4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法及应用。以氨酪酸（GABA）为起始原料，经酯化保护、卡特缩合、氢氧化钠及钯碳氢化还原脱保护等反应，制得4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸，制备得到的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸主要用于氨酪酸原料及氨酪酸制剂中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量的检测，氨酪酸制剂包括氨酪酸注射液、氨酪酸氯化钠注射液和注射用氨酪酸等。本发明制备方法原料易得，反应条件简单，操作方便，产率和纯度高，适合于4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸在实验室及中试规模的产业化生产，产品性质稳定，适合于氨酪酸及相关制剂检查使用。

权利要求

1.一种4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）合成中间体1A-1：

称取GABA，用碱溶液溶解后，冰浴下5min内滴加氯甲酸苄酯，滴毕，撤去冰浴，20～

30℃反应1.5～2.5 h，用稀酸溶液调反应液pH至2，用乙酸乙酯萃取三次，合并酯层，酯层用饱和氯化钠洗一次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析得无色油状物，放置后析出白色固体，即1A-1；

原料GABA：氯甲酸苄酯：碱的摩尔比为1：1.2～1.8：2～3；

2）合成中间体1A-2：

将GABA、对甲苯磺酸、无水乙醇和甲苯混合均匀，加热至110℃，回流18～22 h，反应完成后，冷却至20～30℃，减压蒸除溶剂，得油状物，加入无水乙醚使溶解，于-18～-20℃放置20～24h，趁冷过滤，得白色固体，即1A-2；

原料GABA：对甲苯磺酸：无水乙醇：甲苯的摩尔比为1：1.1～1.3：1.4～1.8：9～10；

3）合成中间体2A：

将制得的1A-1和1A-2，溶解于乙腈中，然后加入Et3N 和卡特缩合剂，搅拌，于25～

35℃反应10～12h，然后加入反应液质量5～7倍的饱和碳酸氢钠水溶液，混合均匀，乙酸乙酯萃取3次，合并酯层，酯层依次用50g/L柠檬酸水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液洗至TLC检测无杂质点，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得无色油状物，静置0.5～2h至固体完全析出，过滤，得白色固体，即2A；

1A-1：1A-2：Et3N：卡特缩合剂的摩尔比为1：1：0.8：1；乙腈用量为1A-1和1A-2总质量的3~5倍；

4）合成中间体3A：

将步骤3）制得的2A，用体积比1:1:1的甲醇、THF和H2O的混合溶剂溶解，然后加入NaOH，搅拌，于25～35℃反应8～12h，反应完成后，减压蒸除有机溶剂后，用稀盐酸调pH至6～7，析出固体，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤，得白色固体，即3A；

2A与NaOH的摩尔比为1：1～2；混合溶剂用量为2A的质量10倍；

5）合成产物4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸：将步骤4）制得的3A用甲醇溶解后，加入Pd/C，然后用H2置换反应器内的空气，搅拌，于25～35℃反应30～40 h，反应完成后，滤除Pd/C，滤液减压蒸除溶剂，析出白色固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，得白色固体，即4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸；

3A与甲醇质量比为1:10。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的碱溶液为浓度1～

4mol/L的NaOH或KOH的水溶液；所述的稀酸溶液浓度为4～8mol/L的盐酸、硫酸或磷酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的碱溶液为3mol/L的NaOH水溶液；所述的稀酸溶液为6mol/L的盐酸。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的柱层析洗脱溶剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，石油醚与乙酸乙酯体积比为4:1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的乙酸乙酯用量为反应液体积的2倍，饱和氯化钠用量为酯层体积的1倍；步骤3）萃取时乙酸乙酯用量为反应液质量的30～50%。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的稀盐酸浓度为1mol/L。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）滤除Pd/C时用装有硅藻土的砂芯漏斗过滤。

8.权利要求1所述的制备方法制备得到的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的应用，其特征在于：用于氨酪酸原料及氨酪酸制剂中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量的检测。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：用于氨酪酸原料及氨酪酸制剂中

