抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用

摘要

本发明公开了抗药性稗草中的1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用。该抗药性稗草中的1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸氧化酶，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该抗药性稗草中的1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸氧化酶及其编码基因在培育抗除草剂转基因品种中的应用。

权利要求

1.抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，其特征是：该氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的编码基因，其特征是：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的编码基因，其特征是：所述编码基因的开放阅读框为自SEQ ID NO：1的5’端第60位到第995位碱基。

4.权利要求1所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因在培育抗除草剂转基因品种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗除草剂转基因品种为抗激素类除草剂转基因品种。

6.根据权利要求4所述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因的应用，包括提取抗药性稗草总RNA及制备抗药性稗草cDNA模板，重组质粒的构建，转化重组质粒到水稻中，其特征是，在重组质粒的构建步骤中，以抗药性稗草cDNA为模板，通过PCR反应获得含有抗药性稗草中1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的DNA片段的扩增序列，引物的核苷酸序列为：正向引物：5’-GGTATATAAGATCTATGGTGGTTCCAGTGAT-3’，反向引物：5’-GGCTCTCAGGTGACCTTAAGCCGCCGGAG-3’，质粒pCAMBIA1304为表达载体质粒，表达载体含有启动子，所述启动子为35S启动子。

说明书

抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、

突变位点与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及稗草抗药性相关基因及其应用，特别涉及抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用，属于植物生物技术领域。

背景技术

[0002] 据申请人所知，稗草(Echinochloa)是一年生禾本科稗属植物的总称，目前全世界已发现约有35种稗草，生长在热带或亚热带地区，其中我国发现有8种稗草(Chen&Philips,2006)。作为全球十大农田恶性抗性杂草之一，稗草已对很多类型的除草剂产生了抗药性(Heap I,2015)。目前，稗草对除草剂产生抗药性的机理研究主要侧重于除草剂作用靶标蛋白位点突变和非靶标蛋白位点突变。

[0003] 20世纪40年代以前研究人员就发现，乙烯是植物体内重要的天然激素，不仅具有催熟作用，而且还是一种内源生长调节剂，在生理上对植物生长和发育的许多方面都有影响，它影响的过程包括：种子萌发，根和茎的生长，花的发育，花、叶的衰老和脱落，果实的成熟。后来的研究表明，乙烯也参与调节了植物一系列对应于生物和非生物胁迫的反应，例如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等，另外乙烯也参与了植物程序性死亡和DNA降解。Adams D O等(1979)以苹果组织为研究对象，发现了高等植物体内乙烯的生物合成途径：甲硫氨酸(Met)→S-腺苷甲硫氨酸(SAM)→1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)→乙烯(ET)。Yang S F等(1979)对芹菜和番茄等16种蔬菜的根、茎、叶、花和果实的组织进行培养试验，发现1-氨基环丙烷-1-羧酸能显著增加植物组织中乙烯的生成量，肯定了乙烯的生物合成途径，也证明了1-氨基环丙烷-1-羧酸是一种有效的生长调节剂。另外，Cameron A C等(1979)研究发现，催化SAM向ACC转化的酶叫ACC合成酶(ACS)，催化ACC向乙烯转化的酶称为ACC氧化酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，简称ACO)。从合成途径中可以看出，1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)是乙烯合成过程中的一个重要的中间产物，在有氧条件下，ACC在ACC氧化酶的催化下形成乙烯，该反应由ACC氧化酶催化，是乙烯生物合成的关键步骤之一。

[0004] 随着除草剂的长期使用，稗草对常用的除草剂—二氯喹啉酸的敏感性正在逐年下降。前面有人研究认为稗草对二氯喹啉酸产生抗药性与吸收、传导、代谢无关，而与乙烯的合成途径变化有密切关系。Yasuor等(2012)在研究卡里福利亚水稗(Echinochloa phyllopogon)的抗二氯喹啉酸机制中也发现，敏感生物型中乙烯产量比抗性生物型中乙烯产量要多。国内也研究了西来稗(Echinochloa crus-galli var.zelayensis)对二氯喹啉酸的抗性机制，四个西来稗抗性生物型中的乙烯、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的水平比敏感性生物型中低，且抗性生物型中ACC合成酶和ACC氧化酶的活性比敏感性生物型中低，表明了乙烯生物合成途径的抑制导致了西来稗抗药性的产生(Xu et al.,2013)。

