一种DNA四面体纳米结构信号探针及其应用

摘要

本发明提供了一种DNA四面体纳米结构信号探针，所述信号探针为由一条5’端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端修饰了标记分子的单链DNA自组装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面体的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与待测目标DNA或miRNA互补结合，其他三个顶点含有标记分子，特异性地与带修饰的信号分子结合，实现多信号放大。本发明大大提高了电化学检测目标DNA或miRNA的灵敏度，检测限低至1fM。

权利要求

1.一种DNA四面体纳米结构信号探针，其特征在于，所述信号探针为由一条5’端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端修饰了标记分子的单链DNA自组装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面体的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列能与待测目标DNA或待测miRNA互补结合，其他三个顶点含有标记分子；构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.1～4所示，Tetra-a-reporter的序列如SEQ ID NO.1所示，Tetra-b的序列如SEQ ID NO.2所示，Tetra-c的序列如SEQ ID NO.3所示，Tetra-d的序列如SEQ ID NO.4所示，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA识别序列；所述标记分子为生物素分子。

2.一种电化学检测方法，具体包括如下步骤：

(1)先将待测目标DNA或miRNA和如权利要求1所述的DNA四面体纳米结构信号探针混合预杂交得混合液，再将含四面体捕获探针的工作电极插入到所述混合液中再杂交；

(2)加入氧化还原酶和相应的底物，进行电化学检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，DNA四面体捕获探针，为将三条

5'修饰了巯基的单链DNA和一条在3'延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA自组装形成具有四面体底座的DNA探针，所述四面体的其中三个顶点含有巯基基团，用于固定在电极表面，在剩下的一个顶点上延伸一段DNA识别序列，所述的DNA识别序列与目标DNA或miRNA的序列互补。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，构成所述DNA四面体捕获探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.5～8所示。

5.一种基于如权利要求2所述检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述DNA四面体纳米结构信号探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有DNA四面体捕获探针，DNA四面体捕获探针，为将三条5'修饰了巯基的单链DNA和一条在3'延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA自组装形成具有四面体底座的DNA探针，所述四面体的其中三个顶点含有巯基基团，用于固定在电极表面，在剩下的一个顶点上延伸一段DNA识别序列，所述的DNA识别序列与目标DNA或miRNA的序列互补，构成所述DNA四面体捕获探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.5～8所示。

7.根据权利要求1所述的DNA四面体纳米结构信号探针在DNA或miRNA检测中的应用。

说明书

一种DNA四面体纳米结构信号探针及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA四面体纳米结构信号探针及其应用。

背景技术

[0002] DNA电化学生物传感器以其快速、灵敏、低成本及易微型化等优点在临床医药、食品检验、环境检测以及反恐等各个领域有着巨大的潜在用途。决定DNA电化学生物传感器性能的一个重要方面就是信号放大体系。

[0003] 由于DNA作为生物标志物在疾病诊断中具有非常重要的地位。因此用于检测临床样本中低浓度的DNA的生物标志物的超灵敏DNA传感器至关重要。其中，电化学DNA传感器是有前途的一个，因为其响应速度快，使用方便，成本低，可以直接进行DNA检测。电化学DNA传感器于2003年被首次发明，其中“三明治”式的电化学DNA传感器得到了广泛的应用。一个典型的“三明治”式的电化学DNA传感器由固定到电极上的单链DNA捕获探针识别层的和一个单链DNA信号探针将目标DNA固定在电极表面，并通过各种方式转化为电化学信号。捕获探针和信号探头与目标DNA形成夹心结构，看起来像一个“三明治”。

[0004] 要想使得“三明治”式的电化学DNA传感器提高灵敏度，两个关键部分是“识别层”与“信号转导”。“识别层”最常用于电化学DNA传感器的捕获探针是巯基修饰的单链DNA，通过金-硫键实现捕获探针在电极上的固定。但这种方法存在一定的缺陷，因为单链DNA是一种柔性的分子，并且探针DNA的碱基与金之间有吸附位点，单链DNA容易平躺在金表面上。科学家们尝试了多种方法来改善这种情况。例如，添加一些小分子稀释剂，这样小分子可以取代探针碱基与金之间的相互作用，使探针DNA一定程度直立在电极表面。最近，DNA四面体纳米结构捕获探针吸引了极大的兴趣。三维的DNA四面体纳米结构最早在2004年开发，然后首次在2010年用于电化学DNA传感器。根据报道，DNA四面体可以固定在金电极表面，通过修改其三个顶点与硫醇基团，而第四顶点可以被设计成具有为互补的靶DNA或miRNA的一部分的延伸的DNA捕获探针。由于其刚性结构的优点，该DNA四面体纳米结构可保证该DNA捕获探针具有良好控制的密度和取向。“信号转导”是提高电化学检测性能又一个非常重要的因素。大量的信号分子如氧化还原酶，纳米颗粒标记已经被用来放大信号。辣根过氧化物酶(HRP)具有稳定，高效，可商购的，容易与DNA探针上的生物素共价结合等优点。因此被广泛应用于电化学生物传感器的信号转导。

