,679、74,680、74,681、74,682、
74,683、74,684、74,685、74,686、74,687、74,688、74,689、74,690、74,691、74,692、74,693、
74,694、74,695、74,696、74,697、74,698、74,699、74,700、74,701、74,702、74,703、74,704、
74,705、74,706、74,707、74,708、74,709、74,710、74,711、74,712、74,713、74,714、74,715、
74,716、74,717、74,718、74,719、74,720、74,721、74,722、74,723、74,724、74,725、74,726、
74,727、74,728、74,729、74,730、74,731、74,732、74,733、74,734、74,735、74,736、74,737、
74,738、74,739、74,740、74,741、74,742、74,743、74,744、74,745、74,746、74,747、74,748、
74,749、74,750、74,751、74,752、74,753、74,754、74,755、74,756、74,757、74,774、74,759、
74,760、74,761、74,762、74,763、74,764、74,765、74,766、74,774、74,768、74,769、74,770、
74,771、74,772、74,773、74,774、74,775、74,776、74,777、74,778、74,779、74,780、74,781、
74,782、74,783、74,784、74,785、74,786、74,787、74,788、74,789、74,790、74,791、74,792、
74,793、74,794、74,795、74,796、74,797、74,798、74,799、74,800、74,801、74,802、74,803、
74,804、74,805、74,806、74,807、74,808、74,809、74,810、74,811、74,812、74,813、74,814、
74,815、74,816、74,817、74,818、74,819、74,820、74,821、74,822、74,823、74,824、74,825、
74,826、74,827、74,828、74,829、74,830、74,831、74,832、74,833、74,834、74,835、74,836、
74,837、74,838、74,839、74,840、74,841、74,842、74,843、74,844、74,845、74,846、74,847、
74,848、74,849、74,850、74,851、74,852、74,853、74,854、74,855、74,856、74,857、74,874、
74,859、74,860、74,861、74,862、74,863、74,864、74,865、74,866、74,874、74,868、74,869、
74,870、74,871、74,872、74,873、74,874、74,875、74,876、74,877、74,878、74,879、74,880、
74,881、74,882、74,883、74,884、74,885、74,886、74,887、74,888、74,889、74,890、74,891、
74,892、74,893、74,894、74,895、74,896、74,897、74,898、74,899、74,900、74,901、74,902、
74,903、74,904、74,905、74,906、74,907、74,908、74,909、74,910、74,911、74,912、74,913、
74,914、74,915、74,916、74,917、74,918、74,919、74,920、74,921、74,922、74,923、74,924、
74,925、74,926、74,927、74,928、74,929、74,930、74,931、74,932、74,933、74,934、74,935、
74,936、74,937、74,938、74,939、74,940、74,941、74,942、74,943、74,944、74,945、74,946、
74,947、74,948、74,949、74,950、74,951、74,952、74,953、74,954、74,955、74,956、74,957、
74,974、74,959、74,960、74,961、74,962、74,963、74,964、74,965、74,966、74,974、74,968、
74,969、74,970、74,971、74,972、74,973、74,974、74,975、74,976、74,977、74,978、74,979、
74,980、74,981、74,982、74,983、74,984、74,985、74,986、74,987、74,988、74,989、74,990、
74,991、74,992、74,993、74,994、74,995、74,996、74,997、74,998、74,999、75,000、75,001、
75,002、75,003、75,004、75,005、75,006、75,007、75,008、75,009、75,010、75,011、75,012、
75,013、75,014、75,015、75,016、75,017、75,018、75,019、75,020、75,021、75,022、75,023、
75,024、75,025、75,026、75,027、75,028、75,029、75,030、75,031、75,032、75,033、75,034、
75,035、75,036、75,037、75,038、75,039、75,040、75,041、75,042、75,043、75,044、75,045、
75,046、75,047、75,048、75,049、75,050、75,051、75,052、75,053、75,054、75,055、75,056、
75,057、75,075、75,059、75,060、75,061、75,062、75,063、75,064、75,065、75,066、75,075、
75,068、75,069、75,070、75,071、75,072、75,073、75,075、75,075、75,076、75,077、75,078、
75,079、75,080、75,081、75,082、75,083、75,084、75,085、75,086、75,087、75,088、75,089、
75,090、75,091、75,092、75,093、75,094、75,095、75,096、75,097、75,098、75,099、75,100、
75,101、75,102、75,103、75,104、75,105、75,106、75,107、75,110、75,111、75,112、75,113、
75,114、75,115、75,116、75,117、75,118、75,119、75,120、75,121、75,122、75,123、75,124、
75,125、75,126、75,127、75,128、75,129、75,130、75,131、75,132、75,133、75,134、75,135、
75,136、75,137、75,138、75,139、75,140、75,141、75,142、75,143、75,144、75,145、75,146、
75,147、75,148、75,149、75,150、75,151、75,152、75,153、75,154、75,155、75,156、75,157、
75,175、75,159、75,160、75,161、75,162、75,163、75,164、75,165、75,166、75,175、75,168、
75,169、75,170、75,171、75,172、75,173、75,175、75,175、75,176、75,177、75,178、75,179、
75,180、75,181、75,182、75,183、75,184、75,185、75,186、75,187、75,188、75,189、75,190、
75,191、75,192、75,193、75,194、75,195、75,196、75,197、75,198、75,199、75,200、75,201、
75,202、75,203、75,204、75,205、75,206、75,207、75,208、75,209、75,210、75,211、75,212、
75,213、75,214、75,215、75,216、75,217、75,218、75,219、75,220、75,221、75,222、75,223、
75,224、75,225、75,226、75,227、75,228、75,229、75,230、75,231、75,232、75,233、75,234、
75,235、75,236、75,237、75,238、75,239、75,240、75,241、75,242、75,243、75,244、75,245、
75,246、75,247、75,248、75,249、75,250、75,251、75,252、75,253、75,254、75,255、75,256、
75,257、75,275、75,259、75,260、75,261、75,262、75,263、75,264、75,265、75,266、75,275、
75,268、75,269、75,270、75,271、75,272、75,273、75,275、75,275、75,276、75,277、75,278、
75,279、75,280、75,281、75,282、75,283、75,284、75,285、75,286、75,287、75,288、75,289、
75,290、75,291、75,292、75,293、75,294、75,295、75,296、75,297、75,298、75,299、75,300、
75,301、75,302、75,303、75,304、75,305、75,306、75,307、75,308、75,309、75,310、75,311、
75,312、75,313、75,314、75,315、75,316、75,317、75,318、75,319、75,320、75,321、75,322、
75,323、75,324、75,325、75,326、75,327、75,328、75,329、75,330、75,331、75,332、75,333、
75,334、75,335、75,336、75,337、75,338、75,339、75,340、75,341、75,342、75,343、75,344、
75,345、75,346、75,347、75,348、75,349、75,350、75,351、75,352、75,353、75,354、75,355、
75,356、75,357、75,375、75,359、75,360、75,361、75,362、75,363、75,364、75,365、75,366、
75,375、75,368、75,369、75,370、75,371、75,372、75,373、75,375、75,375、75,376、75,377、
75,378、75,379、75,380、75,381、75,382、75,383、75,384、75,385、75,386、75,387、75,388、
75,389、75,390、75,391、75,392、75,393、75,394、75,395、75,396、75,397、75,398、75,399、
75,400、75,401、75,402、75,403、75,404、75,405、75,406、75,407、75,408、75,409、75,410、
75,411、75,412、75,413、75,414、75,415、75,416、75,417、75,418、75,419、75,420、75,421、
75,422、75,423、75,424、75,425、75,426、75,427、75,428、75,429、75,430、75,431、75,432、
75,433、75,434、75,435、75,436、75,437、75,438、75,439、75,440、75,441、75,442、75,443、
75,444、75,445、75,446、75,447、75,448、75,449、75,450、75,451、75,452、75,453、75,454、
75,455、75,456、75,457、75,475、75,459、75,460、75,461、75,462、75,463、75,464、75,465、
75,466、75,475、75,468、75,469、75,470、75,471、75,472、75,473、75,475、75,475、75,476、
75,477、75,478、75,479、75,480、75,481、75,482、75,483、75,484、75,485、75,486、75,487、
75,488、75,489、75,490、75,491、75,492、75,493、75,494、75,495、75,496、75,497、75,498、
75,499、75,500、75,501、75,502、75,503、75,504、75,505、75,506、75,507、75,508、75,509、
75,510、75,511、75,512、75,513、75,514、75,515、75,516、75,517、75,518、75,519、75,520、
75,521、75,522、75,523、75,524、75,525、75,526、75,527、75,528、75,529、75,530、75,531、
75,532、75,533、75,534、75,535、75,536、75,537、75,538、75,539、75,540、75,541、75,542、
75,543、75,544、75,545、75,546、75,547、75,548、75,549、75,550、75,551、75,552、75,553、
75,554、75,555、75,556、75,557、75,575、75,559、75,560、75,561、75,562、75,563、75,564、
75,565、75,566、75,575、75,568、75,569、75,570、75,571、75,572、75,573、75,575、75,575、
75,576、75,577、75,578、75,579、75,580、75,581、75,582、75,583、75,584、75,585、75,586、
75,587、75,588、75,589、75,590、75,591、75,592、75,593、75,594、75,595、75,596、75,597、
75,598、75,599、75,600、75,601、75,602、75,603、75,604、75,605、75,606、75,607、75,608、
75,609、75,610、75,611、75,612、75,613、75,614、75,615、75,616、75,617、75,618、75,619、
75,620、75,621、75,622、75,623、75,624、75,625、75,626、75,627、75,628、75,629、75,630、
75,631、75,632、75,633、75,634、75,635、75,636、75,637、75,638、75,639、75,640、75,641、
75,642、75,643、75,644、75,645、75,646、75,647、75,648、75,649、75,650、75,651、75,652、
75,653、75,654、75,655、75,656、75,657、75,675、75,659、75,660、75,661、75,662、75,663、
75,664、75,665、75,666、75,675、75,668、75,669、75,670、75,671、75,672、75,673、75,675、
75,675、75,676、75,677、75,678、75,679、75,680、75,681、75,682、75,683、75,684、75,685、
75,686、75,687、75,688、75,689、75,690、75,691、75,692、75,693、75,694、75,695、75,696、
75,697、75,698、75,699、75,700、75,701、75,702、75,703、75,704、75,705、75,706、75,707、
75,708、75,709、75,710、75,711、75,712、75,713、75,714、75,715、75,716、75,717、75,718、
75,719、75,720、75,721、75,722、75,723、75,724、75,725、75,726、75,727、75,728、75,729、
75,730、75,731、75,732、75,733、75,734、75,735、75,736、75,737、75,738、75,739、75,740、
75,741、75,742、75,743、75,744、75,745、75,746、75,747、75,748、75,749、75,750、75,751、
75,752、75,753、75,754、75,755、75,756、75,757、75,775、75,759、75,760、75,761、75,762、
75,763、75,764、75,765、75,766、75,775、75,768、75,769、75,770、75,771、75,772、75,773、
75,775、75,775、75,776、75,777、75,778、75,779、75,780、75,781、75,782、75,783、75,784、
75,785、75,786、75,787、75,788、75,789、75,790、75,791、75,792、75,793、75,794、75,795、
75,796、75,797、75,798、75,799、75,800、75,801、75,802、75,803、75,804、75,805、75,806、
75,807、75,808、75,809、75,810、75,811、75,812、75,813、75,814、75,815、75,816、75,817、
75,818、75,819、75,820、75,821、75,822、75,823、75,824、75,825、75,826、75,827、75,828、
75,829、75,830、75,831、75,832、75,833、75,834、75,835、75,836、75,837、75,838、75,839、
75,840、75,841、75,842、75,843、75,844、75,845、75,846、75,847、75,848、75,849、75,850、
75,851、75,852、75,853、75,854、75,855、75,856、75,857、75,875、75,859、75,860、75,861、
75,862、75,863、75,864、75,865、75,866、75,875、75,868、75,869、75,870、75,871、75,872、
75,873、75,875、75,875、75,876、75,877、75,878、75,879、75,880、75,881、75,882、75,883、
75,884、75,885、75,886、75,887、75,888、75,889、75,890、75,891、75,892、75,893、75,894、
75,895、75,896、75,897、75,898、75,899、75,900、75,901、75,902、75,903、75,904、75,905、
75,906、75,907、75,908、75,909、75,910、75,911、75,912、75,913、75,914、75,915、75,916、
75,917、75,918、75,919、75,920、75,921、75,922、75,923、75,924、75,925、75,926、75,927、
75,928、75,929、75,930、75,931、75,932、75,933、75,934、75,935、75,936、75,937、75,938、
75,939、75,940、75,941、75,942、75,943、75,944、75,945、75,946、75,947、75,948、75,949、
75,950、75,951、75,952、75,953、75,954、75,955、75,956、75,957、75,975、75,959、75,960、
75,961、75,962、75,963、75,964、75,965、75,966、75,975、75,968、75,969、75,970、75,971、
75,972、75,973、75,975、75,975、75,976、75,977、75,978、75,979、75,980、75,981、75,982、
75,983、75,984、75,985、75,986、75,987、75,988、75,989、75,990、75,991、75,992、75,993、
75,994、75,995、75,996、75,997、75,998、75,999或76,000；84,000至85,000包括：84,001、
84,002、84,003、84,004、84,005、84,006、84,007、84,008、84,009、84,010、84,011、84,012、
84,013、84,014、84,015、84,016、84,017、84,018、84,019、84,020、84,021、84,022、84,023、
84,024、84,025、84,026、84,027、84,028、84,029、84,030、84,031、84,032、84,033、84,034、
84,035、84,036、84,037、84,038、84,039、84,040、84,041、84,042、84,043、84,044、84,045、
84,046、84,047、84,048、84,049、84,050、84,051、84,052、84,053、84,054、84,055、84,056、
84,057、84,084、84,059、84,060、84,061、84,062、84,063、84,064、84,065、84,066、84,084、
84,068、84,069、84,070、84,071、84,072、84,073、84,084、84,084、84,076、84,077、84,078、
84,079、84,080、84,081、84,082、84,083、84,084、84,085、84,086、84,087、84,088、84,089、
84,090、84,091、84,092、84,093、84,094、84,095、84,096、84,097、84,098、84,099、84,100、
84,101、84,102、84,103、84,104、84,105、84,106、84,107、84,110、84,111、84,112、84,113、
84,114、84,115、84,116、84,117、84,118、84,119、84,120、84,121、84,122、84,123、84,124、