[0005] 经检索发现，公开号为CN100393874C的中国专利公开了类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因，特别涉及类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因在棉花纤维生产中的应用，该专利中的基因编码一个类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，具有乙烯合成酶(ACO)的功能，在棉花纤维发育的起始开始转录，并在伸长期大量转录，在棉花纤维组织中大量表达，显著提高了纤维生长速度和长度，说明了乙烯合成数量与纤维长度的正相关性。

[0006] 由于抗衰老和保鲜的生产需要，花卉和水果例如康乃馨、番茄等植物中ACO基因特征及其表达的研究已取得了很大的进展。然而，在禾本科植物中有关ACO的研究报道相对较少。迄今为止，ACO基因未见从稗草中克隆，且从基因水平来阐述乙烯生物合成途径对稗草抗药性的影响也未见报道。

发明内容

[0007] 本发明所要实现的发明目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因、突变位点与应用。

[0008] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

[0009] 一种抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：3所示。

[0010] 序列表中的序列3的蛋白质由311个氨基酸残基组成，存在DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy两个结构域。

[0011] 上述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的编码基因也属于本发明的保护范围，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0012] 序列表中的序列1编码序列表中SEQ ID NO：3蛋白质序列的DNA，其核苷酸序列长度为1000bp，该基因的开放阅读框为自序列1的5’端第60位到第995位碱基，编码区长度为936bp。

[0013] 上述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶功能区域的所有突变位点均属于本发明的保护范围。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的功能区域包括蛋白保守结构域DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy；1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸突变位点为F98→Y，G101→D，Q206→R，G270→V，A272→G，其中氨基酸突变位点F98→Y，G101→D和Q206→R处于蛋白保守结构域DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy中；与氨基酸突变相对应的碱基突变位点为T293→A，G302→A，A617→G，G809→T，C815→G。

[0014] 本发明以二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草为研究材料，分别提取二者的总RNA，并利用反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)克隆得到稗草中1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(简称EcACO)的编码基因，在PCR扩增步骤中，引物的核苷酸序列为：

[0015] 引物EcACO-F：5’-CAGTTGCACAGAGACATTTCAC-3’

[0016] 引物EcACO-R:5’-TTACTTTAAGCCGCCGGAGAT-3’。

[0017] 其中，敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：4所示，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，该基因的开放阅读框为自序列2的5’端第60位到第995位碱基。将抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶记为EcACO-R，敏感性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶记为EcACO-S，如图1所示，对二者进行核苷酸序列及氨基酸序列比较发现，二者的氨基酸序列存在5个氨基酸突变位点差异，具体为F98→Y，G101→D，Q206→R，G270→V，A272→G。据了解，氨基酸突变是由相应位置的碱基异变引起的，与上述氨基酸突变相对应的碱基突变位点为T293→A，G302→A，A617→G，G809→T，C815→G。其中，F98→Y，G101→D和Q206→R这三处氨基酸突变位置均处于蛋白保守结构域DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy中，DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy均与Fe2+的氧化有关。Fe2+是催化ACC向乙烯转化过程中的关键辅助因子，这三处氨基酸突变可能会降低乙烯生成反应中Fe2+辅助因子与EcACO蛋白的结合效率，进而抑制了乙烯生物合成途径，最终导致稗草对二氯喹啉酸产生抗性。

[0018] 本发明根据二氯喹啉酸抗药性稗草中的EcACO-R基因序列以及敏感性稗草中的EcACO-S基因序列设计特异性引物，并设β-act in基因为内参进行实时定量PCR分析，重复3次试验，反应完成后进行溶解曲线检验，并按照2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，发现EcACO-R基因的相对表达量比EcACO-S基因的相对表达量低(见图2)。