4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量的检测时，方法为：

1）溶液的制备

对照品溶液：取4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品采用水制备标准溶液，浓度为每1mL溶液中含20μg的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品；

供试品溶液：取供试品采用水制备供试品溶液，浓度为每1mL溶液中含4mg氨酪酸供试品；

流动相：包括A流动相和B流动相，A流动相与B流动相体积比为90：10；A流动相：取磷酸二氢钾l0.0g与己烷磺酸钠1.1g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至2.1； B流动相：甲醇；

系统适用性溶液：取氨酪酸对照品、α-吡咯烷酮对照品和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品，加水溶解并稀释制成每1mL溶液中含氨酪酸、α-吡咯烷酮和

4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸分别为0.4mg、4μg和20μg的溶液，作为系统适用性溶液；

2）色谱条件

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器，Alliance 色谱工作站；

色谱柱：Venusil MP C18柱，规格Ф4.6mm×250mm，孔径5μm；

流动相：检测波长为210nm，柱温30℃，流速1.0mL/min；

3）测定方法

取系统适用性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，再分别取供试品溶液和对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的含量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：检测时配制的溶液中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量不超过0.5% wt。

说明书

4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物制备技术领域，涉及4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法，还涉及其在氨酪酸及氨酪酸相关制剂（氨酪酸注射液、氨酪酸氯化钠注射液和注射用氨酪酸）中对有关物质检测的应用。

背景技术

[0002] 氨酪酸化学名γ-氨基丁酸，是一种氨基酸类药物，在体内与血氨结合生成尿素排出体外，有降低血氨及促进大脑新陈代谢的作用，用于治疗各种类型的肝昏迷，也用于脑卒后遗症、脑动脉硬化症、头部外伤后遗症及尿毒症、煤气中毒等所致的昏迷。在临床上主要以注射剂的形式供病人使用。目前国内外质量标准对其有关物质的控制比较简单，对其相关杂质研究的报道更是少之甚少。为了保证氨酪酸注射剂临床使用的安全性，我们对氨酪酸及相关制剂的有关物质进行了系统的研究，发现4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸是氨酪酸中最主要的杂质，与氨酪酸临床用药不良反应的发生有很大的关系。

[0003] 4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸又称氨酪酸杂质Ⅱ，分子式为C8H16N2O3，分子量为188.12，化学结构式如下：

[0004]

[0005] 氨酪酸杂质Ⅱ是一种白色的固体粉末，易溶于水，是氨酪酸合成过程中产生的二聚体，由于理化性质与氨酪酸相似，在氨酪酸纯化精制过程中很难被除去，是影响氨酪酸产品质量和安全性的潜在隐患。在氨酪酸有关物质研究领域，氨酪酸杂质Ⅱ的结构和检测方法均属首次提出，其制备方法和应用均未见国内外文献报道。

发明内容

[0006] 本发明目的在于，提供一种4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法。

[0007] 本发明还提供了制备得到的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的应用，可作为对照品，用于检测氨酪酸及氨酪酸制剂中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的含量检测，为氨酪酸及其制剂质量标准的提升及产品质量的安全性控制提供了技术支撑和物质保障，使氨酪酸国家标准处于世界领先水平，具有良好的经济效益和社会效益。

[0008] 本发明以氨酪酸（GABA）为起始原料，经酯化保护、卡特缩合、氢氧化钠及钯碳氢化还原脱保护等反应，制得4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸，其合成路线如下：

[0009]

[0010] 本发明4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：

[0011] 1）合成中间体1A-1：

[0012] 称取GABA，用碱溶液溶解后，冰浴下5min内滴加氯甲酸苄酯（Cbz-Cl)，滴毕，撤去冰浴，20～30℃反应1.5～2.5 h，用稀酸溶液调反应液pH至2，用乙酸乙酯萃取三次，合并酯层，酯层用饱和氯化钠洗一次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析得无色油状物，放置后析出白色固体，即1A-1；