84,125、84,126、84,127、84,128、84,129、84,130、84,131、84,132、84,133、84,134、84,135、
84,136、84,137、84,138、84,139、84,140、84,141、84,142、84,143、84,144、84,145、84,146、
84,147、84,148、84,149、84,150、84,151、84,152、84,153、84,154、84,155、84,156、84,157、
84,184、84,159、84,160、84,161、84,162、84,163、84,164、84,165、84,166、84,184、84,168、
84,169、84,170、84,171、84,172、84,173、84,184、84,184、84,176、84,177、84,178、84,179、
84,180、84,181、84,182、84,183、84,184、84,185、84,186、84,187、84,188、84,189、84,190、
84,191、84,192、84,193、84,194、84,195、84,196、84,197、84,198、84,199、84,200、84,201、
84,202、84,203、84,204、84,205、84,206、84,207、84,208、84,209、84,210、84,211、84,212、
84,213、84,214、84,215、84,216、84,217、84,218、84,219、84,220、84,221、84,222、84,223、
84,224、84,225、84,226、84,227、84,228、84,229、84,230、84,231、84,232、84,233、84,234、
84,235、84,236、84,237、84,238、84,239、84,240、84,241、84,242、84,243、84,244、84,245、
84,246、84,247、84,248、84,249、84,250、84,251、84,252、84,253、84,254、84,255、84,256、
84,257、84,284、84,259、84,260、84,261、84,262、84,263、84,264、84,265、84,266、84,284、
84,268、84,269、84,270、84,271、84,272、84,273、84,284、84,284、84,276、84,277、84,278、
84,279、84,280、84,281、84,282、84,283、84,284、84,285、84,286、84,287、84,288、84,289、
84,290、84,291、84,292、84,293、84,294、84,295、84,296、84,297、84,298、84,299、84,300、
84,301、84,302、84,303、84,304、84,305、84,306、84,307、84,308、84,309、84,310、84,311、
84,312、84,313、84,314、84,315、84,316、84,317、84,318、84,319、84,320、84,321、84,322、
84,323、84,324、84,325、84,326、84,327、84,328、84,329、84,330、84,331、84,332、84,333、
84,334、84,335、84,336、84,337、84,338、84,339、84,340、84,341、84,342、84,343、84,344、
84,345、84,346、84,347、84,348、84,349、84,350、84,351、84,352、84,353、84,354、84,355、
84,356、84,357、84,384、84,359、84,360、84,361、84,362、84,363、84,364、84,365、84,366、
84,384、84,368、84,369、84,370、84,371、84,372、84,373、84,384、84,384、84,376、84,377、
84,378、84,379、84,380、84,381、84,382、84,383、84,384、84,385、84,386、84,387、84,388、
84,389、84,390、84,391、84,392、84,393、84,394、84,395、84,396、84,397、84,398、84,399、
84,400、84,401、84,402、84,403、84,404、84,405、84,406、84,407、84,408、84,409、84,410、
84,411、84,412、84,413、84,414、84,415、84,416、84,417、84,418、84,419、84,420、84,421、
84,422、84,423、84,424、84,425、84,426、84,427、84,428、84,429、84,430、84,431、84,432、
84,433、84,434、84,435、84,436、84,437、84,438、84,439、84,440、84,441、84,442、84,443、
84,444、84,445、84,446、84,447、84,448、84,449、84,450、84,451、84,452、84,453、84,454、
84,455、84,456、84,457、84,484、84,459、84,460、84,461、84,462、84,463、84,464、84,465、
84,466、84,484、84,468、84,469、84,470、84,471、84,472、84,473、84,484、84,484、84,476、
84,477、84,478、84,479、84,480、84,481、84,482、84,483、84,484、84,485、84,486、84,487、
84,488、84,489、84,490、84,491、84,492、84,493、84,494、84,495、84,496、84,497、84,498、
84,499、84,500、84,501、84,502、84,503、84,504、84,505、84,506、84,507、84,508、84,509、
84,510、84,511、84,512、84,513、84,514、84,515、84,516、84,517、84,518、84,519、84,520、
84,521、84,522、84,523、84,524、84,525、84,526、84,527、84,528、84,529、84,530、84,531、
84,532、84,533、84,534、84,535、84,536、84,537、84,538、84,539、84,540、84,541、84,542、
84,543、84,544、84,545、84,546、84,547、84,548、84,549、84,550、84,551、84,552、84,553、
84,554、84,555、84,556、84,557、84,584、84,559、84,560、84,561、84,562、84,563、84,564、
84,565、84,566、84,584、84,568、84,569、84,570、84,571、84,572、84,573、84,584、84,584、
84,576、84,577、84,578、84,579、84,580、84,581、84,582、84,583、84,584、84,585、84,586、
84,587、84,588、84,589、84,590、84,591、84,592、84,593、84,594、84,595、84,596、84,597、
84,598、84,599、84,600、84,601、84,602、84,603、84,604、84,605、84,606、84,607、84,608、
84,609、84,610、84,611、84,612、84,613、84,614、84,615、84,616、84,617、84,618、84,619、
84,620、84,621、84,622、84,623、84,624、84,625、84,626、84,627、84,628、84,629、84,630、
84,631、84,632、84,633、84,634、84,635、84,636、84,637、84,638、84,639、84,640、84,641、
84,642、84,643、84,644、84,645、84,646、84,647、84,648、84,649、84,650、84,651、84,652、
84,653、84,654、84,655、84,656、84,657、84,684、84,659、84,660、84,661、84,662、84,663、
84,664、84,665、84,666、84,684、84,668、84,669、84,670、84,671、84,672、84,673、84,684、
84,684、84,676、84,677、84,678、84,679、84,680、84,681、84,682、84,683、84,684、84,685、
84,686、84,687、84,688、84,689、84,690、84,691、84,692、84,693、84,694、84,695、84,696、
84,697、84,698、84,699、84,700、84,701、84,702、84,703、84,704、84,705、84,706、84,707、
84,708、84,709、84,710、84,711、84,712、84,713、84,714、84,715、84,716、84,717、84,718、
84,719、84,720、84,721、84,722、84,723、84,724、84,725、84,726、84,727、84,728、84,729、
84,730、84,731、84,732、84,733、84,734、84,735、84,736、84,737、84,738、84,739、84,740、
84,741、84,742、84,743、84,744、84,745、84,746、84,747、84,748、84,749、84,750、84,751、
84,752、84,753、84,754、84,755、84,756、84,757、84,784、84,759、84,760、84,761、84,762、
84,763、84,764、84,765、84,766、84,784、84,768、84,769、84,770、84,771、84,772、84,773、
84,784、84,784、84,776、84,777、84,778、84,779、84,780、84,781、84,782、84,783、84,784、
84,785、84,786、84,787、84,788、84,789、84,790、84,791、84,792、84,793、84,794、84,795、
84,796、84,797、84,798、84,799、84,800、84,801、84,802、84,803、84,804、84,805、84,806、
84,807、84,808、84,809、84,810、84,811、84,812、84,813、84,814、84,815、84,816、84,817、
84,818、84,819、84,820、84,821、84,822、84,823、84,824、84,825、84,826、84,827、84,828、
84,829、84,830、84,831、84,832、84,833、84,834、84,835、84,836、84,837、84,838、84,839、
84,840、84,841、84,842、84,843、84,844、84,845、84,846、84,847、84,848、84,849、84,850、
84,851、84,852、84,853、84,854、84,855、84,856、84,857、84,884、84,859、84,860、84,861、
84,862、84,863、84,864、84,865、84,866、84,884、84,868、84,869、84,870、84,871、84,872、
84,873、84,884、84,884、84,876、84,877、84,878、84,879、84,880、84,881、84,882、84,883、
84,884、84,885、84,886、84,887、84,888、84,889、84,890、84,891、84,892、84,893、84,894、
84,895、84,896、84,897、84,898、84,899、84,900、84,901、84,902、84,903、84,904、84,905、
84,906、84,907、84,908、84,909、84,910、84,911、84,912、84,913、84,914、84,915、84,916、
84,917、84,918、84,919、84,920、84,921、84,922、84,923、84,924、84,925、84,926、84,927、
84,928、84,929、84,930、84,931、84,932、84,933、84,934、84,935、84,936、84,937、84,938、
84,939、84,940、84,941、84,942、84,943、84,944、84,945、84,946、84,947、84,948、84,949、
84,950、84,951、84,952、84,953、84,954、84,955、84,956、84,957、84,984、84,959、84,960、
84,961、84,962、84,963、84,964、84,965、84,966、84,984、84,968、84,969、84,970、84,971、
84,972、84,973、84,984、84,984、84,976、84,977、84,978、84,979、84,980、84,981、84,982、
84,983、84,984、84,985、84,986、84,987、84,988、84,989、84,990、84,991、84,992、84,993、
84,994、84,995、84,996、84,997、84,998、84,999或85,000；90,000至91,000包括：90,001、
90,002、90,003、90,004、90,005、90,006、90,007、90,008、90,009、90,010、90,011、90,012、
90,013、90,014、90,015、90,016、90,017、90,018、90,019、90,020、90,021、90,022、90,023、
90,024、90,025、90,026、90,027、90,028、90,029、90,030、90,031、90,032、90,033、90,034、
90,035、90,036、90,037、90,038、90,039、90,040、90,041、90,042、90,043、90,044、90,045、
90,046、90,047、90,048、90,049、90,050、90,051、90,052、90,053、90,054、90,055、90,056、
90,057、90,090、90,059、90,060、90,061、90,062、90,063、90,064、90,065、90,066、90,090、
90,068、90,069、90,070、90,071、90,072、90,073、90,090、90,090、90,076、90,077、90,078、
90,079、90,080、90,081、90,082、90,083、90,090、90,085、90,086、90,087、90,088、90,089、
90,090、90,091、90,092、90,093、90,094、90,095、90,096、90,097、90,098、90,099、90,100、
90,101、90,102、90,103、90,104、90,105、90,106、90,107、90,110、90,111、90,112、90,113、
90,114、90,115、90,116、90,117、90,118、90,119、90,120、90,121、90,122、90,123、90,124、
90,125、90,126、90,127、90,128、90,129、90,130、90,131、90,132、90,133、90,134、90,135、
90,136、90,137、90,138、90,139、90,140、90,141、90,142、90,143、90,144、90,145、90,146、
90,147、90,148、90,149、90,150、90,151、90,152、90,153、90,154、90,155、90,156、90,157、
90,190、90,159、90,160、90,161、90,162、90,163、90,164、90,165、90,166、90,190、90,168、
90,169、90,170、90,171、90,172、90,173、90,190、90,190、90,176、90,177、90,178、90,179、
90,180、90,181、90,182、90,183、90,190、90,185、90,186、90,187、90,188、90,189、90,190、
90,191、90,192、90,193、90,194、90,195、90,196、90,197、90,198、90,199、90,200、90,201、
90,202、90,203、90,204、90,205、90,206、90,207、90,208、90,209、90,210、90,211、90,212、
90,213、90,214、90,215、90,216、90,217、90,218、90,219、90,220、90,221、90,222、90,223、
90,224、90,225、90,226、90,227、90,228、90,229、90,230、90,231、90,232、90,233、90,234、
90,235、90,236、90,237、90,238、90,239、90,240、90,241、90,242、90,243、90,244、90,245、
90,246、90,247、90,248、90,249、90,250、90,251、90,252、90,253、90,254、90,255、90,256、
90,257、90,290、90,259、90,260、90,261、90,262、90,263、90,264、90,265、90,266、90,290、
90,268、90,269、90,270、90,271、90,272、90,273、90,290、90,290、90,276、90,277、90,278、
90,279、90,280、90,281、90,282、90,283、90,290、90,285、90,286、90,287、90,288、90,289、
90,290、90,291、90,292、90,293、90,294、90,295、90,296、90,297、90,298、90,299、90,300、
90,301、90,302、90,303、90,304、90,305、90,306、90,307、90,308、90,309、90,310、90,311、
90,312、90,313、90,314、90,315、90,316、90,317、90,318、90,319、90,320、90,321、90,322、
90,323、90,324、90,325、90,326、90,327、90,328、90,329、90,330、90,331、90,332、90,333、
90,334、90,335、90,336、90,337、90,338、90,339、90,340、90,341、90,342、90,343、90,344、
90,345、90,346、90,347、90,348、90,349、90,350、90,351、90,352、90,353、90,354、90,355、
90,356、90,357、90,390、90,359、90,360、90,361、90,362、90,363、90,364、90,365、90,366、
90,390、90,368、90,369、90,370、90,371、90,372、90,373、90,390、90,390、90,376、90,377、
90,378、90,379、90,380、90,381、90,382、90,383、90,390、90,385、90,386、90,387、90,388、
90,389、90,390、90,391、90,392、90,393、90,394、90,395、90,396、90,397、90,398、90,399、
90,400、90,401、90,402、90,403、90,404、90,405、90,406、90,407、90,408、90,409、90,410、
90,411、90,412、90,413、90,414、90,415、90,416、90,417、90,418、90,419、90,420、90,421、
90,422、90,423、90,424、90,425、90,426、90,427、90,428、90,429、90,430、90,431、90,432、
90,433、90,434、90,435、90,436、90,437、90,438、90,439、90,440、90,441、90,442、90,443、
90,444、90,445、90,446、90,447、90,448、90,449、90,450、90,451、90,452、90,453、90,454、
90,455、90,456、90,457、90,490、90,459、90,460、90,461、90,462、90,463、90,464、90,465、
90,466、90,490、90,468、90,469、90,470、90,471、90,472、90,473、90,490、90,490、90,476、
90,477、90,478、90,479、90,480、90,481、90,482、90,483、90,490、90,485、90,486、90,487、
90,488、90,489、90,490、90,491、90,492、90,493、90,494、90,495、90,496、90,497、90,498、
90,499、90,500、90,501、90,502、90,503、90,504、90,505、90,506、90,507、90,508、90,509、
90,510、90,511、90,512、90,513、90,514、90,515、90,516、90,517、90,518、90,519、90,520、
90,521、90,522、90,523、90,524、90,525、90,526、90,527、90,528、90,529、90,530、90,531、
90,532、90,533、90,534、90,535、90,536、90,537、90,538、90,539、90,540、90,541、90,542、
90,543、90,544、90,545、90,546、90,547、90,548、90,549、90,550、90,551、90,552、90,553、
90,554、90,555、90,556、90,557、90,590、90,559、90,560、90,561、90,562、90,563、90,564、