[0019] 本发明将抗药性稗草EcACO-R基因和敏感性稗草EcACO-S基因分别构建到含有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的原核表达载体质粒pMAL-c5x中，构建原核表达载体后得到重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌菌株BL21中进行融合蛋白的原核表达，对IPTG诱导后的蛋白进行12％SDS-PAGE电泳，结果表明，抗药性稗草中的融合蛋白MBP::EcACO-R和敏感性稗草中的融合蛋白MBP::EcACO-S，二者分子量大小均约为75kD(与理论值一致)，这两种融合蛋白主要存在于上清中，即在大肠杆菌中主要以可溶性蛋白的形式表达(见图3)。分别对这两种可溶性蛋白进行纯化并对纯化后的可溶性蛋白进行蛋白活性测定，以研究ACO的酶活性，ACO的酶活性以每小时1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)生成乙烯(ET)这一步骤所产生的乙烯量表示，单位为nmol·μg-1·h-1。测量时，设乙烯标样为阴性对照，利用装备Al2O3柱子的气相色谱仪分析单位时间内气体乙烯的生成量，重复3次试验，结果显示5μg的融合蛋白MBP::EcACO-S每小时内生成的乙烯量是融合蛋白MBP::EcACO-R的2.15倍(见图4)，即MBP::EcACO-R的蛋白活性显著低于MBP::EcACO-S，EcACO在抗药性稗草中的氨基酸突变降低了乙烯生成反应中反应底物、辅助底物或辅助因子与EcACO蛋白的结合效率，进而抑制了乙烯生物合成途径。

[0020] 综上可知，通过基因表达和蛋白酶活性分析，表明抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶抑制了乙烯的生物合成途径，使得抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因在培育抗除草剂转基因品种中具有重要的应用价值。

[0021] 上述抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因的应用，包括提取抗药性稗草总RNA及制备抗药性稗草cDNA模板，重组质粒以及相应基因工程菌的构建和转化重组质粒到水稻中，在重组质粒以及相应基因工程菌的构建步骤中，以抗药性稗草cDNA为模板，通过PCR反应获得含有抗药性稗草中1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的DNA片段的扩增序列，引物的核苷酸序列为：

[0022] 正向引物：5’-GGTATATAAGATCTATGGTGGTTCCAGTGAT-3’

[0023] 反向引物：5’-GGCTCTCAGGTGACCTTAAGCCGCCGGAG-3’，表达载体含有启动子，启动子为35S启动子，将EcACO-R基因构建到表达载体质粒pCAMBIA1304中，获得重组质粒，该重组质粒记为35S:EcACO-R。利用冻融法将重组质粒35S:EcACO-R转化到农杆菌中，然后采用农杆菌介导法将35S:EcACO-R转化到水稻中，得到EcACO-R转基因水稻。以EcACO-R转基因水稻为材料，空载体转基因水稻作为对照，检测EcACO-R转基因水稻对二氯喹啉酸的抗性，如图5所示，与未经除草剂处理的水稻相比，空载体转基因水稻和EcACO-R转基因水稻两个株系的生长均受到二氯喹啉酸的抑制，但是EcACO-R转基因水稻的叶片为绿色，仍呈生长状态，其生长态势仅比未经除草剂处理的水稻稍显缓慢；空载体转基因水稻的叶片卷曲，叶尖均发生凋萎，由此可知EcACO-R转基因水稻植株能够提高植株对二氯喹啉酸除草剂的抗性。

[0024] 二氯喹啉酸属于激素类除草剂中的一种，激素类除草剂可以分为苯氧羧酸类、苯甲酸类、吡啶羧酸类及喹啉羧酸类等4类，被广泛用于禾谷类作物田选择性防治杂草。苏少泉等(2011)在“激素类除草剂的发展与杂草抗性”中研究表明杂草对激素类除草剂的敏感性正逐年下降，即杂草的抗性逐年增加。研究表明，激素类除草剂的作用机制基本相同，均是通过加大乙烯的生成量来使杂草凋萎。由此可知激素类除草剂能够作用于稗草等杂草中的乙烯生物合成途径，稗草对激素类除草剂产生抗性也均与乙烯的生物合成途径发生变化有密切关系。在稗草对激素类除草剂产生抗性这一过程中，ACO作为乙烯合成途径的关键酶，其功能区域相应地发生了位点突变。这些位点突变也会导致乙烯生成反应中反应底物、辅助底物或辅助因子与ACO蛋白的结合效率降低，进而抑制乙烯的合成途径，使稗草对激素类除草剂产生抗性。因此针对激素类除草剂抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因，在培育抗激素类除草剂转基因品种方面具有重要的应用价值。