[0013] 原料GABA：氯甲酸苄酯：碱的摩尔比为1：1.2～1.8：2～3；

[0014] 2）合成中间体1A-2：

[0015] 将GABA、对甲苯磺酸（TsOH)、无水乙醇和甲苯混合均匀，加热至110℃，回流18～22 h，反应完成后，冷却至20～30℃，减压蒸除溶剂，得油状物，加入无水乙醚使溶解，于-18～-20℃放置20～24h，趁冷过滤，得白色固体，即1A-2；

[0016] 原料GABA：对甲苯磺酸：无水乙醇：甲苯的摩尔比为1：1.1～1.3：1.4～1.8：9～10；

[0017] 3）合成中间体2A：

[0018] 将制得的1A-1和1A-2，溶解于乙腈中，然后加入Et3N 和卡特缩合剂（BOP），搅拌，于25～35℃反应10～12h，然后加入反应液质量5～7倍的饱和碳酸氢钠水溶液，混合均匀，乙酸乙酯萃取3次，合并酯层，酯层依次用5%(g/v)柠檬酸水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液洗至TLC检测无杂质点，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得无色油状物，静置0.5～2h至固体完全析出，过滤，得白色固体，即2A；

[0019] 1A-1：1A-2：Et3N：卡特缩合剂（BOP）的摩尔比为1：1：0.8：1；乙腈用量为1A-1和1A-2总质量的3~5倍；

[0020] 4）合成中间体3A：

[0021] 将步骤3）制得的2A，用体积比1:1:1的甲醇、THF和H2O的混合溶剂溶解，然后加入NaOH，搅拌，于25～35℃反应8～12h，反应完成后，减压蒸除有机溶剂后，用稀盐酸调pH至6～7，析出固体，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤，得白色固体，即3A；

[0022] 2A与NaOH的摩尔比为1：1～2；混合溶剂用量为2A的质量10倍；

[0023] 5）合成产物4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸：

[0024] 将步骤4）制得的3A用甲醇溶解后，加入Pd/C，然后用H2置换反应器内的空气，搅拌，于25～35℃反应30～40 h，反应完成后，滤除Pd/C，滤液减压蒸除溶剂，析出白色固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，得白色固体，即本发明4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸；

[0025] 3A与甲醇质量比为1:10。

[0026] 步骤1）所述的碱溶液为浓度1～4mol/L的NaOH或KOH的水溶液，优选3mol/L的NaOH水溶液；

[0027] 步骤1）所述的稀酸溶液浓度为4～8mol/L的盐酸、硫酸或磷酸等，优选6mol/L的盐酸；

[0028] 步骤1）所述的柱层析洗脱溶剂为石油醚/乙酸乙酯混合液，石油醚与乙酸乙酯体积比为4:1；

[0029] 步骤1）所述的乙酸乙酯用量为反应液体积的2倍，饱和氯化钠用量为酯层体积的1倍。

[0030] 步骤2）所述的反应完成判断标准为TLC检测不到GABA。

[0031] 步骤3）萃取时乙酸乙酯用量为反应液质量的30～50%。

[0032] 步骤4）所述的反应完成判断标准为TLC检测无原料；

[0033] 步骤4）所述的稀盐酸浓度优选1mol/L。

[0034] 步骤5）滤除Pd/C时用装有硅藻土的砂芯漏斗过滤。

[0035] 本发明制备得到的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的应用：主要用于氨酪酸原料及氨酪酸制剂中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量的检测，氨酪酸制剂包括氨酪酸注射液、氨酪酸氯化钠注射液和注射用氨酪酸等。

[0036] 本发明4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸用于氨酪酸原料及氨酪酸制剂中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量的检测时，方法为：

[0037] 1）溶液的制备

[0038] 对照品溶液：取4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品采用水制备标准溶液，浓度为每1ml溶液中含20μg的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品；

[0039] 供试品溶液：取供试品采用水制备供试品溶液，浓度为每1ml溶液中含4mg氨酪酸供试品；

[0040] 流动相：包括A流动相和B流动相，A流动相与B流动相体积比为90：10；A流动相：取磷酸二氢钾l0.0g与己烷磺酸钠1.1g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至2.1； B流动相：甲醇；