90,565、90,566、90,590、90,568、90,569、90,570、90,571、90,572、90,573、90,590、90,590、
90,576、90,577、90,578、90,579、90,580、90,581、90,582、90,583、90,590、90,585、90,586、
90,587、90,588、90,589、90,590、90,591、90,592、90,593、90,594、90,595、90,596、90,597、
90,598、90,599、90,600、90,601、90,602、90,603、90,604、90,605、90,606、90,607、90,608、
90,609、90,610、90,611、90,612、90,613、90,614、90,615、90,616、90,617、90,618、90,619、
90,620、90,621、90,622、90,623、90,624、90,625、90,626、90,627、90,628、90,629、90,630、
90,631、90,632、90,633、90,634、90,635、90,636、90,637、90,638、90,639、90,640、90,641、
90,642、90,643、90,644、90,645、90,646、90,647、90,648、90,649、90,650、90,651、90,652、
90,653、90,654、90,655、90,656、90,657、90,690、90,659、90,660、90,661、90,662、90,663、
90,664、90,665、90,666、90,690、90,668、90,669、90,670、90,671、90,672、90,673、90,690、
90,690、90,676、90,677、90,678、90,679、90,680、90,681、90,682、90,683、90,690、90,685、
90,686、90,687、90,688、90,689、90,690、90,691、90,692、90,693、90,694、90,695、90,696、
90,697、90,698、90,699、90,700、90,701、90,702、90,703、90,704、90,705、90,706、90,707、
90,708、90,709、90,710、90,711、90,712、90,713、90,714、90,715、90,716、90,717、90,718、
90,719、90,720、90,721、90,722、90,723、90,724、90,725、90,726、90,727、90,728、90,729、
90,730、90,731、90,732、90,733、90,734、90,735、90,736、90,737、90,738、90,739、90,740、
90,741、90,742、90,743、90,744、90,745、90,746、90,747、90,748、90,749、90,750、90,751、
90,752、90,753、90,754、90,755、90,756、90,757、90,790、90,759、90,760、90,761、90,762、
90,763、90,764、90,765、90,766、90,790、90,768、90,769、90,770、90,771、90,772、90,773、
90,790、90,790、90,776、90,777、90,778、90,779、90,780、90,781、90,782、90,783、90,790、
90,785、90,786、90,787、90,788、90,789、90,790、90,791、90,792、90,793、90,794、90,795、
90,796、90,797、90,798、90,799、90,800、90,801、90,802、90,803、90,804、90,805、90,806、
90,807、90,808、90,809、90,810、90,811、90,812、90,813、90,814、90,815、90,816、90,817、
90,818、90,819、90,820、90,821、90,822、90,823、90,824、90,825、90,826、90,827、90,828、
90,829、90,830、90,831、90,832、90,833、90,834、90,835、90,836、90,837、90,838、90,839、
90,840、90,841、90,842、90,843、90,844、90,845、90,846、90,847、90,848、90,849、90,850、
90,851、90,852、90,853、90,854、90,855、90,856、90,857、90,890、90,859、90,860、90,861、
90,862、90,863、90,864、90,865、90,866、90,890、90,868、90,869、90,870、90,871、90,872、
90,873、90,890、90,890、90,876、90,877、90,878、90,879、90,880、90,881、90,882、90,883、
90,890、90,885、90,886、90,887、90,888、90,889、90,890、90,891、90,892、90,893、90,894、
90,895、90,896、90,897、90,898、90,899、90,900、90,901、90,902、90,903、90,904、90,905、
90,906、90,907、90,908、90,909、90,910、90,911、90,912、90,913、90,914、90,915、90,916、
90,917、90,918、90,919、90,920、90,921、90,922、90,923、90,924、90,925、90,926、90,927、
90,928、90,929、90,930、90,931、90,932、90,933、90,934、90,935、90,936、90,937、90,938、
90,939、90,940、90,941、90,942、90,943、90,944、90,945、90,946、90,947、90,948、90,949、
90,950、90,951、90,952、90,953、90,954、90,955、90,956、90,957、90,990、90,959、90,960、
90,961、90,962、90,963、90,964、90,965、90,966、90,990、90,968、90,969、90,970、90,971、
90,972、90,973、90,990、90,990、90,976、90,977、90,978、90,979、90,980、90,981、90,982、
90,983、90,990、90,985、90,986、90,987、90,988、90,989、90,990、90,991、90,992、90,993、
90,994、90,995、90,996、90,997、90,998、90,999或91,000；以及96,000至97,000包括：96,
001、96,002、96,003、96,004、96,005、96,006、96,007、96,008、96,009、96,010、96,011、96,
012、96,013、96,014、96,015、96,016、96,017、96,018、96,019、96,020、96,021、96,022、96,
023、96,024、96,025、96,026、96,027、96,028、96,029、96,030、96,031、96,032、96,033、96,
034、96,035、96,036、96,037、96,038、96,039、96,040、96,041、96,042、96,043、96,044、96,
045、96,046、96,047、96,048、96,049、96,050、96,051、96,052、96,053、96,054、96,055、96,
056、96,057、96,096、96,059、96,060、96,061、96,062、96,063、96,064、96,065、96,066、96,
096、96,068、96,069、96,070、96,071、96,072、96,073、96,096、96,096、96,076、96,077、96,
078、96,079、96,080、96,081、96,082、96,083、96,096、96,085、96,086、96,087、96,088、96,
089、96,096、96,091、96,092、96,093、96,094、96,095、96,096、96,097、96,098、96,099、96,
100、96,101、96,102、96,103、96,104、96,105、96,106、96,107、96,110、96,111、96,112、96,
113、96,114、96,115、96,116、96,117、96,118、96,119、96,120、96,121、96,122、96,123、96,
124、96,125、96,126、96,127、96,128、96,129、96,130、96,131、96,132、96,133、96,134、96,
135、96,136、96,137、96,138、96,139、96,140、96,141、96,142、96,143、96,144、96,145、96,
146、96,147、96,148、96,149、96,150、96,151、96,152、96,153、96,154、96,155、96,156、96,
157、96,196、96,159、96,160、96,161、96,162、96,163、96,164、96,165、96,166、96,196、96,
168、96,169、96,170、96,171、96,172、96,173、96,196、96,196、96,176、96,177、96,178、96,
179、96,180、96,181、96,182、96,183、96,196、96,185、96,186、96,187、96,188、96,189、96,
196、96,191、96,192、96,193、96,194、96,195、96,196、96,197、96,198、96,199、96,200、96,
201、96,202、96,203、96,204、96,205、96,206、96,207、96,208、96,209、96,210、96,211、96,
212、96,213、96,214、96,215、96,216、96,217、96,218、96,219、96,220、96,221、96,222、96,
223、96,224、96,225、96,226、96,227、96,228、96,229、96,230、96,231、96,232、96,233、96,
234、96,235、96,236、96,237、96,238、96,239、96,240、96,241、96,242、96,243、96,244、96,
245、96,246、96,247、96,248、96,249、96,250、96,251、96,252、96,253、96,254、96,255、96,
256、96,257、96,296、96,259、96,260、96,261、96,262、96,263、96,264、96,265、96,266、96,
296、96,268、96,269、96,270、96,271、96,272、96,273、96,296、96,296、96,276、96,277、96,
278、96,279、96,280、96,281、96,282、96,283、96,296、96,285、96,286、96,287、96,288、96,
289、96,296、96,291、96,292、96,293、96,294、96,295、96,296、96,297、96,298、96,299、96,
300、96,301、96,302、96,303、96,304、96,305、96,306、96,307、96,308、96,309、96,310、96,
311、96,312、96,313、96,314、96,315、96,316、96,317、96,318、96,319、96,320、96,321、96,
322、96,323、96,324、96,325、96,326、96,327、96,328、96,329、96,330、96,331、96,332、96,
333、96,334、96,335、96,336、96,337、96,338、96,339、96,340、96,341、96,342、96,343、96,
344、96,345、96,346、96,347、96,348、96,349、96,350、96,351、96,352、96,353、96,354、96,
355、96,356、96,357、96,396、96,359、96,360、96,361、96,362、96,363、96,364、96,365、96,
366、96,396、96,368、96,369、96,370、96,371、96,372、96,373、96,396、96,396、96,376、96,
377、96,378、96,379、96,380、96,381、96,382、96,383、96,396、96,385、96,386、96,387、96,
388、96,389、96,396、96,391、96,392、96,393、96,394、96,395、96,396、96,397、96,398、96,
399、96,400、96,401、96,402、96,403、96,404、96,405、96,406、96,407、96,408、96,409、96,
410、96,411、96,412、96,413、96,414、96,415、96,416、96,417、96,418、96,419、96,420、96,
421、96,422、96,423、96,424、96,425、96,426、96,427、96,428、96,429、96,430、96,431、96,
432、96,433、96,434、96,435、96,436、96,437、96,438、96,439、96,440、96,441、96,442、96,
443、96,444、96,445、96,446、96,447、96,448、96,449、96,450、96,451、96,452、96,453、96,
454、96,455、96,456、96,457、96,496、96,459、96,460、96,461、96,462、96,463、96,464、96,
465、96,466、96,496、96,468、96,469、96,470、96,471、96,472、96,473、96,496、96,496、96,
476、96,477、96,478、96,479、96,480、96,481、96,482、96,483、96,496、96,485、96,486、96,
487、96,488、96,489、96,496、96,491、96,492、96,493、96,494、96,495、96,496、96,497、96,
498、96,499、96,500、96,501、96,502、96,503、96,504、96,505、96,506、96,507、96,508、96,
509、96,510、96,511、96,512、96,513、96,514、96,515、96,516、96,517、96,518、96,519、96,
520、96,521、96,522、96,523、96,524、96,525、96,526、96,527、96,528、96,529、96,530、96,
531、96,532、96,533、96,534、96,535、96,536、96,537、96,538、96,539、96,540、96,541、96,
542、96,543、96,544、96,545、96,546、96,547、96,548、96,549、96,550、96,551、96,552、96,
553、96,554、96,555、96,556、96,557、96,596、96,559、96,560、96,561、96,562、96,563、96,
564、96,565、96,566、96,596、96,568、96,569、96,570、96,571、96,572、96,573、96,596、96,
596、96,576、96,577、96,578、96,579、96,580、96,581、96,582、96,583、96,596、96,585、96,
586、96,587、96,588、96,589、96,596、96,591、96,592、96,593、96,594、96,595、96,596、96,
597、96,598、96,599、96,600、96,601、96,602、96,603、96,604、96,605、96,606、96,607、96,
608、96,609、96,610、96,611、96,612、96,613、96,614、96,615、96,616、96,617、96,618、96,
619、96,620、96,621、96,622、96,623、96,624、96,625、96,626、96,627、96,628、96,629、96,
630、96,631、96,632、96,633、96,634、96,635、96,636、96,637、96,638、96,639、96,640、96,
641、96,642、96,643、96,644、96,645、96,646、96,647、96,648、96,649、96,650、96,651、96,
652、96,653、96,654、96,655、96,656、96,657、96,696、96,659、96,660、96,661、96,662、96,
663、96,664、96,665、96,666、96,696、96,668、96,669、96,670、96,671、96,672、96,673、96,
696、96,696、96,676、96,677、96,678、96,679、96,680、96,681、96,682、96,683、96,696、96,
685、96,686、96,687、96,688、96,689、96,696、96,691、96,692、96,693、96,694、96,695、96,
696、96,697、96,698、96,699、96,700、96,701、96,702、96,703、96,704、96,705、96,706、96,
707、96,708、96,709、96,710、96,711、96,712、96,713、96,714、96,715、96,716、96,717、96,
718、96,719、96,720、96,721、96,722、96,723、96,724、96,725、96,726、96,727、96,728、96,
729、96,730、96,731、96,732、96,733、96,734、96,735、96,736、96,737、96,738、96,739、96,
740、96,741、96,742、96,743、96,744、96,745、96,746、96,747、96,748、96,749、96,750、96,
751、96,752、96,753、96,754、96,755、96,756、96,757、96,796、96,759、96,760、96,761、96,
762、96,763、96,764、96,765、96,766、96,796、96,768、96,769、96,770、96,771、96,772、96,
773、96,796、96,796、96,776、96,777、96,778、96,779、96,780、96,781、96,782、96,783、96,
796、96,785、96,786、96,787、96,788、96,789、96,796、96,791、96,792、96,793、96,794、96,
795、96,796、96,797、96,798、96,799、96,800、96,801、96,802、96,803、96,804、96,805、96,
806、96,807、96,808、96,809、96,810、96,811、96,812、96,813、96,814、96,815、96,816、96,
817、96,818、96,819、96,820、96,821、96,822、96,823、96,824、96,825、96,826、96,827、96,
828、96,829、96,830、96,831、96,832、96,833、96,834、96,835、96,836、96,837、96,838、96,
839、96,840、96,841、96,842、96,843、96,844、96,845、96,846、96,847、96,848、96,849、96,
850、96,851、96,852、96,853、96,854、96,855、96,856、96,857、96,896、96,859、96,860、96,
861、96,862、96,863、96,864、96,865、96,866、96,896、96,868、96,869、96,870、96,871、96,
872、96,873、96,896、96,896、96,876、96,877、96,878、96,879、96,880、96,881、96,882、96,
883、96,896、96,885、96,886、96,887、96,888、96,889、96,896、96,891、96,892、96,893、96,
894、96,895、96,896、96,897、96,898、96,899、96,900、96,901、96,902、96,903、96,904、96,
905、96,906、96,907、96,908、96,909、96,910、96,911、96,912、96,913、96,914、96,915、96,
916、96,917、96,918、96,919、96,920、96,921、96,922、96,923、96,924、96,925、96,926、96,
927、96,928、96,929、96,930、96,931、96,932、96,933、96,934、96,935、96,936、96,937、96,
938、96,939、96,940、96,941、96,942、96,943、96,944、96,945、96,946、96,947、96,948、96,
949、96,950、96,951、96,952、96,953、96,954、96,955、96,956、96,957、96,996、96,959、96,
960、96,961、96,962、96,963、96,964、96,965、96,966、96,996、96,968、96,969、96,970、96,
971、96,972、96,973、96,996、96,996、96,976、96,977、96,978、96,979、96,980、96,981、96,
982、96,983、96,996、96,985、96,986、96,987、96,988、96,989、96,996、96,991、96,992、96,
993、96,994、96,995、96,996、96,997、96,998、96,999或97,000。