[0025] 本发明的抗药性稗草中的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，与敏感性稗草相比，其基因发生了突变，存在5个氨基酸突变位点差异，不仅可抑制乙烯的生物合成途径，进而提高稗草对二氯喹啉酸的抗药性，是稗草抗二氯喹啉酸除草剂的新机制，还能够为培育除草剂转基因作物品种提供服务。

附图说明

[0026] 图1是EcACO-S和EcACO-R的核苷酸序列及氨基酸序列差异比较图。

[0027] 图2是抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO基因的PCR分析。

[0028] 图3是融合蛋白MBP::EcACO-R和MBP::EcACO-S诱导表达后的电泳图。

[0029] 图4是抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO酶活差异比较图。

[0030] 图5是二氯喹啉酸对EcACO-R转基因水稻的影响。

具体实施方式

[0031] 下面通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于这些例子。本发明所用的抗药性稗草和敏感性稗草材料均是李永丰研究员于2010年9月下旬采自安徽省合肥市庐江县的水稻田中，水稻品种中花11来自于江苏省农业科学院粮食作物研究所，本发明所涉及的试剂均为市购。

[0032] 下述实施例所用的大肠杆菌菌株DH5α和BL21，以及农杆菌菌株EH105均购自南京天为生物科技有限公司。

[0033] 下述实施例的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0034] 下述实施例的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

[0035] 实施例1.抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO基因的克隆及其序列差异分析[0036] 选取2～3叶期的二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草材料，并对其EcACO基因进行核苷酸序列及氨基酸序列比较分析。

[0037] 1.稗草总RNA的提取。以二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草为研究材料，从培养至2～3叶期的抗药性稗草单株苗和敏感性稗草单株苗中分别提取总RNA。稗草总RNA的提取采用超纯总RNA快速提取试剂盒(购自原平皓生物技术有限公司)，操作方法参照试剂盒说明书。提取的稗草总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的质量和完整性，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

[0038] 2.cDNA模板的制备。取出超低温冰箱中冻存的抗药性稗草总RNA和敏感性稗草总RNA分别置于冰上，以RNA为模板，采用反转录试剂盒(购自天根生物科技有限公司)分别进行抗药性稗草及敏感性稗草cDNA第一链的合成。合成反应条件是25℃温度条件下，反应时间为10min；42℃温度条件下，反应时间为30min；85℃温度条件下，反应时间为5min。

[0039] 3.引物的设计。在NCBI网站上(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，分析各个物种的ACO同源基因序列，然后设计EcACO基因克隆的引物。设计的两端引物为EcACO-F：5’-CAGTTGCACAGAGACATTTCAC-3’；EcACO-R:5’-TTACTTTAAGCCGCCGGAGAT-3’。引物EcACO-F和引物EcACO-R均购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。

[0040] 4.PCR扩增、回收纯化及测序。分别以抗药性稗草的cDNA和敏感性稗草的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL：1μL cDNA，2μL引物EcACO-F(浓度为10μM)，2μL引物EcACO-R(浓度为10μM)，25μL Taq Plus 2×Master PCR Mix(购自南京天为生物科技有限公司)，20μL ddH2O(重蒸水)。PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增后的产物经1％琼脂糖电泳回收纯化目的DNA片段，然后将纯化好的DNA片段送交英潍捷基(上海)贸易有限公司进行DNA双向测序。