[0041] 系统适用性溶液：取氨酪酸对照品、α-吡咯烷酮对照品和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品，加水溶解并稀释制成每1ml溶液中含氨酪酸、α-吡咯烷酮（杂质A）和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸（杂质B）分别为0.4mg、4μg和20μg的溶液，作为系统适用性溶液；

[0042] 2）色谱条件

[0043] 仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器，Alliance 色谱工作站；

[0044] 色谱柱：Venusil MP C18柱，规格Ф4.6mm×250mm，孔径5μm；

[0045] 流动相：检测波长为210nm，柱温30℃，流速1.0ml/min；

[0046] 3）测定方法

[0047] 取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，再分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的含量。

[0048] 本方法检测时配制的溶液中4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量不超过0.5% (wt)。

[0049] 取系统适用性溶液检测时，氨酪酸峰与α-吡咯烷酮峰和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸峰的分离度均应符合要求，理论板数按氨酪酸峰计算应不低于3000。

[0050] 本发明4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的制备方法及应用，其有益效果为：

[0051] 1）制备方法原料易得，反应条件简单，操作方便，产率和纯度高，适合于4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸在实验室及中试规模的产业化生产。

[0052] 2）制备得到的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸性质稳定，适合于氨酪酸及相关制剂（氨酪酸注射液、氨酪酸氯化钠注射液和注射用氨酪酸）有关物质检查使用。

附图说明

[0053] 图1为实施例1的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的1H-NMR谱图；

[0054] 图2为实施例1的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的13C-NMR谱图；

[0055] 图3为实施例1的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的高分辨质谱图；

[0056] 图4为氨酪酸有关物质检查的系统适用性试验色谱图；

[0057] 图5为实施例1的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的高效液相色谱图；

[0058] 图6为氨酪酸有关物质检查的典型高效液相色谱图。

具体实施方式

[0059] 实施例1

[0060] 1）合成中间体1A-1：

[0061] 称取GABA（2.0 g，19.4mmol），用20mL 3mol/LNaOH溶解，冰浴下5min内缓缓滴入氯甲酸苄酯（4mL，28mmol），滴毕，撤去冰浴；25℃反应2 h；用6mol/LHCl调pH至2，析出大量油状物，将反应液置于分液漏斗中，用反应液2倍体积的乙酸乙酯萃取三次，合并酯层，用酯层1倍体积的饱和氯化钠溶液洗酯层一次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析（石油醚/乙酸乙酯=4:1），得无色油状物，放置后析出白色固体3.4g，即1A-1。

[0062] C12H15NO41H-NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ(ppm): 12.039(s, 1H), 7.384 ～7.268(m, 5H), 5.005(s, 2H), 3.006(q, J=6.8 Hz, 2H ), 2.215(t, J= 7.6 Hz, 2H),
1.658～1.586(m, 2H).

[0063] 2）合成中间体1A-2：

[0064] 100mL茄型瓶中加入GABA （5.2g，50mmol），对甲苯磺酸（TsOH)（10.0g，58mmol），无水乙醇5mL及甲苯50mL，混合均匀，加热至110℃，回流20h，TLC监测至反应完全，停止反应。冷却至25℃，减压蒸除溶剂，加入无水乙醚150mL，于-19℃放置22h，趁冷过滤，得白色固体14.7g，即1A-2。

[0065] 3）合成中间体2A：

[0066] 称取1A-1（2.0g，8.4mmol）和1A-2（2.5g，8.4mmol）于100mL茄型瓶中，加入乙腈10ml溶解，加入Et3N 6mL和卡特缩合剂（BOP）(3.7g，8.4mmol)，于30℃反应11h，反应液用饱和碳酸氢钠溶液稀释至100ml，混合均匀，用30ml乙酸乙酯萃取3次，合并酯层，酯层依次用浓度为5%(g/v)柠檬酸、水、饱和碳酸氢钠溶液洗至TLC检测无杂质点，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得无色油状物，静置1.5h至固体完全析出，过滤，得白色固体，即2A。

[0067] C18H26N2O51H-NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ(ppm): 7.794(t, J= 5.6 Hz, 1H),7.384～7.244(m, 6H), 5.004(s, 2H), 4.042(q, J= 7.2Hz, 2H), 3.107～2.951(m,
4H), 2.279(t, J= 7.6 Hz, 2H),2.055(t, J= 7.6 Hz, 2H), 1.667～1.578(t, J= 7.2 Hz, 3H).

