片段缩合制备利拉鲁肽的方法

摘要

本发明公开了一种片段缩合制备利拉鲁肽的方法，固相合成4个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护利拉鲁肽直链多肽，脱去第20位Lys的侧链保护，并完成修饰，形成全保护利拉鲁肽，然后裂解脱除保护基得到利拉鲁肽粗肽，纯化换盐得到利拉鲁肽；其中，所述的4个肽片段序列为：第一肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第1‑8位氨基酸，第二肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第9‑16位氨基酸，第三肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第17‑26位氨基酸，第四肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第27‑31位氨基酸。本发明方法，提高了产率，大幅降低了合成成本，利于大规模、产业化生产。

权利要求

1.片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，固相合成4个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护利拉鲁肽直链多肽，脱去第20位Lys的侧链保护，并完成修饰，形成全保护利拉鲁肽，然后裂解脱除保护基得到利拉鲁肽粗肽，纯化换盐得到利拉鲁肽；

其中，所述的4个肽片段序列为：

第一肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第1-8位氨基酸，

第二肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第9-16位氨基酸，

第三肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第17-26位氨基酸，

第四肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第27-31位氨基酸；

所述的方法包括以下步骤：

(1)分别固相合成侧链保护的第一～第四肽片段序列，并从树脂上裂解；

(2)将侧链保护的第四肽片段序列羧基端修饰保护，并脱去其氨基保护基；

(3)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第三肽片段序列偶联得到侧链保护的第五肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

(4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第五肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第六肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

(5)将脱去氨基保护基的侧链保护的第六肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的利拉鲁肽直链多肽；

(6)将全保护的利拉鲁肽直链多肽脱去第20位Lys的侧链保护，并完成修饰得到全保护利拉鲁肽；

(7)将全保护的利拉鲁肽裂解脱除保护基得到利拉鲁肽粗肽；

(8)利拉鲁肽粗肽经纯化换盐得到利拉鲁肽。

2.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一至第四肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂；

侧链保护的第一至第四肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物。

3.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(2)中，所使用的羧基端保护试剂为0.5M的2Cl-Trt Cl的DCM溶液或者CHCl3与TFE与TBTA按照体积比7∶

2∶1的混合物。

4.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。

5.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(3)、(4)、(5)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合。

6.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，脱去Lys侧链保护ivDde的试剂为水合肼与DMF按照体积比1∶15的混合物。

7.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，Lys侧链修饰的方法为先加入Fmoc-Glu-OtBu缩合；然后脱去Fmoc基团，所用试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；最后再与棕榈酸缩合。

8.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(7)中，全保护利拉鲁肽裂解的裂解液为TFA与H2O按体积比95∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80∶5∶5∶5∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5∶2.5∶

2.5∶2.5的混合溶液。

9.根据权利要求1所述的片段缩合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(8)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐；流动相为醋酸水溶液和乙腈溶液。

说明书

片段缩合制备利拉鲁肽的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及制药领域，具体地说，涉及片段缩合制备利拉鲁肽的方法。

背景技术

[0002] 利拉鲁肽，英文名liraglutide，是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，序列为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-ɑ-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，分子式：C172H265N43O51，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖作用，能够通过降低2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖而改善血糖控制，同时能够降低患者体重。

[0003] 目前利拉鲁肽的合成方法如专利CN102286092、专利CN103145828、专利CN103288951、专利CN103304660和专利CN103980358是利用Fmoc策略固相法依次连接合成利拉鲁肽。该方法氨基酸逐个偶联合成周期长，逐步偶联时树脂收缩严重、反应不完全、产生缺陷肽，固相载体选用的取代值限制，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难。

[0004] 专利CN102875665、专利CN104045705、专利CN104045706、专利CN103275208、专利CN103304659、专利CN103864918和专利CN104004083采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是1.5-3.5倍过量，严重浪费肽片段，造成合成成本很高；同时固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。

[0005] 其他专利公开了基因重组生产利拉鲁肽，然而基因表达有着工作量大、三废严重、技术难度大、生产成本高等缺点。

[0006] 所以本领域技术人员仍然期待以高产品收率、低合成成本获得具有良好品质产品的方法，尤其是降低成本、减少废液产生的新方法，对于大规模、产业化生产是非常必要和重要的。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对现有方法合成收率低、生产成本高、产生废液多、产品纯化难、不能低成本高效率得到高纯度的利拉鲁肽的缺点，提供一种片段缩合制备利拉鲁肽的方法。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0009] 片段缩合制备利拉鲁肽的方法，固相合成4个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护利拉鲁肽直链多肽，脱去第20位Lys的侧链保护，并完成修饰，形成全保护利拉鲁肽，然后裂解脱除保护基得到利拉鲁肽粗肽，纯化换盐得到利拉鲁肽；