[0077] 在表2中提供了插入位点的实例。如上所述，所述位点基于GenBank登记号AJ004801或其等效物。

[0078] 本公开内容教导了包含来源于BoHV-1毒株V155之BoHV-1基因组的BoHV-1疫苗载体，其具有编码来自牛病原体的至少一种抗原的异源遗传物质，所述遗传物质在BoHV-1基因组上的位点插入，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的核苷酸16600至16700、22400至22500；40700至40800；58000至59000；67000至68000；74000至76000；84000至85000；90000至91000以及96000至97000或其他BoHV-1中的功能等效位点。实例包括表2中所列出的位点。

[0079] 存在一系列异源遗传物质可插入其中的其他位点。本文包括所有这样的位点。

[0080] 本文教导的另一方面是制备针对来自牛病原体的至少一种抗原的疫苗的方法，所述方法包括：

[0081] (i)将来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组并入细菌人工染色体(BAC)载体以形成BoHV-1预载体BAC构建体；

[0082] (ii)经由诱导型重组系统将编码至少一种抗原的遗传物质插入所述BoHV-1预载体BAC构建体中以产生重组BoHV-1-BAC(rBoHV-1-BAC)载体；

[0083] (iii)在细菌宿主中转化并扩增所述rBoHV-1-BAC载体；以及

[0084] (iv)从所述细菌宿主中纯化并分离所述rBoHV-1-BAC载体并且将所述载体配制成疫苗组合物。

[0085] 本公开内容教导了牛科动物(例如饲育场的牛、乳制品厂的牛和其他密集圈养的牛)的疫苗接种方案。疫苗制剂的施用可通过一系列局部和全身方案进行，例如鼻内、经口、肌内、舌下、静脉内、皮下或动脉内注射、皮肤喷雾或包括阴道内和直肠内施用在内的其他常规途径。鼻内途径特别有效。所述制剂可以是标准药物制剂。在一个实施方案中，所述制剂是冻干的并且在使用前重构。

[0086] 因此，通常将本文的疫苗制备为或适于重构为可注射或可经鼻施用的液体溶液或混悬剂或冻干制剂。所述疫苗还可以是乳化的。在使用前，可药用稀释剂、载体或赋形剂。疫苗制剂还可以包含辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或佐剂。

[0087] 因此，本文教导了包含来自低毒力BoHV-1之BoHV-1基因组的疫苗制剂，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达；所述制剂为冻干形式或还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

[0088] 所述制剂还可包含来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，当其表达时产生能够对其产生免疫应答的抗原，所述BoHV-1基因组还包含与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达并且其中异源抗原诱导免疫应答；所述制剂为冻干形式或还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

[0089] 本发明还使得能够进行诊断测定以在血清学上区分接种疫苗与未接种疫苗的牛科动物。通常，进行标准抗体测定来检测预期在用BoHV-1重组疫苗接种之后产生的抗体。在一个实施方案中，通过BoHV-1载体表达的异源抗原之一是标记物蛋白，例如绿色荧光蛋白。其为用于接种疫苗的效力的方便标记物并且作为专有标签。

[0090] 本文涉及用于管理受限场所中牛科动物的商业方法，所述商业方法包括针对来自牛病原体的至少一种抗原对牛科动物接种疫苗来降低BRDC的传播几率由此维持牛科动物的经济可行性，所述方法包括向牛科动物施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0091] 所述商业方法整合了用于饲养牛科动物的管理方案并且可包括用于从业者测试BRDC、对牛科动物接种疫苗以及之后维持成群动物之血清学分析的服务费。

[0092] 执行所述商业方法的成本可以由成群牛科动物的所有者来承担或者分摊给消费者。

[0093] 血清学测试也使流行病学研究得以进行。

[0094] 因此，本文提供了针对来自牛病原体的至少一种抗原的疫苗，所述疫苗包含来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。在一个实施方案中，经由诱导型重组系统(例如经由GET重组)将编码至少一种抗原的遗传物质插入BoHV-1基因组中。

[0095] 将编码至少一种抗原的遗传物质常规地在以下位点插入两个会聚基因的聚腺苷酸化信号之间，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的16600至16700、22400至22500；40700至40800；58000至59000；67000至68000；74000至76000；84000至
85000；90000至91000；以及96000至97000或其他BoHV-1中的功能等效位点。在一个实施方案中，将至少一种抗原在选自表2所列出的位点插入两个会聚基因之间。在另一个实施方案中，将至少一种抗原在选自16602至16603和22421至22470的位点插入两个会聚基因之间。

[0096] 常规地，所述疫苗提供产生BoHV-1抗原和/或选自以下之抗原的BoHV-1：来自牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抗原和来自微生物的抗原。

[0097] BVDV抗原的实例是糖蛋白E0和糖蛋白E2。作为抗原来源的微生物的实例包括：牛支原体(Mycoplasma bovis)、沙门氏菌(Salmonella)类、多杀巴斯德氏菌(Pateurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Manhiemia haemolytica)和睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)。

[0098] 在一个实施方案中，低毒力BoHV-1毒株是毒株V155。本文的疫苗还可包含经由限制性内切酶消化而插入的编码其他抗原的另外的遗传物质。也可将所述疫苗配制为药物组合物，例如适于经鼻施用的药物组合物。

[0099] 本文涵盖用于针对来自牛病原体的至少一种抗原对牛科动物接种疫苗的方法，其向牛科动物施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。可经由诱导型重组系统(例如经由GET重组)将编码至少一种抗原的遗传物质插入BoHV-1基因组中。

[0100] 如上所述，将编码至少一种抗原的遗传物质在以下位点插入两个会聚基因的聚腺苷酸化信号之间，所述位点选自BoHV-1参考序列GenBank登记号AJ004801的16600至16700、22400至22500；40700至40800；58000至59000；67000至68000；74000至76000；84000至
85000；90000至91000；以及96000至97000或者其他BoHV-1中的功能等效位点，包括在两个会聚基因之间选自16600至16612和22400至22493的位点、包括在两个会聚基因之间选自
16602至16603和22421至22470的位点、包括在两个会聚基因之间选自表2所列出的位点。

[0101] 根据该方法，BoHV-1产生BoHV-1抗原和/或选自以下的至少一种抗原：来自牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抗原和来自微生物的抗原。

[0102] BVDV抗原的实例是糖蛋白E0或糖蛋白E2。微生物的实例为牛支原体、沙门氏菌类、多杀巴斯德氏菌、溶血性曼氏杆菌或睡眠嗜血菌。

[0103] 如上所述，低毒力BoHV-1毒株包括毒株V155。也可经由限制性内切酶消化而插入编码其他抗原的另外的遗传物质。

[0104] 针对来自牛病原体的至少一种抗原制备疫苗的方法，其通过以下实现：

[0105] (i)将来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组并入细菌人工染色体(BAC)载体以形成BoHV-1预载体BAC构建体；

[0106] (ii)经由诱导型重组系统将编码至少一种抗原的遗传物质插入所述BoHV-1预载体BAC构建体中以产生重组BoHV-1-BAC(rBoHV-1-BAC)载体；

[0107] (iii)在细菌宿主中转化并扩增所述rBoHV-1-BAC载体；以及

[0108] (iv)从所述细菌宿主中纯化并分离所述rBoHV-1-BAC载体并且将所述载体配制成疫苗组合物。

[0109] 如上公开了诱导型重组系统和插入位点、抗原及其来源。

[0110] 本文还涉及转染有rBoHV-1-BAC载体的培养细胞。

[0111] 本文教导了针对牛呼吸道疾病综合症(BRDC)对牛接种疫苗的方法，所述方法包括向牛施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量的来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0112] 本文还涵盖来自低毒力BoHV-1的1型牛疱疹病毒(BoHV-1)基因组在制造针对牛病原体对牛接种疫苗之药物中的用途，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个会聚BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1基因的表达。

[0113] 通过以下非限制性实施例来描述本文的一些方面。

[0114] 实施例1

[0115] BoHV-1毒株

[0116] 所用的低毒力BoHV-1毒株是毒株V155，最初通过前述Snowden(1964)描述。核苷酸位置编号基于GenBank登记号AJ004801。

[0117] 实施例2

[0118] 重组1型牛疱疹病毒(BoHV-1)的构建

[0119] 使BoHV-1毒株V155在CRIB-1细胞(ATCC号CRL-11883，MDBK细胞的抗瘟病毒衍生物)中繁殖。在37℃下，将CRIB-1细胞维持在包含抗生素/抗真菌剂、非必需氨基酸、glutaMAX、25mM Hepes和5％v/v供体小牛血清的汉克氏基本必需培养基(Hank’s minimal essential medium,H-MEM)中。除非另外说明，否则用于细胞和病毒繁殖的所有试剂均获自Invitrogen Australia。

[0120] 在转染前24h将CRIB-1细胞以5×105个细胞/孔放入六孔板(Corning)中，并且在37℃下于5％v/v CO2的气氛中孵育。对于每次转染，使用OptiMEM将1μg至2μg的DNA稀释至
100μl并与使用OptiMEM稀释至100μl的8μl Lipofectamine相混合。将所得混合物在室温下孵育45分钟以形成脂质/DNA复合物。使用OptiMEM将反应体积增至1mL并且添加至已用OptiMEM洗涤两次的细胞单层。然后在37℃下用5％v/v CO2孵育经转染单层16h至18h之后，添加包含10％v/v供体小牛血清的1ml OptiMEM。24h后，移除转染液体并更换维持培养基。
在转染后达至7天所述单层产生CPE。

[0121] 为了纯化BoHV-1基因组DNA，在MOI为5下用BoHV-1毒株V155感染MDBK变体细胞CRIB-1并使感染进行至完成。然后，通过以5000g离心10分钟使细胞培养上清液澄清。通过以120000g离心2小时来沉淀成熟的BoHV-1病毒体。使用Qiagen基因组DNA提取试剂盒基本上依照供应商所述来从沉淀的病毒中回收BoHV-1基因组DNA。使病毒沉淀重悬于与起始上清液体积1:65比率的基因组DNA提取缓冲液中。在从柱洗脱后，将BoHV-1DNA以等分试样储存于-20℃下。使用HindIII来消化1μg至2μg的DNA用于与已知BoHV-1的消化谱相比较。

[0122] 为了有利于使用GET同源重组将转基因插入BoHV-1的TK基因中，构建缺失/插入载体pTK del。该载体包含BOHV-1胸苷激酶基因的两个区段(TKleft和TKright)，以用作重组臂。

[0123] 使用Taq聚合酶缓冲液(10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl、pH 8.5)、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1.25mM、每种引物12.5μM、1U的Taq DNA聚合酶、10ng至20ng的基因组DNA5％v/v DMSO、10％v/v甘油对BoHV-1基因组进行PCR。这些组分的终反应体积为20μl。