[0041] 5.测序结果分析。将测序所得的序列在NCBI网站上进行同源序列比对，序列比对方法见Mol Biol Evol.2007Nov；24(11):2433-42中“Mind the gaps:evidence of bias in estimates of multiple sequence alignments”部分所述。采用DNAman软件分析基因的核酸序列和氨基酸序列，具体操作详见DNAman软件说明。将抗药性稗草中的EcACO记为EcACO-R，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示。敏感性稗草中的EcACO记为EcACO-S，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。EcACO-R和EcACO-S的核苷酸序列及氨基酸序列差异比较如图1所示(其中方框标记为氨基酸突变位点，灰色部分显示为核苷酸突变位点)，EcACO-R和EcACO-S的氨基酸序列存在5个突变位点，即F98→Y(氨基酸序列中的98位由苯丙氨酸突变为酪氨酸)，G101→D(氨基酸序列中的101位由甘氨酸突变为天冬氨酸)，Q206→R(氨基酸序列中的206位由谷氨酰胺突变为精氨酸)，G270→V(氨基酸序列中的270位由甘氨酸突变为缬氨酸)，A272→G(氨基酸序列中的272位由丙氨酸突变为甘氨酸)，与之相对应的碱基突变为T293→A(核苷酸序列中的
293位由胸腺嘧啶突变为腺嘌呤)，G302→A(核苷酸序列中的302位由鸟嘌呤突变为腺嘌呤)，A617→G(核苷酸序列中的617位由腺嘌呤突变为鸟嘌呤)，G809→T(核苷酸序列中的
809位由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶)，C815→G(核苷酸序列中的815位由胞嘧啶突变为鸟嘌呤)。其中F98→Y，G101→D及Q206→R均处于蛋白保守结构域DIOX_N和2OG-FeI I_Oxy中，而DIOX_N和2OG-FeII_Oxy均和Fe2+的氧化有关。

[0042] 实施例2.抗药性稗草和敏感性稗草中的EcACO基因的实时定量PCR分析[0043] 选取2～3叶期的二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草材料，利用实时定量PCR(quant itat ive real-t ime PCR)分析这些材料中EcACO基因的表达水平，从而获得EcACO基因表达水平与二氯喹啉酸抗药性的关系。

[0044] 1.稗草总RNA的提取。以二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草为研究材料，从培养至2～3叶期的抗药性稗草单株苗和敏感性稗草单株苗中分别提取总RNA。稗草总RNA的提取采用超纯总RNA快速提取试剂盒(购自原平皓生物技术有限公司)，操作方法参照试剂盒说明书。提取的稗草总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的质量和完整性，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

[0045] 2.cDNA模板的制备。取出超低温冰箱中冻存的抗药性稗草总RNA和敏感性稗草总RNA分别置于冰上，以RNA为模板，采用反转录试剂盒(购自天根生物科技有限公司)分别进行抗药性稗草及敏感性稗草cDNA第一链的合成。反应条件是25℃，10min；42℃，30min；85℃，5min。

[0046] 3.实时定量PCR。根据实施例1获得的抗药性及敏感性稗草EcACO基因序列设计特异性引物。特异性引物为EcACO-QF：5’-GACACACGCAATCAACAATGG-3’，EcACO-QR:5’-CAAGCTGAAAGAATCCCCACT-3’。实时定量PCR实验时，选取β-act in基因作为内参，然后设计内参的特异性引物:正向引物5’-CACACTGGTGTCATGGTAGG-3’和反向引物5’-AGAAAGTGTGATGCCAGAT-3’。实时定量PCR(quantitative real-time PCR)试验操作在ABI-Stepone plus实时定量PCR仪上进行，其反应体系及程序参照Takara SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ说明书。试验时设定3次重复，反应完成后进行溶解曲线分析，然后按照2-△△CT法计算基因的相对表达量。结果如图2所示，EcACO-R基因的相对表达量比EcACO-S基因的相对表达量低，试验表明EcACO基因在抗药性稗草中表达较少，对乙烯合成反应具有一定抑制作用，可能对二氯喹啉酸抗药性发挥重要作用。