[0005] 通常，用于结合HRP的信号探针是生物素修饰的单链DNA。然而，由于一条单链DNA信号探针通常只能结合一个HRP酶，从而导致酶反应的效率不高。

发明内容

[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种DNA四面体纳米结构信号探针，所述信号探针为由一条5’端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端修饰了标记分子的单链DNA自组装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面体的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与待测目标DNA或miRNA互补结合，其他三个顶点含有标记分子。

[0007] 优选的，所述标记分子为生物素分子。所述标记分子能特异性地与带修饰的信号分子结合，实现多信号放大。所述带修饰的信号分子为带修饰的氧化还原酶；更优选的，所述带修饰的氧化还原酶为亲和素修饰的氧化还原酶，通过生物素和亲和素的结合作用连接和氧化还原酶分子，进而通过DNA碱基互补产生信号。

[0008] 优选的，所述氧化还原酶选自辣根过氧化酶或葡萄糖氧化酶；更优选辣根过氧化酶。

[0009] 优选的，所述四面体的边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。更优选的，所述四面体的边长是由17对碱基互补配对形成。

[0010] 优选的，构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.1～4所示：

[0011] Tetra-a-reporter：

[0012] 5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3'。(SEQ ID NO.1)

[0013] 优选的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA识别序列。

[0014] Tetra-b：

[0015] 5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'。(SEQ ID NO.2)

[0016] Tetra-c：

[0017] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。(SEQ ID NO.3)

[0018] Tetra-d：

[0019] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'。(SEQ ID NO.4)

[0020] 优选的，自组装形成DNA四面体纳米结构信号探针的形成条件为95℃3min，而后立即降温到4摄氏度。

[0021] 本发明第二方面公开了一种电化学检测方法，具体包括如下步骤：

[0022] (1)先将待测目标DNA或miRNA和四面体DNA纳米结构信号探针混合预杂交得混合液，再将组装好的含四面体捕获探针的工作电极插入到所述混合液中再杂交；

[0023] (2)加入氧化还原酶和相应的底物，进行电化学检测。

[0024] 优选的，步骤(1)中，所述DNA四面体纳米结构信号探针，所述信号探针为由一条5’端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端修饰了标记分子的单链DNA自组装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面体的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与待测目标DNA或miRNA互补结合，其他三个顶点含有标记分子。

[0025] 优选的，所述标记分子为生物素分子。

[0026] 优选的，所述四面体的边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。更优选的，所述四面体的边长是由17对碱基互补配对形成。

[0027] 优选的，构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.1～4所示：

[0028] 5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3'。(SEQ ID NO.1)

[0029] 优选的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA识别序列。

[0030] Tetra-b：

[0031] 5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'。(SEQ ID NO.2)。

[0032] Tetra-c：

[0033] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。(SEQ ID NO.3)。

[0034] Tetra-d：

[0035] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'(SEQ ID NO.4)。

[0036] 优选的，自组装形成DNA四面体纳米结构信号探针的形成条件为95℃3min，而后立即降温到4摄氏度。

[0037] 优选的，步骤(2)中，DNA四面体捕获探针，为将三条5'修饰了巯基的单链DNA和一条在3'延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA自组装形成具有四面体底座的DNA探针，所述四面体的其中三个顶点含有巯基基团，用于固定在电极表面，在剩下的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与目标DNA或miRNA的序列互补，通过所述信号探针末端的标记分子与带修饰的信号分子结合产生电化学信号进行电化学检测。

[0038] 优选的，步骤(2)中，所述捕获探针可以保证顶端的DNA识别序列不易和电极表面相互作用，而且作为底座的四面体纳米结构，由于自身的特殊结构特点，可以控制顶端上延伸出来的DNA识别序列与周围的单链DNA的空间距离，充分降低了邻近的DNA之间的相互作用。