[0124] 使用的PCR循环条件为：94℃变性 4分钟；94℃20秒、60℃20秒和72℃120秒，循环35次；接着是72℃10分钟并且随后保持于4℃。循环在Hybaid Sprint热循环仪中进行。在循环后，在1％w/v琼脂糖凝胶上解离PCR产物，切割产物并且使用Qiagen凝胶提取试剂盒根据制造商的说明回收DNA。

[0125] 通过PCR由经纯化的BoHV-1基因组DNA扩增TKleft和TKright。在扩增后，使用Qiagen PCR纯化柱根据制造商的说明纯化产物。用KpnI和SalI消化TKleft PCR产物，经凝胶纯化并连接入也已被KpnI/SalI消化的pBluescript-SK+(Stratagene)。通过测序来证实TKleft产物的存在。在EcoRI和SpeI消化后，使用标准克隆方法将TKright PCR产物克隆至含有TKleft产物的质粒中。所得质粒被称为pTKdel(参见Mahoney等(2002)，同上)。表3中示出了用于TK靶向区域PCR扩增的引物。将NsiI位点整合进Tkleft5'和Tkright3'引物中以使得能够从pTKdel载体中切除转基因产物用于重组实验。在两个TK交叉区域之间存在用以允许转基因插入而转移至BoHV-1基因组的四个独特的限制性核酸内切酶位点。

[0126] 为了将细菌人工染色体(BAC)转移至BoHV-1的基因组，用HindIII消化BAC载体pBello-BAC II并经凝胶纯化。将经消化的BAC载体连接到已被HindIII消化并去磷酸化的pTKdel中。在转化入E.Coli菌株XL1-Blue细胞后，将转化体铺在包含12.5μg/ml氯霉素(CAP)和100μg/ml氨苄青霉素的选择性琼脂上。通过用HindIII切除回收自所得菌落的DNA来证实BAC载体的插入。通过用NsiI消化从pTKdel-BAC中切除TK缺失片段(TK-BAC)，该TK缺失片段包含侧翼为TKleft和TKright的BAC载体并经凝胶纯化。

[0127] 为了促进BAC-TK片段和BoHV-1基因组DNA之间的同源重组，用NsiI消化经纯化的BoHV-1DNA并用细菌碱性磷酸酶(Pharmacia)去磷酸化。将BAC-TK片段和经NsiI消化的BoHV-1基因组DNA共转染入上述CRIB-1细胞中。在18h至24h后，移除转染混合物并更换为包含2mM N,N'-六亚甲基双乙酰胺(ICN)的完全H-MEM来促进病毒基因转录。所得病毒上清液在CRIB-1细胞内传代一次。使用引物对ChloramF和ChloramR通过对氯霉素抗性基因特定的PCR测定来证实BAC载体插入BoHV-1基因组中。

[0128] 通过用含2μl的10mg/ml蛋白酶K的10μl裂解缓冲液(包含0.45％v/v Triton X-100和0.45％v/v吐温20的10mM Tris-HCl pH 8.0)孵育10μl病毒上清液，随后在60℃下孵育2h来制备PCR模板。使蛋白酶K在95℃下灭活15分钟。使用1μl至2μl的该制备物作为模板来进行PCR反应。在对BoHV-1基因组内CAP抗性基因进行RCR检测后，从上述病毒颗粒中回收大部分基因组DNA。为了促进经纯化BoHV-1基因组DNA在细菌宿主中的转化和生长，使用标准连接方法对其进行环化。将等份的连接混合物电穿孔到E.coli DH10B细胞中(1.5kV，100Ω，25μF，Electroporator II；Invitrogen,San Diego)。在电穿孔后，将DH10B细胞回收于
960μl的SOB中并在温和震荡下于37℃孵育5h至6h。将等份电穿孔混合物铺在包含12.5μg/ml CAP的LB平板上。使菌落在37℃下生长24h至48h。

[0129] 将CAP抗性菌落接种到5mL的包含12.5μg/ml CAP的LB培养液中并在37℃下生长16h。使用标准碱性裂解方法回收BAC DNA。将这些BAC克隆的HindIII消化谱与BoHV-1基因组DNA的HindIII谱相比较。将与基因组DNA的HindIII谱类似的BAC克隆转染入上述CRIB-1细胞中。每日对转染的被认为是典型BoHV-1的CPE发生进行监测。

[0130] 将通过共电穿孔质粒(pGETrec，通过澳大利亚墨尔本的Murdoch Childrens Research Institute获得)在DH10B中产生的BoHV-1BAC重组电穿孔到携有pBACBHV37(BoHV-1感染性克隆)的DH10B细胞中。在包含12.5μg/ml CAP和100μg/ml氨苄青霉素的琼脂上选择包含两种质粒的DH10B细胞。在细胞生长对数期期间采用0.2％w/v阿拉伯糖诱导来制备双抗性DH10B细胞的电感受态细胞以使得能够如先前所述同源重组。然后，将PCR扩增的目的转基因电穿孔到这些细胞中。在从电穿孔容器中回收后，在震荡下使细胞于37℃在SOC培养液中恢复至少6小时。将所有恢复的细胞以及适当的抗生素放于氯霉素选择平板上来选择转基因。

[0131] 为了证实可利用GET重组来修饰BoHV-1基因组，建立两种不同的rBoHV-1病毒。建立了两种不同的rBOHV-1，其中：

[0132] (i)缺失编码gE的基因。这使用通过PCR由转座子EZ::TN(Epicentre RTechnologies)扩增的最小卡那霉素抗性盒(Kan)来进行。使用的PCR引物(gE-KanF和gE-KanR)包含50bp的与gE基因的5'端(AJ004801的第121671至121720的碱基数)和3'端(AJ004801的第123371至123420的碱基数)同源的区域。所得产物gE-KanR的长度为1300bp并且在根据制造商的说明使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)琼脂糖凝胶分离后对其进行回收。

[0133] (ii)将编码绿色荧光蛋白(GFP)的异源基因插入V155基因组的Nsil位点REMR中。这通过将GFP表达盒插入位于UL46(蛋白病毒体被膜蛋白)和UL44(使用pGETrec促进的重组糖蛋白C)之间的基因组中来进行。在根据制造商的说明使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)琼脂糖凝胶分离后对所得产物进行回收。

[0134] 另一些位点选自表2所列出的那些位点。

[0135] 将约200ng的经凝胶纯化的PCR产物电穿孔到上述电感受态DH10B(pBACBHV37，pGETrec)中。通过将重组菌落铺在包含12.5μg/ml CAP和50μg/ml卡那霉素的LB平板上来对其进行鉴定。PCR和Southern印迹分析证实gE基因被KanR盒替代。

[0136] 如下所述对用于Southern印迹的病毒基因组DNA进行纯化。在MOI为5下用BoHV-1毒株V155感染细胞单层并且进行感染直至约40％的细胞示出“集拢(rounding up)”的形态类型。除去生长培养基，然后在0℃下用PBS轻轻洗涤所述单层两次。在向每个烧瓶(4ml/175cm2)添加0℃的细胞裂解缓冲液(pH 7.3，10mM磷酸钠，含有1％v/v Nonidet P-40)并摇动烧瓶，使得裂解缓冲液与整个单层接触。除去裂解缓冲液并放于冰上，在轻轻摇动下向各个烧瓶添加另外4mL，将其移除并添加至初始裂解溶液。在4℃下以4300g离心10分钟使裂解液澄清。收集上清液并在5℃下以112700g离心100分钟。使病毒沉淀重悬于500μl G2缓冲液(Qiagen)。向重悬的病毒沉淀添加蛋白酶K(25μl，10mg/ml)，然后在50℃孵育1h。如下使用genomic tip 20/G(Qiagen)来回收基因组病毒DNA。用1ml的QBT缓冲液平衡genomic tip 
20/G。用等体积的QBT缓冲液稀释经蛋白酶K处理的物质并将之加载在genomic tip(660μl/tip)上。用7.5ml的QC缓冲液洗涤两次tip。在50℃下用2×1.5ml QF缓冲液从tip洗脱病毒DNA。沉淀DNA，用75％v/v乙醇洗涤一次并且重悬于50μl的10mM Tris-HCl(pH为8.5)中。

[0137] 在5℃下使用倒转电场凝胶电泳(field inversion gel electrophoresis,FIGE)设备(Biorad)使经限制酶消化的DNA样品在0.5X TBE缓冲液中的1％w/v凝胶上电泳13.5h。在180V的正向电压和120V的反向电压下，切换时间坡度为0.1s至2s的线形。通过毛细管作用将DNA片段转移至Hybond-N不带电的膜(Amersham)并且使用紫外线将DNA固定于膜上。用DIG-II-dUTP(Roche Molecular Biosystems)标记探针。使用包含以下的反应混合物通过PCR来合成探针：在20μl终体积中的Taq聚合酶缓冲液(10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl、pH8.5)、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1.25mM、1.25μM DIG-II-dUTP、1U Taq聚合酶(Roche Molecular Biosystems)和5ng模板DNA。PCR反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒、55℃30秒、
68℃1分钟，循环35次；68℃6分钟。在凝胶纯化后，在55℃下使PCR探针与膜杂交12h至16h(用于滤膜杂交的DIG系统用户指南，Roche Molecular Biosystems)。在杂交炉(Hybaid)内于旋转瓶中进行杂交。在室温下，在震荡平台上于培养皿中洗涤膜。

[0138] 使用标准病毒学技术来测定多种rBoHV-1的复制动力学。简而言之，在5％v/v CO2的气氛中于37℃下使1TCID50的病毒对铺于24孔平板中的1×105CRIB-1细胞感染90分钟。然后通过添加柠檬酸钠溶液(40mM柠檬酸钠、10mM KCl、135mM NaCl、pH 3.0)灭活胞外病毒，然后用PBS洗涤两次细胞层并添加1ml的维持培养基，并且于5％CO2气氛中在37℃下培养。在感染后2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h收集病毒上清液和细胞沉淀并冷冻于-70℃直至使用。然后测定每一时间点的各个上清液的TCID50，一式三份。在一个冷冻/解冻循环后，也测定每一时间点的胞内病毒的TCID50，一式三份。

[0139] 表3

[0140]

[0141] 实施例3

[0142] rBoHV-1可传染性(transmissibility)的评价

[0143] 该实验的目的是确定重组(经遗传修饰的，GM)病毒是否能够由接种疫苗的牛传染至位于离接种疫苗牛不同距离处的其他牛。其他反刍动物(绵羊和山羊)也位于相对接种疫苗之牛的不同位置处，从而确定GM病毒是否可传染至这些反刍动物物种。

[0144] 在开始动物实验之前，所有的牛、绵羊和山羊均对BoHV-1和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特定抗体呈阴性。将各物种的动物随机分配至以下的组：

[0145] 岗哨组(sentinel group)A：牛(4)、绵羊(4)和山羊(4)[注意将绵羊和山羊圈养在一起]位于离畜舍约23米处；

[0146] 岗哨组B：牛(2×2)、绵羊(4)和山羊(4)，位于离畜舍西端围栏中；

[0147] 岗哨组C：牛(2×2)、绵羊(4)和山羊(4)，位于畜舍东端与接种疫苗牛对面的围栏中；以及

[0148] 疫苗接触组：接种疫苗的牛(4)和接触牛(4)，位于畜舍东端。

[0149] 环境拭子取自畜舍中和其周围处的多个地点，用于测试长期存在于其天然宿主(牛)外的GM病毒，在同一天收集动物样品。

[0150] 在接种疫苗前(0天)，从所有动物收集血液(20ml)和鼻部拭子。还记录了所有动物的直肠温度。然后用2ml的原型疫苗(BoHV-1TK-E2+)对牛(94)进行鼻内疫苗接种。将接种疫苗的牛与未接种疫苗的牛圈养在一起。在接种疫苗(第1天至第14天)14天后，从所有动物收集鼻部拭子并记录所有动物的直肠温度。在接种疫苗第28天后结束实验。此时，从所有动物收集血液(20ml)和鼻部拭子。此外，记录所有动物的直肠温度。在收集这些样品后，对所有动物实施安乐死并收集组织(心脏、肺、肾、脾、肌肉、肝、脑和三叉神经中枢)样品。经由高温焚化来处理尸体。

[0151] 实施例4

[0152] 湿gmBoHV-1制剂或冻干gmBoHV-1制剂的比较

[0153] 该实验的目的是将gmBoHV-1作为湿制剂和冻干制剂的效力与Q-Vax Pty Ltd提供的Rhinogard(商标)效力进行比较。

[0154] 在开始动物实验之前，所有的牛对BoHV-1和BVDV特异性抗体呈阴性。将牛随机分配至以下的组：

[0155] 组1：未接种疫苗；

[0156] 组2：将1ml至2ml的疫苗(gmBoHV-1)鼻内接种入一个鼻孔中；

[0157] 组3：将1ml至2ml的疫苗(FD-gmBoHV-1)鼻内接种入一个鼻孔中；

[0158] 组4：将1ml至2ml的疫苗(Rhinogard)鼻内接种入一个鼻孔中。

[0159] 环境拭子取自畜舍中和其周围处的多个地点，从而测试长期存在于其天然宿主(牛)外的GM病毒，在同一天收集动物样品。

[0160] 接种疫苗前(0天)，从所有牛收集血液(20ml)和鼻部拭子和鼻棉塞拭子。此外，记录了所有牛的直肠温度和体重(组合对的重量)。然后用合适制剂对组2和组4进行鼻内疫苗接种。在临滴注前快速重构冻干的gmBoHV-1。计划使用商业涂药器(applicator)来施用疫苗，然而由于实现其正常操作有一些问题，所以如先前研究所实施，使用注射器来递送接种疫苗。