[0010] 其中，所述的4个肽片段序列为：

[0011] 第一肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第1-8位氨基酸，

[0012] 第二肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第9-16位氨基酸，

[0013] 第三肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第17-26位氨基酸，

[0014] 第四肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第27-31位氨基酸。

[0015] 上述片段缩合制备利拉鲁肽的方法，优选包括以下步骤：

[0016] (1)分别固相合成侧链保护的第一～第四肽片段序列，并从树脂上裂解；

[0017] (2)将侧链保护的第四肽片段序列羧基端修饰保护，并脱去其氨基保护基；

[0018] (3)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第三肽片段序列偶联得到侧链保护的第五肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

[0019] (4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第五肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第六肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

[0020] (5)将脱去氨基保护基的侧链保护的第六肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的利拉鲁肽直链多肽；

[0021] (6)将全保护的利拉鲁肽直链多肽脱去第20位Lys的侧链保护，并完成修饰得到全保护利拉鲁肽；

[0022] (7)将全保护的利拉鲁肽裂解脱除保护基得到利拉鲁肽粗肽；

[0023] (8)利拉鲁肽粗肽经纯化换盐得到利拉鲁肽。

[0024] 步骤(1)中，侧链保护的第一至第四肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。

[0025] 侧链保护的第一至第四肽片段序列固相合成中，

[0026] 所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。

[0027] 所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。

[0028] 所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、或者体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物，优选体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液。

[0029] 步骤(1)中，具体的固相合成方法，为本领域技术人员的常规技术手段。

[0030] 步骤(2)中，所使用的羧基端保护试剂为0.5M的2Cl-Trt Cl的DCM溶液或者CHCl3与TFE与TBTA按照体积比7:2:1的混合物，优选为CHCl3与TFE与TBTA按照体积比7:2:1的混合物。

[0031] 步骤(2)、(3)、(4)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。优选体积百分含量为16％哌啶的DMF溶液。

[0032] 步骤(3)、(4)、(5)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。待偶联的羧基端与氨基端的摩尔比是0.95～1.05:1。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1:1。偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。

[0033] 步骤(6)中，脱去Lys的ε-氨基保护基ivDde的试剂为水合肼与DMF按照体积比1:15的混合物。

[0034] 步骤(6)中，Lys侧链修饰的方法为先加入ε-氨基端4倍摩尔量的Fmoc-Glu-OtBu缩合；然后脱去Fmoc基团，所用试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液，优选为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液；最后再与棕榈酸缩合。

[0035] 步骤(7)中，全保护利拉鲁肽裂解的裂解液为TFA与H2O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液，优选TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。

[0036] 步骤(8)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐；即色谱柱为C18柱；流动相为体积百分比0.25％醋酸的水溶液和乙腈。

[0037] 本发明使用酸敏感树脂进行各个肽片段的固相合成，树脂取代值高，氨基酸1.5-2倍投量，物料成本低。合成的肽片段纯度高，不必进行HPLC纯化，即可进行液相反应，减少了后处理的步骤，减少了废液产生。多个片段可以同时合成，节约合成时间，缩短合成周期。片段缩合采用液相体系，羧基端片段的投量仅为氨基端片段0.95-1.05倍，不会造成片段的浪费，大大降低了成本，而未反应的片段均可通过合适的反应体系通过萃取清除，后处理简单、快捷。并且液相片段缩合没有了固相片段缩合存在的树脂取代值限制的问题，物料通量增加，减少了废液产生。在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺陷肽，而是未缩合的片段，不会造成纯化困难的问题。所以本发明的特点是高通量、低成本、废液少、效率高、纯化易，非常适合大规模、产业化生产。

[0038] 本发明所涉及的目标肽(利拉鲁肽)及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表l。本发明中所使用的物料缩写的含义见表2。

[0039] 表1利拉鲁肽相应的编码氨基酸序列

[0040]

[0041] 表2本发明所使用的物料缩写含义

[0042]英文缩写 全称
Fmoc- 9-芴甲氧羰基
2-CTC Resin 2-氯-三苯甲基氯树脂
RP-HPLC 反相高效液相色谱
DMF N,N-二甲基甲酰胺
NMP N-甲基吡咯烷酮
DMSO 二甲基亚砜
DCM 二氯甲烷
THF 四氢呋喃
DBU 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DIEA N,N-二异丙基乙胺
HOBt 1-羟基苯并三氮唑
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
PyBOP 六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
EDC 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
TFE 三氟乙醇
EDT 1,2-乙二硫醇
TIS 三异丙基硅烷
Boc- 叔丁氧羰基
-Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
-tBu 叔丁基
-Trt 三苯甲基
-ivDde 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基