[0047] 实施例3.抗药性稗草和敏感性稗草中EcACO的酶活测定及其差异比较

[0048] 选取2～3叶期的二氯喹啉酸抗药性稗草和敏感性稗草材料，利用Yusuke Kosugi等(2014)方法分析这些材料中EcACO的酶活性。

[0049] 1 .原 核表达载 体构建。设计的 引物为Ec ACO-Nd eI- S:5’-GGTATATACATATGGTGGTTCCAGTGATCG-3’(划线处为限制性内切酶NdeI酶切位点识别序列)；
EcACO-NdeI-R:5’-GGTATATACATATGGTGGTCCCTGTGATCG-3’(划线处为限制性内切酶NdeI酶切位点识别序列)；EcACO-EcoRV:5’-GGCTCTCAGATATCTCATTAAGCCGCCGGAG-3’(划线处为EcoRV酶切位点识别序列)。将EcACO-R基因和EcACO-S基因分别构建到含有MBP(麦芽糖结合蛋白)标签的原核表达载体质粒pMAL-c5x中，其中EcACO-R基因以EcACO-NdeI-R和EcACO-EcoRⅤ为两端引物，EcACO-S基因以EcACO-NdeI-S和EcACO-EcoRV为两端引物，通过PCR反应分别扩增EcACO基因的完整编码区。PCR扩增的程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸2min，重复33个循环后；72℃延伸10min。将PCR扩增后的产物—含有EcACO-R基因的DNA片段的扩增序列以及含有EcACO-S基因的DNA片段的扩增序列经回收纯化后，分别采用限制性内切酶Nde I和EcoR V进行双酶切，得到EcACO-R基因片段和EcACO-S基因片段。同时，采用限制性内切酶Nde I和EcoR V对原核表达载体pMAL-c5x质粒进行双酶切，得到回收纯化的线性载体。在16℃条件下通过T4-DNA连接酶将EcACO-R基因片段与线性载体连接得到含有EcACO-R基因片段的重组质粒，过夜后将重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板上挑取单克隆，再经PCR和酶切验证得到阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序分析；同时在16℃条件下通过T4-DNA连接酶将EcACO-S基因片段与线性载体连接得到含有EcACO-S基因片段的重组质粒，过夜后将重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板上挑取单克隆，再经PCR和酶切验证得到阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序分析。若测序结果表明重组质粒中的插入基因序列无缺失和突变，说明原核表达载体构建成功。

[0050] 2.融合蛋白的原核表达。将含有EcACO-R基因片段的重组质粒和含有EcACO-S基因片段的重组质粒分别转入大肠杆菌菌株BL21中，并设pMAL-c5x空载体作为对照组。将上述三组的单菌落分别接种到10mL含有氨苄青霉素(浓度为100mg/L)的LB液体培养基中，37℃条件下培养过夜，然后将接种后的LB液体培养基按照质量比为1:100的比例接种到新鲜的LB液体培养基中，培养至OD600(optical density)值约为0.6，向培养基中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为0.4mM，18℃条件下低温诱导16h后，过夜培养产生融合蛋白MBP::EcACO-R或MBP::EcACO-S，同时设未加IPTG诱导剂的菌液作为阴性对照。4000×g条件下离心收集三组过夜培养的菌液，用适量Column Buffer溶液(Column Buffer溶液由20mM Tris-Hcl、200mM NaCl和1mM EDTA组成)悬浮后进行超声波裂解，20000×g条件下离心20min后分离上清和沉淀。取部分上清和沉淀分别加入5×SDS上样缓冲液中，经100℃煮沸
10min处理后于冰上保存2min，然后进行12％SDS-PAGE电泳，分析蛋白在上清和沉淀中的表达情况。电泳的结果如图3所示，其中A图为EcACO-R，B图为EcACO-S；图中M表示pMAL-c5x空载体对照组，是蛋白质分子量标准，1表示未经IPTG诱导的MBP::EcACO，2表示经IPTG诱导的MBP::EcACO蛋白沉淀，3表示经IPTG诱导的MBP::EcACO蛋白上清，4表示MBP::EcACO纯化蛋白。由图3可知，融合蛋白MBP::EcACO-R或MBP::EcACO-S的分子量大小均约为75kD(与理论值一致)，主要存在于上清中，表明融合蛋白在大肠杆菌BL21中主要以可溶性蛋白的形式表达。

[0051] 3.可溶性蛋白的纯化。将含有融合蛋白MBP::EcACO-R或MBP::EcACO-S的菌株接种于含有氨苄青霉素(浓度为100mg/L)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值约为0.6左右，向培养基中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为0.4mM，18℃条件下低温诱导16h后，4,000×g、4℃条件下离心收集菌体，采用Column Buffer溶液悬浮后进行超声波裂解，20,000×g、4℃条件下离心20min，收集上清。将上清液加入到MBP吸附柱中，经Column Buffer平衡上样后的吸附柱，用MBP洗脱液(由20mM Tris-HCl、200mM NaCl、1mM EDTA和
10mM maltose组成)洗脱融合蛋白，洗脱后可获得分子量大小约75kD的蛋白。洗脱后的蛋白经12％SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的纯度，电泳结果如图3的第4泳道所示，纯化后的蛋白没有明显杂带，获得的蛋白液适合进一步作蛋白活性测定。