[0068] 4）合成中间体3A：

[0069] 将步骤3）产物2A用体积比1:1:1的甲醇、THF和H2O的混合溶剂溶解，混合溶剂用量为2A的质量10倍，然后加入NaOH固体（1.0g，25mmol），搅拌，于30℃反应10h，反应完成后，即TLC检测无原料，停止反应。减压蒸除有机溶剂后，用1mol/LHCl调pH至6～7，析出大量白色固体，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤，得白色固体，即3A。

[0070] C16H22N2O51H-NMR(400MHz,DMSO-d6) δ(ppm): 12.056(s, 1H), 7.817(t, J= 4.4 Hz, 1H), 7.384～7.250(m, 6H), 5.002(s, 2H), 3.052～3.2.947(m, 4H), 2.198(t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.052(t, J= 7.6 Hz, 2H), 1.646～1.562(m, 4H).

[0071] 5）合成产物4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸：

[0072] 将步骤4）制得的3A用甲醇溶解后，3A与甲醇质量比为1:10，加入Pd/C 100mg，然后抽出容器内的空气后充入H2，搅拌，于30℃反应36h，反应完成后，用装有硅藻土的砂芯漏斗滤去Pd/C，取滤液，减压蒸除溶剂，析出白色固体；过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，得白色固体，即本实施例4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸。

[0073] C8H16N2O31H-NMR(400MHz,D2O-d2) δ(ppm): 3.091(t, J= 6.8 Hz, 2H),2.906(t, J= 7.6 Hz, 2.256(t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.094(t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.880～
13
1.805(m, 2H), 1.685～1.614(m, 2H). C-NMR(400MHz, D2O-d2) δ(ppm)：182.60(C1),
174.68(C5), 39.21(C8), 38.79(C4), 34.84(C6), 32.56(C2), 25.28(C7), 23.07(C3).+
HRMS m/z calcd for C8H17N2O3 [M +H]:189.1239, found 189.1191.

[0074] 实施例2

[0075] 1）合成中间体1A-1：

[0076] 称取GABA（1.0g，9.7mmol），用10mL 3mol/LNaOH溶解，冰浴下5min内缓缓滴入氯甲酸苄酯（1.5mL，10.5mmol），滴毕，撤去冰浴；25℃反应2 h；用6mol/LHCl调pH至2，析出大量油状物，将反应液置于分液漏斗中，用反应液2倍体积的乙酸乙酯萃取三次，合并酯层，用酯层1倍体积的饱和氯化钠溶液洗酯层一次后，用无水硫酸钠干燥，柱层析（石油醚/乙酸乙酯=4:1），得无色油状物，放置后析出白色固体1.1g，即1A-1。

[0077] C12H15NO41H-NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ(ppm): 12.039(s, 1H), 7.384 ～7.268(m, 5H), 5.005(s, 2H), 3.006(q, J=6.8 Hz, 2H ), 2.215(t, J= 7.6 Hz, 2H),
1.658～1.586(m, 2H).