[0043]TBTA 叔丁基2,2,2-三氯乙酸亚胺酯
MTBE 甲基叔丁基醚

[0044] 有益效果：本发明相对现有技术具有以下优点：

[0045] 1、本发明利用较高荷载量的酸敏感树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相偶联技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(﹥99％)、高收率(﹥39％)的目标肽。

[0046] 2、相比较连续固相合成利拉鲁肽的工艺，本发明每个片段可使用高荷载量的固相载体，没有逐个缩合氨基酸数目过多造成的树脂取代值限制，物料通量增加，废液排放减少；片段缩合，各个肽片段合成可以同时进行，大大缩短了合成时间。

[0047] 3、相比较固相片段缩合合成利拉鲁肽的工艺，本发明利用液相片段缩合，片段摩尔比为0.95-1.05倍量，远低于固相片段缩合合成片段的1.5-3.5倍过量，节约物料成本；而未反应的片段均可通过合适的反应体系通过萃取清除，后处理简单、快捷。

[0048] 4、采用超酸敏感型树脂合成的10个或10个以下氨基酸的侧链保护肽片段序列纯度非常高，不必用色谱技术纯化，只需要进行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其杂质主要为未偶合的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，并且未偶合的片段可以通过合适的溶剂体系萃取去除，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从而减少制备次数，降低了利拉鲁肽的制备成本。

[0049] 本发明具有高通量、低成本、废液少、效率高、纯化易的特点，有利于实现规模化、产业化生产。

附图说明

[0050] 图1为本发明制备的利拉鲁肽质谱图。

具体实施方式

[0051] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0052] 实施例1：

[0053] 1.树脂制备

[0054] 1.1制备Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(10g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用100mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的50mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇20mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×80mL DMF、3×
80mL DCM、3×80mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得11.44g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.55mmol/g。

[0055] 1.2制备Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用60mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Leu-OH(1.2eq)和DIEA(2.5eq)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇
10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mL DMF、3×
50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得5.72g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.45mmol/g。

[0056] 1.3制备Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用60mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得5.87g Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.5mmol/g。

[0057] 2.固相片段制备

[0058] 2.1肽片段Boc-AA(1-8)-OH的制备：

[0059] 向肽反应室中加入5g Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

[0060] 同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

[0061] 依次用Fmoc-保护的氨基酸Phe、Thr(tBu)、Gly、Glu(OtBu)、Ala以及Boc-His(Trt)-OH各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.29g树脂结合肽。

[0062] 用150mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约20mL体积，然后用10mL DMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.36g纯度97％Boc-AA(1-8)-OH，产率95％。

[0063] 2.2肽片段Fmoc-AA(9-16)-OH的制备：

[0064] 向肽反应室中加入5g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

[0065] 同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

[0066] 依次用Fmoc-保护的氨基酸Leu、Tyr(tBu)、Ser(tBu)、Ser(tBu)、Val和Asp(OtBu)各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.48g树脂结合肽。

[0067] 用150mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约20mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.59g纯度96％Fmoc-AA(9-16)-OH，产率95％。

[0068] 2.3肽片段Fmoc-AA(17-26)-OH的制备：

[0069] 向肽反应室中加入5g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

[0070] 同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Trp(Boc)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

[0071] 依次用Fmoc-保护的氨基酸Ala、Ile、Phe、Glu(OtBu)、Lys(ivDde)、Ala、Ala和Gln(Trt)各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得9.17g树脂结合肽。

[0072] 用150mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约20mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.28g纯度95％Fmoc-AA(17-26)-OH，产率95％。

[0073] 2.4肽片段Fmoc-AA(27-31)-OH的制备：

[0074] 向肽反应室中加入5g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

[0075] 同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。

[0076] 依次用Fmoc-保护的氨基酸Gly、Arg(Pbf)和Val各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.31g树脂结合肽。

[0077] 用150mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约20mL体积，然后用10mL DMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.39g纯度98％Fmoc-AA(27-31)-OH，产率97％。