[0052] 4.融合蛋白的活性分析。ACO的活性测定参考Yusuke Kosugi等(2014)方法并结合本实施例的特点加以修改。融合蛋白活性分析实验中，以纯化后的MBP::EcACO-R或MBP::EcACO-S融合蛋白为对象，ACC为底物，抗坏血酸和氧为辅助底物，Fe2+和CO2为辅助因子。操作步骤为：将50μL酶蛋白液(蛋白量5μg)加入到60mM MOPS-NaOH溶液中(PH＝7.5)，再加入
25mM抗坏血酸钠，50μM FeSO4，25mM NaHCO3和0.1mM ACC得到2mL总体积的反应液。将2mL反应液转移至5mL密闭气体收集瓶中，盖上橡胶筛，30℃恒温水浴30min后，取1mL上层气样，用装备Al2O3柱子的气相色谱仪(GC-9860)分析单位时间内气体乙烯的生成量，重复操作3次，并设乙烯标样为阴性对照。其中ACO的酶活性以每小时1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)生成乙-1 -1
烯(ET)这一步骤所产生的乙烯量表示，单位为nmol·μg ·h 。如图4所示，5μg的MBP::
EcACO-S每小时内生成的乙烯量是同质量的MBP::EcACO-R的2.15倍。上述结果表明，MBP::
EcACO-R的蛋白活性显著低于MBP::EcACO-S，即EcACO在抗药性稗草中的氨基酸突变可能降低了反应底物、辅助底物或辅助因子与EcACO蛋白的结合效率。

[0053] 实施例4.EcACO-R转基因水稻对二氯喹啉酸的抗性检测

[0054] 1.构建抗药性稗草中EcACO-R基因的植物表达载体。设计引物，正向引物为5’-GGTATATAAGATCTATGGTGGTTCCAGTGAT-3’(划线处为Bgl II酶切位点识别序列)，反向引物为5’-GGCTCTCAGGTGACCTTAAGCCGCCGGAG-3’(划线处为BstE II酶切位点识别序列)。以抗药性稗草cDNA为模板，采用高保真的Tag Plus酶经PCR反应扩增出两端含有酶切位点的EcACO-R全长基因，PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸2min，重复33个循环；72℃延伸10min。两端含有酶切位点的EcACO-R全长基因回收纯化后，采用限制性内切酶Bgl II和BstE II进行双酶切，得到目的片段—EcACO-R基因片段；同时采用限制性内切酶Bgl II和BstE II对表达载体pCAMBIA1304质粒进行双酶切，得到回收纯化的线性载体，线性载体含有35S启动子。在16℃条件下通过T4-DNA连接酶将EcACO-R基因片段与线性载体连接过夜，并转化大肠杆菌DH5α。经酶切鉴定，得到重组质粒，记为35S:EcACO-R。利用冻融法将重组质粒35S:EcACO-R转化到农杆菌菌株EHA105中，然后采用农杆菌介导法将重组质粒35S:EcACO-R转化水稻中花11中。