[0161] 在疫苗接种(第1至第7天)7天后，从所有动物中收集鼻部拭子并记录所有动物的临床体征。

[0162] 在如下述在疫苗接种后第14天，用BoHV-1毒株Q3932攻击所有牛。在攻击前，记录所有动物的鼻部拭子和临床体征。然后采用鼻内滴注107TCID50BoHV-1毒株Q3932来攻击牛。在BoHV-1攻击后，从所有牛收集鼻部拭子并且使用表4所述的评分方法每天(第15至第18天)进行临床评价。

[0163] 表4

[0164]

[0165] 攻击之前和之后动物临床评价中所用的临床体征和参数。通过将在15秒中的呼吸次数乘以4来计算呼吸速率。每日取样前观测围栏中呼吸速率。上午测定直肠温度并且如果观测到显著升高的话则在当天晚些时候重复测量。如果需要也记录其他临床特点，例如呼吸的声音。为临床体征分配了数值分数(S)。将牛的体重1记录为组合量度，因为当在群中成对处理时，动物的采样程序会更安定(settled)。

[0166] 在疫苗接种后第18天，用溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)攻击所有牛。在攻击之前，针对所有动物收集鼻部拭子并记录临床体征。然后鼻内滴注约5×109cfu的溶血性曼氏杆菌来攻击牛。在该第二攻击后，从所有牛中收集鼻部拭子并使用评分方法每天(第19天至第26天)进行临床评价。

[0167] 在接种疫苗后第35天结束实验。此时，从每只动物收集血液(20ml)、鼻部拭子和鼻棉塞拭子。此外，记录所有动物的直肠温度。在收集这些样品后，对所有动物实施安乐死并收集组织样品(心脏、肺、肾、脾、肌肉、肝、脑和三叉神经中枢)。经由深埋来处理尸体。

[0168] 实施例5

[0169] 已有免疫对疫苗效力的影响

[0170] 该实验的目的是确定已有的对BoHV-1或BVDV的免疫是否会影响gmBoHV-1疫苗的效力。例如，如果动物对BoHV-1的抗体呈阳性，则gmBoHV-1仍能够诱导BVDV免疫(参见表5)。

[0171] 表5

[0172] 已有免疫对重组BoHV-1疫苗效力影响的评价

[0173]

[0174] 1指示疫苗接种时血清学状况，BoHV-1阳性和BVDV阳性指示为此前暴露于BoHV-1或BVDV，如通过针对疫苗接种前所收集血清中各种病毒之抗体的存在所确定的。

[0175] 2在疫苗接种后第14天，用经由气雾剂递送的BoHV-1野生株Q3932攻击，然后5天后用溶血性曼氏杆菌攻击，如实施例4所述。

[0176] 3除了用BVDV野生株代替BoHV-1之外，按照2进行。

[0177] 环境拭子取自畜舍中和其周围处的多个地点，从而测试保持在其天然宿主(牛)外的GM病毒的存在，在同一天收集动物样品。

[0178] 在接种疫苗前(0天)，从所有牛中收集血液(20ml)和鼻部拭子和鼻棉塞拭子。此外，记录所有牛的直肠温度和体重(组合对重量)。然后使用临滴注前重构的冻干gmBoHV-1对组进行鼻内接种。计划使用商业涂药器来施用疫苗，然而由于实现其正常操作有一些问题，所以如先前研究所实施，使用注射器来递送接种疫苗。

[0179] 在疫苗接种(第1天至第7天)7天后，从所有动物中收集鼻部拭子并且记录所有动物的临床体征。

[0180] 在如下述疫苗接种后第14天，用BoHV-1毒株Q3932攻击所有牛。在攻击前，针对所有动物收集鼻部拭子并记录临床评价。然后采用鼻内滴注107TCID50BoHV-1毒株Q3932来攻击牛。在BoHV-1攻击后，从所有牛收集鼻部拭子并使用表3所述的评分方法每天(第15天至第18天)进行临床评价。

[0181] 在疫苗接种后第18天，用溶血性曼氏杆菌攻击所有牛。在攻击之前，收集所有动物的鼻部拭子并记录所有动物的直肠温度、呼吸速率和体重。然后鼻内滴注约5×109cfu的溶血性曼氏杆菌来攻击牛。在该第二次攻击后，从所有牛收集鼻部拭子并使用表3所述的评分方法每天(第19至第26天)进行临床评价。

[0182] 在接种疫苗后第35天结束实验。此时，从每只动物收集血液(20ml)、鼻部拭子和鼻棉塞拭子。在收集这些样品后，对所有动物实施安乐死并收集组织样品(心脏、肺、肾、脾、肌肉、肝、脑和三叉神经中枢)。经由深埋来处理尸体。

[0183] 实施例6

[0184] 毒力回复(reversion to virulence)

[0185] 该实验的目的是确定gmBoHV-1通过牛多个组的连续传代是否会示出毒力增强迹象。

[0186] 环境拭子取自畜舍中和其周围处的多个地点，从而测试长期存在于其天然宿主(牛)外的GM病毒，在同一天收集动物样品。

[0187] 在接种疫苗前(0天)，从所有牛中收集血液(20ml)和鼻部拭子和鼻棉塞拭子。此外，记录所有牛的直肠温度和体重(组合对重量)。

[0188] 然后使用临滴注前快速重构的冻干gmBoHV-1对牛(2)进行鼻内疫苗接种。在接种疫苗后(第1天至第7天)，从这些动物中收集鼻部拭子并且每天记录动物的临床评价。

[0189] 在接种疫苗后第14天结束各传代实验。此时，从每只动物收集血液(20ml)、鼻部拭子和鼻棉塞拭子。在收集这些样品后，对所有动物实施安乐死并收集组织样品(心脏、肺、肾、脾、肌肉、肝、脑和三叉神经中枢)。经由深埋来处理尸体。

[0190] 为了完成gmBoHV-1病毒的体内传代，从经疫苗接种牛的鼻部拭子分离出病毒并且用来再感染两头未接触过BoHV-1的牛。如上所述将该过程重复四次。应注意仅首次传代使用冻干gmBoHV-1来完成。

[0191] 实施例7

[0192] 过多剂量

[0193] 该实验的目的是确定过多剂量(ED)的gmBoHV-1是否对疫苗接种的动物有害。

[0194] 环境拭子取自畜舍中和其周围处的多个地点，从而测试长期存在于其天然宿主(牛)外的GM病毒，在同一天收集动物样品。

[0195] 在接种疫苗前(0天)，从所有牛中收集血液(20ml)和鼻部拭子和鼻棉塞拭子。还记录了所有牛的直肠温度和体重(组合对重量)。然后如下所述用临滴注前快速重构的冻干gmBoHV-1对Ed组1至3进行鼻内疫苗接种。计划使用商业涂药器来施用疫苗，然而由于实现其正常操作有一些问题，所以如先前研究所实施，使用注射器来递送接种疫苗。

[0196] ED组1：使用鼻内滴注(105-6TCID50)1ml疫苗/鼻孔来疫苗接种牛(4)；

[0197] ED组2:使用鼻内滴注(106-7TCID50)1ml疫苗/鼻孔来疫苗接种牛(4)；

[0198] ED组3:使用鼻内滴注(107-8TCID50)1ml疫苗/鼻孔来疫苗接种牛(4)。

[0199] 在疫苗接种(第1天至第7天)7天后，从所有牛中收集鼻部拭子并且记录所有动物的临床评价。在接种疫苗后第14天结束实验。此时，从每只动物收集血液(20ml)、鼻部拭子和鼻棉塞拭子。在收集这些样品后，对所有动物实施安乐死并收集组织样品(心脏、肺、肾、脾、肌肉、肝、脑和三叉神经中枢)。

[0200] 实施例8

[0201] gmBoHV-1的遗传稳定性

[0202] 对于逆传代gmBoHV-1原型疫苗的限制性内切酶特性

[0203] 由在围栏实验全程中收集的鼻部拭子，经由哺乳动物细胞培养物(CRIB-1细胞)鉴定处理组代表的病毒分离。gmBoHV-1的骨架内存在的细菌人工染色体(BAC)使质粒DNA能够分离和纯化，所述质粒DNA经由细菌复制来增大DNA产量。

[0204] 细胞培养

[0205] 在六孔平板中制备用于感染的CRIB-1细胞的汇合单层(70％)。除去培养基并用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述单层。向经洗涤的单层添加1mL的鼻部拭子(在PBS中并为PSF的五倍)并且在27℃下于5％v/v CO2中孵育1小时。移除接种体并用1mL的PBS洗涤细胞一次，然后使其在37℃和5％CO2下于具有PSF的3mL新鲜培养基中恢复5h。

[0206] 在感染后6h，用1mL的PBS洗涤单层，然后向所述单层添加1mL全DNA裂解缓冲液(具有新鲜蛋白酶K)并且在37℃下培养4小时。这使细胞原位裂解而从CrIB-1细胞中释放总DNA并且复制pBACBHV1E2s病毒疫苗候选。收获该感染早期的总DNA来确保一些BAC DNA将呈环形并且适用于转化到细菌中以用于克隆复制。

[0207] 总DNA的提取和转化

[0208] 通过使用苯酚/氯仿提取来纯化总DNA并且使用无水乙醇沉淀。然后在室温下使干的DNA沉淀在50μl的无菌高纯水(18MΩ)中重悬2h。各提取体积根据DNA的初始混悬液的粘度而变化。通过将10μl的总DNA电穿孔入20μl的DH10B  ElectroMax感受态细胞(Invitrogen)中实现转化并在包含12.5μg/ml氯霉素的细菌平板上进行选择。从每个平板挑取三个菌落到包含12.5μg/ml氯霉素的50mL LB培养液中并且在轻轻震荡下于37℃生长
18h。使用改进的碱裂解方案(基于用于小量制剂的Roche高纯度质粒分离试剂盒)来从这些培养物中提取BAC DNA。使细菌细胞沉淀以除去培养液并使之重悬于Tris缓冲液中。使这些细胞裂解以释放待纯化的DNA，除去残留的蛋白质和盐。将沉淀的DNA干燥并在4℃下重悬于
60μl的10mM Tris-HCl(pH 8.5)中过夜。

[0209] 限制性内切酶特性

[0210] 经由比较候选疫苗(不经由动物逆传代)和亲本病毒载体(pBACHBV137)的RE特性来分析来自每个分离物的多个克隆的总突变。制备5μl的碱性裂解剂，(NEB)根据制造商的说明在20μl总体积中用酶Hindlll和Sall使BAC DNA消化4h。

[0211] 使用倒转电场凝胶电泳(FIGE)来分离经消化BAC DNA并可视化带谱。将20μl的经消化BAC DNA加载在0.5倍TBE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶(两者均具有溴化乙锭)上并且运行条件为FIGE设备(BioRad)的程序3，其靶向分子量大小范围为5Kb至100Kb，运行时间为16h。

[0212] 实施例9

[0213] gmBoHV-1在哺乳动物细胞系中感染、复制以及表达转基因的体外能力

[0214] 就CPE的外观方面而言，亲本BoHV-1和GM BoHV-1之间无区别性差异。直观的CPE是BoHV-1两种病毒的典型。通常，在经BoHV-1或gmBoHV-1两者感染的细胞系中病毒的量(由CT值推论)在感染后24h是类似的(图1A至图1C)。这对HaCaT和CRIB-1细胞系而言是统计学显著的，即所检测的病毒的量在亲本和GM之间无显著差异(P<0.05双尾不配对t检验)。对于其余细胞系，在亲本和GM感染的细胞的CT值之间的差异不大于2.5，并且在每一细胞系中始终未检测出较高水平的任一种病毒。

[0215] 已经证实与亲本病毒相比，将转基因(合成BVDV E2)插入亲本BoHV-1中不会改变病毒在测试的多种哺乳动物细胞系中感染和复制的能力。令人感兴趣地是，测试的所有细胞系均容易受到BoHV-1(经修饰的BoHV-1和未经修饰BoHV-1两者)的感染。

[0216] 实施例10

[0217] gmBoHV-1由牛向其他反刍动物的感染

[0218] 进行围栏实验以确定是否由于作出的基因修饰而改变BoHV-1的宿主范围或BoHV-1向其他反刍动物感染的能力。围栏实验包括置于离接种疫苗的牛不同距离处的一系列岗哨牛、绵羊和山羊。

[0219] 在开始围栏实验时，应注意一些牛(特别是岗哨组A中的牛)有鼻部流出物。还有迹象表明一些牛有腹泻。虽然不是最佳地进行实验，但是推迟实验直至这些现象消失却是不可行的。贯穿整个实验，在某些时候这些临床体征在大多数牛组中是明显的—一些动物在整个实验中呈现出一些体征。

[0220] 采用BRD多重测定(FLOT.219)对从第0天开始提取自所有动物的鼻部拭子的测试无法鉴定包含1型牛疱疹病毒、牛呼吸道合胞体病毒、3型牛副流感病毒或牛瘟病毒的任意样品。标准PCR测定的四个属的副粘病毒、腺病毒和肠道病毒也呈阴性。无BoHV1和瘟病毒对该实验而言是最重要的，因为任一种病毒的存在使得该实验结果极难解释并且可导致实验终止。