[0078] 3.液相片段缩合过程

[0079] 3.1制备H-AA(27-31)-OtBu

[0080] 圆底烧瓶中加入1.27g Fmoc-AA(27-31)-OH(1mmol)，加入CHCl3:TFE:TBTA＝7:2:1溶液25mL，加温至35℃磁力搅拌1小时，加入100mL冷MTBE沉淀产物，搅拌1小时，真空过滤收集固体，用2×100mL MTBE洗涤，干燥，得到Fmoc-AA(27-31)-OtBu。然后加入20mL DMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入100mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到1.083g H-AA(27-31)-OtBu，收率98％。

[0081] 3.2制备H-AA(17-31)-OtBu

[0082] 圆底烧瓶中加入1.85g Fmoc-AA(17-26)-OH(0.92mmol)、1.07g H-AA(27-31)-OtBu(0.97mmol)和124mg HOBt(0.92mmol)。将所述固体溶解于30mL DMF，加入305μL DIEA(1.84mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入349mg HBTU(0.92mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌4小时。加入200mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×200mL水洗涤，在室温下用200mL乙腈研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得Fmoc-AA(17-31)-OtBu。再加入30mL DMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入200mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到2.56g H-AA(17-31)-OtBu，收率97％。

[0083] 3.3制备H-AA(9-31)-OtBu

[0084] 圆底烧瓶中加入1.27g Fmoc-AA(9-16)-OH(0.92mmol)、2.53g H-AA(17-31)-OtBu(0.88mmol)和124mg HOBt(0.92mmol)。将所述固体溶解于35mL DMF，加入305μL DIEA(1.84mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入349mg HBTU(0.92mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌6小时。加入200mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×200mL水洗涤，2×200mL MTBE洗涤，在室温下用200mL乙腈研磨3小时，真空过滤收集，干燥获得Fmoc-AA(9-31)-OtBu。再加入40mL DMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应4小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入200mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到3.33g H-AA(9-31)-OtBu，收率97％。

[0085] 3.4制备Boc-AA(1-31)-OtBu

[0086] 圆底烧瓶中加入1.23g Boc-AA(1-8)-OH(0.87mmol)、3.32g H-AA(9-31)-OtBu(0.83mmol)和117mg HOBt(0.87mmol)。将所述固体溶解于50mL DMF，加入288μL DIEA(1.74mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入330mg HBTU(0.87mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌8小时。加入300mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×300mL水洗涤，2×300mL MTBE洗涤，干燥获得4.47g粗品Boc-AA(1-31)-OtBu。在室温下用300mL乙腈研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得
4.3g Boc-AA(1-31)-OtBu，收率96％。

[0087] 3.5合成全保护利拉鲁肽

[0088] 圆底烧瓶中加入4.27g Boc-AA(1-31)-OtBu(0.79mmol)，加入50mL水合肼:DMF＝1:15的混合溶液，反应3小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，300mL MTBE洗涤2遍，过滤沉淀，干燥，得到4.06g脱去ivDde的产物。加入1.28g Fmoc-Glu-OtBu(3mmol)、405mg HOBt(3mmol)溶于50mL DMF，再加入992μL DIEA(6mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入1.14g HBTU(3mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌8小时。加入300mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×300mL水洗涤，2×300mL MTBE洗涤，在室温下用300mL乙腈研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥。然后加入50mL DMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入
300mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到4.05g产物。再加入
770mg棕榈酸(3mmol)，50mL DMF，搅拌8小时。加入300mLMTBE从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×300mLMTBE、2×300mL水洗涤，干燥获得4.34g全保护利拉鲁肽，收率
95％。

[0089] 4.利拉鲁肽的裂解及纯化

[0090] 4.1通过去除侧链保护制备利拉鲁肽粗肽

[0091] 圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇(92.5:2.5:2.5:2.5)溶液60mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入2g全保护利拉鲁肽。在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解(约5分钟)，然后升至室温，搅拌3小时。旋转浓缩，将该溶液加入0℃乙醚200mL沉淀所述肽。离心，沉淀2×200mL乙醚洗涤，然后将固体溶解于含有1％乙酸的1:1水/乙腈50mL中，冷冻干燥获得1.26g利拉鲁肽粗肽，产率98％。

[0092] 4.2 HPLC纯化利拉鲁肽粗肽

[0093] 50mg利拉鲁肽粗肽经制备型HPLC纯化产生利拉鲁肽纯品24.4mg，纯度99％，产率49％。

[0094] HPLC纯化条件：色谱柱：Waters C18 250×19,5u,130A；流速：8mL/min；检测：UV，220nm；流动相：A.乙腈；B.0.25％醋酸/水；方法：20％-30％A，10min；30-60％A，40min。