[0078] 步骤2）～5）同实施例1

[0079] 实施例3

[0080] 步骤1）～4）同实施例1

[0081] 5）合成产物4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸：

[0082] 将步骤4）制得的3A用甲醇溶解后，3A与甲醇质量比为1:10，加入Pd/C 100mg，然后抽出容器内的空气后充入H2，搅拌，于30℃反应30h，反应完成后，用装有硅藻土的砂芯漏斗滤去Pd/C，取滤液，减压蒸除溶剂，析出白色固体；过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，得白色固体，即本实施例4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸。

[0083] C8H16N2O31H-NMR(400MHz,D2O-d2) δ(ppm): 3.091(t, J= 6.8 Hz, 2H),2.906(t, J= 7.6 Hz, 2.256(t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.094(t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.880～
13
1.805(m, 2H), 1.685～1.614(m, 2H). C-NMR(400MHz, D2O-d2) δ(ppm)：182.60(C1),
174.68(C5), 39.21(C8), 38.79(C4), 34.84(C6), 32.56(C2), 25.28(C7), 23.07(C3).+
HRMS m/z calcd for C8H17N2O3 [M +H]:189.1239, found 189.1191.

[0084] 本发明制备得到的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的应用：

[0085] 实验组：氨酪酸及其制剂有关物质的测定，使用本发明实施例1制备的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸作对照品。

[0086] 1）对照品、供试品与试剂

[0087] 对照品：氨酪酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：140723-200501）[0088] α-吡咯烷酮（东北制药集团股份有限公司提供）

[0089] 4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸（本发明提供，含量99%）

[0090] 供试品剂型：氨酪酸原料、氨酪酸氯化钠注射液、注射用氨酪酸、氨酪酸注射液[0091] 试剂：甲醇（色谱纯），磷酸二氢钾（化学纯）、己烷磺酸钠、超纯水。

[0092] 2）溶液的制备

[0093] 供试品溶液：分别取供试品（相当于氨酪酸0.2g），置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

[0094] 对照品溶液：取4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸对照品，加水溶解并稀释制成每1ml中约含20μg的溶液。

[0095] 系统适用性溶液：取氨酪酸对照品、α-吡咯烷酮（杂质A）和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸（杂质B），精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含氨酪酸、α-吡咯烷酮（杂质A）和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸（杂质B）分别为0.4mg、4μg和20μg的溶液，作为系统适用性溶液。

[0096] 3）色谱条件

[0097] 仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器，Alliance 色谱工作站，柱温箱。色谱柱：Venusil MP C18柱4.6mm×250mm 5μm，流动相：以磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾l0.0g与己烷磺酸钠1.1g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至2.1）-甲醇（90：10）为流动相，检测波长为210nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。

[0098] 4）测定法

[0099] 取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，氨酪酸峰与α-吡咯烷酮峰和4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸峰的分离度均应符合要求，理论板数按氨酪酸峰计算应不低于3000。再分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸的含量，4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸不得过0.5%。

[0100] 5）测定结果，见表1

[0101] 对照组：氨酪酸及其制剂有关物质的测定（未使用本发明制备的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸作对照品）

[0102] 1）对照品、样品与试剂

[0103] 样品：氨酪酸、氨酪酸氯化钠注射液、注射用氨酪酸、氨酪酸注射液[0104] 试剂：甲醇（色谱纯），磷酸二氢钾（化学纯）、己烷磺酸钠、超纯水。

[0105] 2）溶液的制备

[0106] 供试品溶液：取样品适量（相当于氨酪酸0.2g），置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

[0107] 对照溶液：取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

[0108] 3）色谱条件

[0109] 仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器，Alliance 色谱工作站，柱温箱。色谱柱：Venusil MP C18柱4.6mm×250mm 5μm，流动相：以磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾l0.0g与己烷磺酸钠1.1g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至2.1）-甲醇（90：10）为流动相，检测波长为210nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。

[0110] 4）测定法

[0111] 分别取供试品溶液和对照品溶液各10μl，按照上述3）色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液如有杂质峰，其峰面积不得大于对照品溶液的峰面积（2.0%）。

[0112] 5）测定结果，见表1。

[0113] 表1 实验组和对照组不同供试品测定结果

[0114]

[0115] 据表1可知，采用本发明产品的优点在于控制氨酪酸相关产品中的4-(N-(4-氨基丁酰基))-氨基丁酸含量，杂质控制方法更科学，杂质控制精度提高，杂质含量更接近真实值。