[0221] 令人感兴趣的是从第0天开始尝试从鼻部拭子分离病毒，原因是似乎在细胞中有一些致细胞病变效应(CPE)，表明存在病毒。然而，这些上清液传代的尝试并不成功。做出了另一些步尝试来确定是否感染剂与这些体征相关，其通过对被来自具有持久临床体征的动物(来自岗哨A的动物377)的鼻部拭子感染的细胞进行染色来荧光标记针对以下牛病毒的抗体：腺病毒3、冠状病毒、瘟病毒、副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒、细小病毒和呼肠孤病毒。然后使用标准PCR测试在第0天提取自动物377的鼻部拭子并且获得与预期尺寸一致的扩增子。然而，该扩增子的测序表明其为非特异性扩增产物。而抗体染色似乎是特异性的，病原体的鉴定仍然是未知的。采用我们实验室可用的所有分子测试来分析这些样品，这无法鉴定对所观察临床体征起作用的致病试剂。基于这些测试的先前应用，认为起作用的试剂极不可能与BoHV-1或BVDV密切相关，因此应当不会干扰这些病毒血清学数据的解释。

[0222] 通过RT-PCR或三个岗哨组的任意绵羊或山羊中的病毒分离均未探测到gmBoHV-1。类似地，在实验期间的任何时候，通过RT-PCR或任意容纳于岗哨组A、B或C中的牛的病毒分离均未探测到GM病毒。

[0223] 在所有经接种牛中检测GM病毒。通常，如果对于病毒分离物(培养物)样品呈阳性，则对于RT-PCR也呈阳性。病毒最优选回收自第1天至第6天通过RT-PCR鼻部拭子呈阳性和第3天和第4天培养物呈阳性的动物。

[0224] 在四对动物中有两个中检测到GM病毒的接触传染。

[0225] 基于来自鼻部拭子的GM病毒的RT-PCR扩增，病毒在经接种牛中扩增的高峰期是3天。在第3天在四头经接种牛的三头中检测到GM病毒。

[0226] 为了确定GM病毒是否能够保持在宿主(牛)外，在整个实验中，从实验部位的多种表面收集环境拭子。然后利用从细胞培养物中分离和RT-PCR来测试这些鼻部拭子提取物中GM病毒的存在。贯穿整个实验，在采集的环境拭子中均未检测到GM病毒。

[0227] 检测在第0天和第28天收集自所有实验动物的血清，结果表明在28天样品中只有接种的牛产生可检测到的针对BoHV-1的抗体。。

[0228] 基于来自该实验的结果，GM病毒未传染给其他属(绵羊和山羊)。类似地，GM病毒没有随着距离变化(>2m)传染至畜样在附近的经接种牛。发生了GM病毒向与经接种牛一起畜养的牛传染，但频率不高。

[0229] 实验的结果并不支持GM病毒的宿主范围的任何改变。虽然对于天然宿主(牛)而言发生了某些传播，但是频率不高并且可取决于在经接种动物中的复制水平。除此之外，在整个实验收集的环境拭子中病毒的天然宿主外未检测到GM病毒。总之，这些数据表明GM病毒向环境中释放的风险极低。

[0230] 实施例11

[0231] gmBoHV-1的再激活

[0232] 在各个实验结束后，从经接种和未接种牛收集鼻部拭子。从这些鼻部拭子提取总核酸并且存在使用靶定BoHV-1和E2转基因的实时PCR测定所测试的gmBoHV-1。基于此，所得出的合理结论为在实验结束之前未发生再激活。

[0233] 实施例12

[0234] GM BoHV-1的持久性和稳定性

[0235] 未检测出GM BoHV-1和野生条件的亲本病毒之间的稳定性差异。许可规定实验在不可能暴露于直射阳光的PCI畜舍中实施。在实际野生条件下，暴露于阳光会可能因为紫外线而增大GM和亲本病毒两者的不稳定性。

[0236] 实施例13

[0237] 残余基因产物

[0238] 在使用实时PCR测试的动物任何组织中未检测到gmBoHV-1。虽然认为不可能存在任何基因产物，但仍针对提取自该动物组织的总蛋白质进行免疫印迹分析。基于这些结果，GM病毒或其表达的基因产物不可能继续存在于接种/被感染动物的组织中。

[0239] 未预料到对于GM病毒和转基因产物两者的存在，动物的组织样品呈阴性。在所测试的组织中，预计gmBoHV-1仅存在于三叉神经节(TG)中，因为预计这是亲本病毒形成潜伏性感染的部位。未能在TG中检测到病毒表明gmBoHV-1不能建立潜伏性感染。或者，可能难以在TG中检测到gmBoHV-1，因为只有少数神经节中的细胞体可能携载病毒—因此成功检测的可能性取决于所处理组织的量和检测灵敏度。

[0240] 实施例14

[0241] 冻干gmBoHV-1制剂的效力

[0242] 在疫苗接种/攻击实验中，将gmBoHV-1原型疫苗作为冻干制剂(FD-gmBoHV-1)的效力与gmBoHV-1作为湿制剂的效力进行比较。在该实验中包括接种有Rhinogard的牛的组以用于比较。表3说明了对于所有从第0天(接种疫苗的日期)至第7天经接种和未接种牛的病毒检测结果。通常，FD-gmBoHV-1和gmBoHV-1疫苗在第3天以极一致的速率被排泻掉，其中具有被PCR检测出的高水平病毒和分离一致的病毒(表6)。通过PCR测定知经gmBoHV-1接种三天或更多天的多数牛呈阳性。除了仅在接种3天后呈阳性的动物(设计的581)之外。

[0243] 在经接种或未接种的组中未观察到不良临床体征。在该阶段的实验期间，三次在未接种的三个动物中检测到了BoHV-1。所检测到的病毒不是gmBoHV-1，因为对E2转基因特异的PCR测定知所有动物呈阴性。此外，BoHV-1的PCR结果呈弱阳性，这表明该结果可归因于样品的污染。这对于在第0天呈阳性的样品，在实验室样品的后处理期间最可能发生。

[0244] 在第0天一些样品对gmBoHV-1呈阳性。这可能是因为接种组内的污染，因为在逻辑上不可能污染接受相同处理的动物之间的所有表面。类似地，使动物成对挤入容纳，原因是这通常使得其更稳定，因此在对第二个动物拭子之前，不排除由所述对的初始成员转移至所述对的另一成员。

[0245] 为了最小化组之间交叉污染的可能性，始终以如下顺序处理组：未接种的对照、经Rhinogard接种以及经gmBoHV-1接种。此外在对组接种Rhinogard后，净化包括挤压的动物处理区域。

[0246] 在第5天未接种动物549的BoHV-1阳性结果可归因于来自经Rhinogard接种组的传染。将动物549安置于邻近经Rhinogard接种组的围栏中，并且因此必须将这些动物送挤压区域。然而，在该过程中动物被严格监控以预防直接接触，动物549在经过Rhinogard围栏时可吸入含病毒的物质也是可行的，原因是在该移动过程中动物趋向探查环境。病毒未感染549并且仅在第1天检测到，这支持了其为环境污染而非来自被感染/接种动物的病毒的传染。数据示于表6中。

[0247] 表6

[0248]

[0249] 疫苗接种阶段：经接种和未接种牛的病毒检测和病毒分离结果。作为围栏实验的一部分，对牛接种gmBoHV-1(湿的GM)、冻干gmBoHV-1(FD-GM)、Rhinogard(RG)或不进行接种来评价FD-GM相较于湿GM的效力。在从鼻部拭子中提取DNA后，使用对gmBoHV-1载体(BHV)和BVDV E2转基因(E2)特异的实时PCR测定(P)来测试样品。PCR结果表示为非常强(++++，Ct值<20)、强(+++，Ct值>20但<30)、弱(++，Ct值>30但<35)、非常弱(+，Ct值>35但<40)或阴性(Pos)，没有回收病毒(Neg)或没有尝试(NA)。0至7天各个动物温度(℃)范围示出于动物编号下。在接种疫苗后7天，所记录的所有温度低于39.5℃，除了581的第1天为39.7℃、596的第7天为39.7℃、565的第3天和第5天分别为39.7℃和39.6℃。

[0250] 在处理组的首次接种疫苗14天后，用BoHV-1毒株Q3932或BVDV毒株MD74攻击牛。在施用攻击病毒(表7)之前在收集两个动物的鼻部拭物中检测到BoHV-1。鼻部拭物对E2转基因呈阴性，这表明检测的病毒不是gmBoHV-1。该病毒没有明显来源，原因是接种有Rhinogard的所有动物均对该病毒呈阴性，这表明可能的来源是样品的收集后处理。在攻击后三至四天(第17天和18天)，在所有被BoHV-1攻击的动物中均检测到了高水平的BoHV-1攻击毒株Q3932(表7)。

[0251] 实施生物安全措施以预防BoHV-1向BVDV攻击的组传染或BVDV向BoHV-1攻击的组传染。尽管如此，BoHV-1也显著感染了BVDV攻击的组(表7)。该交叉感染的来源并非显而易见。然而，没有研究致力于特定评价澳大利亚BoHV-1毒株向牛之间传染的能力，通常可以接受的是需要紧密接触以发生传染。可能支持该结论所实施的大多数实验是疫苗接种实验并且因此未观察到疫苗株(BoHV-1毒株V155)的传染。然而，在这些实验的攻击阶段中所有动物受到攻击，因此没有机会评价攻击毒株向首次用于实验的动物的传染。在此基础上，似乎攻击毒株Q3932更容易通过除了紧密接触之外的方法向其他牛传染。

[0252] 表7

[0253]

[0254]

[0255]

[0256] 对经接种牛和对照牛攻击后的攻击阶段病毒检测、病毒分离和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)检测结果。在接种疫苗14天后，用BoHV-1(107TCID50)或BVDV攻击牛，随后在第18天实施溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica，6.8×109CFU)向所有牛的攻击。在从鼻部拭物中提取DNA后，使用对BoHV-1攻击毒株Q3932(HBV)、BVDV E2转基因(E2)、BVDV攻击毒株(BVDV)或溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica，Mh)特异的实时PCR测定(P)来测试样品。PCR结果表示为非常强(++++，Ct值<20)、强(+++，Ct值>20但<30)、弱(++，Ct值>30但<35)、非常弱(+，Ct值>35但<40)或阴性(-)。14至25天各个动物温度(℃)范围示出于动物编号下。只有动物546在实验结束时对BHV的Ct值为36.7。BHV PCR检测了gmBoHV-1和BoHV-1的攻击毒株两者。

[0257] 在施用两种攻击病原体之后，每天评价动物的临床体征。在14至18天病毒攻击之前未记录到任何临床体征。在受溶血性曼氏杆菌攻击的第二阶段后，许多组中的临床体征很明显。通常，观察到的临床体征较为轻微。在攻击阶段期间的任何时刻，均未记录到升高的温度、食欲的丧失、呼吸速率的改变或咳嗽。

[0258] 在第0天(接种疫苗)、第14天(病毒攻击)和实验结束临实施安乐死之前从所有的动物中收集血清样品。使用市售ELISA测试来测试血清中是否存在针对BoHV-1和BVDV的抗体。这些测试的结果示出于表8中。在第0天，六头牛对BoHV-1的抗体呈阳性。牛(60)来源于同一所有者(a single property)并且年龄都几乎相同。测试收集自所有牛的血清并且其对特异针对BVDV的抗体呈阴性。然而，来自同一畜群的60头牛中有23头牛的血清对针对BoHV-1的抗体呈阳性，所述抗体的先前水平被认为更正常(对BoHV-1的阳性小于10％)。因为牛的高血清阳性率和相对小的年龄(在到达前断奶约8周)，认为呈阳性BoHV-1的高发病率可能是由母体抗体引起。如果原因是母体抗体，则预期存在于血清中抗体的量将随着时间下降。因此，每周对牛的BoHV-1抗体的存在进行再测试。在第一次测试和第三次测试之间的时间段中，三头牛由阳性变为阴性，一头由阳性变为不确定，15头显示出抗体水平降低并且四头抗体水平稳定，其仍为阳性。一只动物似乎产生了针对BoHV-1的抗体(编号598)，然而在之后测试时其为血清反应阴性。

[0259] 在实验开始时，与此前的测试相比，所有对BoHV-1抗体呈阳性的牛(表8)水平降低，这再次支持了在这些动物中存在抗体物质。

[0260] 如所预期的，在实验结束时，所有经gmBOHV-1接种的牛针对gmBOHV-1进行了血清转化。

[0261] 贯穿整个实验，所有牛保持着对BVDV的血清阴性反应(表8)。并不期望如此，因为预期被BVDV攻击的那些动物会针对BVDV进行血清转化。然而，并不意外在病毒检测结果的上下文中未检测到血清转化，原因是所用的BVDV毒株似乎没有在未接种的动物中复制。动物546是用BVDV攻击四天后唯一对BVDV呈PCR阳性(第18天)的动物，然而可以认为，病毒继续存在于鼻腔中较长时间而不会感染和复制，如果发生了复制，则BVDV水平必须非常低，原因是动物未进行血清转化或未在其他任意时间检测到病毒。血清学结果支持了对BVDV的病毒检测结果，其表明BVDV毒株未在这些动物中感染或复制。

[0262] 表8

[0263]

[0264] 贯穿整个疫苗接种实验的不同阶段中受试牛针对牛疱疹病毒1型(BHV)或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学状态实验。使用用于检测针对HBV的血清抗体的Pourquier(注册商标)ELISA IBR-IPVSerum and Milk和用于检测针对BVDV的血清抗体的Pouriquier(注册商标)ELISA BVD-MD-BD P80Antibodies来测试来自所有牛的血清样品。BHV的特异性测试将确认先前被野生型BoHV-1或gmBoHV-1感染。BVDV特异性测试将确认先前被野生型BVDV感染，不能检测到对BVDV E2具有特异性的抗体。