[0055] 2.农杆菌介导的水稻转化。⑴愈伤组织的诱导和培养，将成熟水稻种子去壳后，在70％乙醇溶液中浸泡1min进行表面消毒，再采用1.25％次氯酸钠溶液浸泡30min进行灭菌处理，然后采用无菌水洗净，将洗净后的种子置于NBD诱导培养基(见表1)上，在26℃、避光条件下培养愈伤组织，10～15天后剥取盾片处长出的愈伤组织，并将愈伤组织转入新的NBD固体培养基，进行继代培养。⑵农杆菌的培养，将农杆菌EHA105划板于YEB培养基(内含
50mg/L卡那霉素)上，28℃温度条件下培养2～3天后，采用金属匙收集农杆菌菌体，并将其悬浮于NBCI液体培养基(见表1)中。调整农杆菌的菌体浓度使NBCI培养基OD600值约为0.5，即可得到供转化用的农杆菌悬浮液。⑶愈伤组织与农杆菌的共培养，将继代培养3～5天的愈伤组织转移到无菌三角瓶中(选用色泽淡黄、质地坚硬的胚性愈伤组织)，向无菌三角瓶加入适量的农杆菌悬浮液，室温下放置15～20min，并不时摇晃，使菌液与材料充分接触。取出浸染过农杆菌的愈伤组织，并采用无菌滤纸吸去多余菌液后，转入NBCII固体培养基(见表1)上(表面铺有一张无菌滤纸)，在25℃、避光条件下共培养2～3天。⑷抗性愈伤的获得，将共培养后的愈伤组织移到NBSI选择培养基(见表1)上，两周后，在已褐化的愈伤组织上长出许多白色新鲜的抗性愈伤组织，将这些新鲜抗性愈伤组织置于NBSII选择培养基(见表1)上进行一次复筛。⑸抗性植株的再生，挑选1～2mm生长良好、结构致密的抗性愈伤组织，并将其转到RM培养基(见表1)上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，经过15～25天，得到Hyg(潮霉素，hygromycin)抗性小苗。⑹生根培养，Hyg抗性小苗长到2cm高时，将其移入ShM培养基(见表1)中生根培养2～3周，待小苗长出粗壮而发达的根系后，将其移植到花盆中生长2～3周，再将花盆中的小苗种于温室或大田直至收获T0代种子，T0代种子繁种后收获T1种子，用于后续实验。

[0056] 3.检测EcACO-R转基因水稻对二氯喹啉酸的抗性。以EcACO-R转基因水稻(中花11)为材料，以空载体转基因水稻(CK)作为对照。将EcACO-R转基因水稻和空载体转基因水稻播种于石英砂中，待两组水稻生长至2叶期时，采用喷雾法进行除草剂二氯喹啉酸喷施，其喷施的有效剂量为稻田中最高推荐剂量(即25克/亩)的5倍。除草剂喷施处理10天后，观察两组水稻的生长情况。如图5所示，与未经除草剂处理的水稻相比，空载体转基因水稻CK和两个EcACO-R转基因水稻株系EcACOR-1、EcACOR-2的生长均受到二氯喹啉酸的抑制，但是EcACO-R转基因水稻的叶片为绿色，仍呈生长状态，只是比未经除草剂处理的水稻生长稍显缓慢；而对照组CK的每个植株的叶片卷曲，叶尖均发生凋萎。上述结果表明，EcACO-R转基因水稻植株对二氯喹啉酸表现出极高的抗性。

[0057] 表1水稻组织培养用培养基

[0058]

[0059] 上表中NB为N6大量+MS铁盐+B5微量+B5有机+水解酪蛋白(0.5g/L)+谷氨酰胺(0.5g/L)+脯氨酸(0.5g/L)+蔗糖(30g/L)，其中，N6大量表示N6培养基中的大量元素，包括硝酸钾(2830mg/L)，硫酸铵(463mg/L)，氯化钙(166mg/L)，硫酸镁(185mg/L)，磷酸二氢钾(400mg/L)；MS铁盐表示MS培养基中的铁盐成分，包括乙二胺四乙酸二钠(37.25mg/L)，硫酸亚铁(27.85mg/L)；B5微量表示B5培养基中的微量元素，包括碘化钾(0.75mg/L),硼酸(3.0mg/L),四水硫酸锰(10mg/L),硫酸锌(2.0mg/L),钼酸钠(0.25mg/L),氯化钴(0.025mg/L),胆矾(0.025mg/L)；B5有机表示B5培养基中的有机成分，包括肌醇(100mg/L),烟酸(1.0mg/L)，盐酸吡哆醇(1.0mg/L)，盐酸硫铵(10mg/L)。另外，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，Gelrite为脱乙酰吉兰糖胶，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，KT(Kinet in)为激动素，Agar为琼脂，NB无机盐表示上述NB中的无机盐成分。

[0060] 除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，落在本发明要求的保护范围。