[0265] 实施例15

[0266] 已有免疫对疫苗效力的影响

[0267] 使用遗传工程来组合疫苗的可能风险是对载体或转基因已存在的免疫可降低接种疫苗的有效性。例如，在现有研究中，如果牛对疫苗载体BoHV-1已存在免疫，则该疫苗载体可防止gmBoHV-1疫苗的复制并且预防或降低针对通过转基因编码的BVDV E2蛋白质的任何免疫学应答的刺激。如果这发生了，则经接种牛不会受益于疫苗的BVDV组分，即牛仍将易受BVDV感染并产生疾病。

[0268] 为了确定已有免疫是否可干扰原型疫苗的效力，使用针对BoHV-1或BVDV的抗体呈阳性的动物进行实验。在先前所用的两个阶段攻击模型中，评价了用gmBoHV-1接种的响应。

[0269] 针对BoHV-1的已有免疫对疫苗效力的影响

[0270] 采用gmBoHV-1对确定为对BoHV-1特异的抗体呈阳性的牛进行接种。使用对BoHV-1和E2转基因特异的实时PCR测定来测试从这些动物鼻部拭子中分离出的DNA。如所期望的，在第0天所有动物的两种测定都呈阴性。在经gmBoHV-1接种的动物中，在疫苗接种后1至6天，经由两种PCR测定在除动物552之外的所有动物中一致检测到了病毒。

[0271] 在疫苗接种七天后，在经接种动物中未观察到不良临床体征。

[0272] 第7天未接种的动物之一(动物557)的两种PCR测定呈阳性。从鼻部拭子中分离病毒的尝试未能成功，这表明PCR结果由样品在亚等分试样(sub-aliquoting)或DNA提取过程期间样品的交叉感染引起。

[0273] 对于BoHV-1，接种动物之一(动物556)的PCR仅在第7天为阳性。因为对E2转基因的PCR测定比BoHV-1测定更敏感，所以该BoHV-1似乎为BoHV-1的非重组或野生型毒株。没有作出从该样品中分离病毒的尝试。因为BoHV-1核酸在实验室内得到了广泛的使用，所以亚等分试样或DNA提取期间样品的交叉污染似乎是最可能导致该结果的原因。

[0274] 在疫苗接种后十四天，用BVDV攻击经接种和未接种牛两者。通过PCR得出在第14天，所有的牛对BoHV-1、E2转基因和BVDV呈阴性。用BVDV攻击来自两组的牛并且在另外5天后拭子。在疫苗接种后第18天，用溶血性曼氏杆菌攻击所有牛。使用BVDV毒株，八头牛中有三头在攻击阶段的至少一天呈阳性。第一个动物在第15天呈阳性并且最后一个动物在第23天呈阳性。另外三个未接种的动物针对BVDV进行血清转化。这些结果表明BVDV攻击是成功的。

[0275] 在BVDV攻击之后，每天评价所有的牛的临床体征。在第14天和第18天之间未观察到临床体征。从第19天至第25天观察到了临床体征。

[0276] 这些组的血清学结果示出于表9。可以看出在第0天除539外的所有动物都对BoHV-1呈阳性，可能该动物包含的母体抗体已在该实验开始之前消散(dissipated)。该动物在研究过程中保持对BoHV-1抗体呈阴性。如表8所示，八只动物中有三只动物(均未接种疫苗)针对BVDV进行了血清转化。在实验结束时，八只动物中的另外三只动物(一只未接种疫苗，两只接种了疫苗)明显表现出BVDV抗体水平升高。这些结果支持了BVDV成功攻击的断定。

[0277] 表9

[0278]

[0279] 贯穿整个疫苗接种实验的不同阶段中受试牛针对牛疱疹病毒1型(BHV)或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学状态。使用用于检测针对HBV的血清抗体的Pourquier(注册商标)ELISA IBR-IPVSerum and Milk和用于检测针对BVDV的血清抗体的Pouriquier(注册商标)ELISABVD-MD-BD P80Antibodies来测试来自所有牛的样品。BHV的特异性测试将确认先前被野生型BoHV-1或gmBoHV-1感染。BVDV特异性测试将确认先前被野生型BVDV感染，不能检测到对BVDV E2具有特异性的抗体。*抗体水平升高趋势明显。

[0280] 这些结果共同表明用gmBoHV-1对牛进行接种为这些牛提供了保护。针对BVDV的已有免疫对疫苗效力的影响(BoHV-1攻击)

[0281] 用gmBoHV-1对确定为针对BVDV特异性的抗体呈阳性的牛进行接种。然后使用对BoHV-1和E2转基因特异性的实时PCR测定来测试从这些动物的鼻部拭子中分离的DNA。这些PCR测定的结果示出于表10。如所预期的，在第0天所有动物的两种分析均呈阴性。在经gmBoHV-1接种的动物中，在对所有动物接种2至6天后，经由两种PCR测定一致检测到了病毒。在第3天从所有动物中分离病毒。这些数据共同支持了疫苗的良好吸收。没有在未接种疫苗的动物(表10)中检测到疫苗病毒。

[0282] 在接种疫苗后7天期间，未在经接种动物中观察到不良临床体征。

[0283] 表10

[0284]

[0285] 已对BVDV存在免疫的牛的病毒检测和分离结果。疫苗接种阶段：已对BVDV存在免疫的经接种和未接种牛的病毒检测和病毒分离结果。采用冻干gmBoHV-1(FD-GM)接种牛或保持不接种疫苗。在从鼻部拭子中提取DNA后，使用对gmBoHV-1载体(BHV)和BVDV E2转基因(E2)特异性的实时PCR测定(P)来测试样品。PCR结果表示为非常强(++++，Ct值<20)、强(+++，Ct值>20但<30)、弱(++，Ct值>30但<35)、非常弱(+，Ct值>35但<40)或阴性(-)。还尝试了对经选择样品(VI)进行病毒分离，分离结果显示为回收的病毒(Pos，阳性)，没有回收病毒(Neg，阴性)或没有尝试(NA)。0至7天各个动物温度(℃)范围示出于动物编号下。*尝试的病毒分离未分离出病毒，BoHV-1和E2的PCR比率的结果也与先前结果不一致。

[0286] 在疫苗接种后第14天，用如先前所述的BoHV-1毒株Q3932攻击所有牛。每天收集鼻部拭子并且记录临床体征。在第18天，用溶血性曼氏杆菌攻击所有动物。在攻击后25天，每天收集鼻部拭子并且记录临床体征。从所有鼻部拭子中提取DNA。

[0287] 在疫苗接种后十四天，用BoHV-1攻击经接种和未接种的组两者。通过PCR得出在第14天，所有牛均对BoHV-1和E2转基因呈阴性。用BoHV-1毒株Q3932攻击来自两组的牛并且在另外5天后拭子。在疫苗接种后第18天，用溶血性曼氏杆菌攻击所有牛。如所预期的，通过PCR所有动物对E2转基因呈阴性。在所有动物中始终检测到了Q2932，然而，与未接种疫苗的动物相比，经疫苗接种动物有在更短时间中释放少量病毒的趋势。溶血性曼氏杆菌PCR测定有明显类似的趋势。

[0288] 在BoHV-1攻击后，每天对所有牛的临床体征进行评价。在第14至第18天未观察到临床体征。

[0289] 牛的血清学测试表明如所预期的，被BoHV-1攻击的所有牛在实验结束时针对BoHV-1进行了血清转化(表11)。

[0290] 表11

[0291]

[0292] 贯穿整个疫苗接种实验的不同阶段中受试牛针对牛疱疹病毒1型(BHV)或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学状态。使用用于检测针对HBV的血清抗体的Pourquier(注册商标)ELISA IBR-IPVSerum and Milk和用于检测针对BVDV的血清抗体的Pouriquier(注册商标)ELISA BVD-MD-BD P80Antibodies来测试来自所有牛的血清样品。BHV的特异性测试将确认先前被野生型BoHV-1或gmBoHV-1感染。BVDV特异性测试将确认先前被野生型BVDV感染，不能检测到对BVDV E2特异的抗体。

[0293] 针对BVDV或BoHV-1已存在的抗体无法阻止复制或从经接种的动物中回收gmBoHV-1疫苗病毒

[0294] 整体结果支持使用活病毒载体从其他病原体递送多个抗原。此外，结果显示宿主针于疫苗载体的免疫状态将不利地影响疫苗性能。

[0295] 实施例16

[0296] 毒力回复

[0297] 使用活病毒疫苗载体带来了亲本病毒毒力增大的固有风险，如果病毒从一个动物传播到另一个易受感染动物的话。为了研究是否其可能具有gmBoHV-1并且还为了评价进行基因修饰的稳定性，通过首次进行免疫的(针对BoHV-1和BVDV)牛将原型疫苗传代四次。与免疫接种实验平行进行这些传代实验。

[0298] 因为在疫苗接种后第3天始终检测到了gmBoHV-1并对其进行分离，所以此时分离的病毒用于后续传代。第一代来自第598号动物。

[0299] 然后使用对BoHV-1和E2转基因特异的实时PCR测定来测试从这些动物鼻部拭子中分离出的DNA，在第0天所有动物的两种分析均呈阴性。在经gmBoHV-1接种的动物中，在对所有动物疫苗接种2至7天后经由两种PCR测定一致检测到了病毒。在第3天从所有动物中分离病毒。

[0300] 在疫苗接种后7天期间，未在经接种的动物中观察到不良临床体征。在传代期间检测到了一些动物轻微升高的温度(>40℃)，然而，这些是偶发性的并且并未表现出与病毒的存在有关。

[0301] 如所期望的，在实验结束时大部分动物针对BoHV-1进行了血清转化。

[0302] 总之，未发现支持在传代实验期间gmBoHV-1毒力增大的证据。此外，转基因看起来是非常稳定的并且未发现通过任何传代损失的证据。

[0303] 传代实验的结果共同表明E2转基因在BoHV-1基因组内是稳定的。类似地，未发现gmBoHV-1回复突变至更加毒力的原型的证据。还通过检验来自再分离病毒的基因组DNA的限制性内切酶消化模式而研究了mBoHV-1的基因稳定性。

[0304] 实施例17

[0305] 过多剂量

[0306] 为了经济上的可行性，疫苗通常提供为多剂量制剂。如果以高于推荐剂量使用疫苗，则这些制剂可能的收回(drawn back)潜在不利地影响经接种动物。为了研究可能的不利影响，如果以高于推荐剂量施用gmBoHV-1，则进行其中用多种浓度的疫苗来接种牛的实验。

[0307] 在三个组的牛(四头/组)的各个鼻孔中接种106.5TCID50的gmBoHV-1(10×剂量)、105.5TCID50的gmBoHV-1(期望的有效剂量)或104.5TCID50的gmBoHV-1(0.1×期望的有效剂量)。在疫苗接种后，检测牛的临床体征并且每天采集鼻部拭子。然后使用对BoHV-1和E2转基因特异的实时PCR测定来测试从这些动物鼻部拭子中分离出的DNA。

[0308] 在经gmBoHV-1接种的动物中，在对所有动物疫苗接种2至7天后经由两种PCR测定始终检测到了病毒。尝试在第3天从所有动物中持续分离病毒。

[0309] 在疫苗接种后7天期间，在经接种的动物中未观察到不良临床体征。检测到了一些动物轻微升高的温度(>40℃)，然而，这些是偶发性的并且并未表现出与病毒的存在有关。

[0310] 如所期望的，在实验结束时大部分动物针对BoHV-1进行了血清转化。如可以期望的，在处理中经血清转化的更多动物有接受大量病毒的倾向。

[0311] 尚无证据证明动物接种高剂量gmBoHV-1的有害影响。在疫苗的较低剂量下，基于通过PCR检测和/或病毒分离检测鼻部拭子中病毒的能力，似乎疫苗吸收的效率较低。

[0312] 实施例18

[0313] gmBoHV-1的遗传稳定性

[0314] 在该实施例中，在原型疫苗通过牛连续传代期间通过检测分离自动物的疫苗株的基因特性来评价gmBoHV-1的遗传稳定性。

[0315] 该评价通过从被感染牛收集的鼻部拭子中第一次再分离gmBoHV-1来进行。为了证明牛中的重复传代不会不利地影响原型疫苗的遗传稳定性，这些分析在回收形式的连续传代病毒上进行。通过限制性内切酶消化来检测随机选择克隆的经分离和经克隆基因组，这是被普遍接受的用来评价疱疹病毒的遗传稳定性的方法。在两个限制性内切酶中，所用的第一酶是估计切割BoHV-1基因组12次的Hindlll并因此提供任意大规模基因组重排或重组事件的度量。所用第二酶为估计切割BoHV-1基因组45次的Sall并因此提供任意较小规模基因组重排或重组事件的度量。

[0316] 在接种疫苗后第3天和第7天，从收集的鼻部拭子中回收病毒并且测定限制特性。没有分别基于Hindll和Sall特性的明显大规模或更小规模重排。

[0317] 基于在牛中传代后分离的病毒的限制性内切酶的特性，没有任何基因可变性的证据。这些数据支持以下结论：在该研究中用于接种牛的gmBoHV-1高度稳定。

[0318] 本领域的技术人员将理解除非特别描述，否则本文的一些方面易于进行改变和修改。应理解这些方面包括所有这样的改变和修改。本文包括在本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，并包括任何两个或更多个步骤或特征的任何和所有的组合。

[0319] 参考文献

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