[0039] 优选的，构成所述DNA四面体捕获探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.5～8所示：

[0040] Tetra-a：

[0041] 5'-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTAAAAAAAAAAA-3'。(SEQ ID NO.5)

[0042] 优选的，Tetra-a-的3'端延伸一段DNA识别序列。

[0043] Tetra-b：

[0044] 5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'。(SEQ ID NO.6)

[0045] Tetra-c：

[0046] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。(SEQ ID NO.7)

[0047] Tetra-d：

[0048] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'。(SEQ ID NO.8)。

[0049] 优选的，步骤(3)中，预杂交是待测目标DNA或miRNA与DNA四面体纳米结构信号探针上的DNA识别序列杂交；再杂交是待测目标DNA或miRNA与DNA四面体捕获探针上的DNA识别序列互补杂交。

[0050] 优选的，步骤(3)中，所述DNA四面体纳米结构信号探针的浓度和所述DNA四面体捕获探针的浓度可根据待测目标DNA或miRNA的浓度来选择。更优选的，所述DNA四面体纳米结构信号探针的浓度为100nM；所述DNA四面体捕获探针的浓度为：1uM。

[0051] 优选的，步骤(4)中，所述氧化还原酶选自辣根过氧化酶或葡萄糖氧化酶；更优选辣根过氧化酶，其修饰有亲和素分子；信号探针的末端修饰有生物素分子，通过生物素分子和亲和素分子的结合连接辣根过氧化酶和信号探针。

[0052] 优选的，步骤(4)中，所述的相应的底物是四甲基联苯胺(TMB)和双氧水。

[0053] 进一步的，上述电化学检测方法为非疾病诊断目的的检测方法。

[0054] 综上所述，本发明的电化学检测方法，原理如下：

[0055] 首先，将待测目标DNA或miRNA和四面体DNA纳米结构信号探针混合预杂交所得混合液，加入到组装好的含四面体捕获探针的工作电极上；只有目标DNA或miRNA才能够与四面体DNA纳米结构信号探针及四面体捕获探针互补配对结合，加入过氧化物酶，四面体捕获探针就可以通过四面体DNA纳米结构信号探针上的标记分子，特异性地与辣根过氧化酶结合。

[0056] 然后，滴加TMB和双氧水底物，辣根过氧化酶可以催化TMB和双氧水的电化学反应，产生电流信号，使用现有的电化学检测或分析仪进行电话学检测或分析。

[0057] 本发明第三方面，提供了一种基于前述检测方法的试剂盒，包括前述DNA四面体纳米结构信号探针。

[0058] 进一步的，所述试剂盒还包括前述DNA四面体捕获探针。

[0059] 优选的，所述试剂盒中，构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.1～4所示；构成所述DNA四面体捕获探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.5～8所示。

[0060] 优选的，所述试剂盒还包括过氧化物酶；更优选的，所述过氧化物酶为辣根过氧化酶。

[0061] 优选的，所述试剂盒还包括TMB和双氧水。

[0062] 本发明第四方面还提供了前述DNA四面体纳米结构信号探针在DNA或miRNA检测中的应用。所述检测为非疾病诊断目的的检测。

[0063] 本发明第五个方面进一步公开了一种四面体纳米结构DNA在制备信号探针中的用途。

[0064] 优选的，四面体纳米结构DNA由四条单链DNA自组装形成，具有四面体底座。

[0065] 本发明的有益效果为：

[0066] (1)本发明首次采用DNA四面体纳米结构作为电化学DNA传感器的信号探针，该纳米结构合成时间很短，方法简单。

[0067] (2)本发明的四面体结构信号探针主体有两个结构域：一个是四面体结构其中一个顶点延伸出来的一段DNA，它的作用是与待测目标DNA或miRNA部分互补，实现在工作极上的固定；另一个是具有四面体形状的三维纳米结构，它的作用是通过三个顶点和边长衍生出来的标记分子例如生物素(biotin)结合，从而进一步捕获信号分子如辣根过氧化物酶(HRP)。由于其具有多个顶点，并且边长处可以实现多个biotin修饰，所以能够实现对多个HRP酶进行捕获，从而实现多信号放大。本发明将DNA纳米技术与DNA电化学传感技术相结合，发明了一种全新的电化学信号探针，与传统单链DNA信号探针相比，实现了可控多信号放大，从而提高了电化学生物传感器的性能。

[0068] (3)本发明采用标记分子如生物素标记的DNA四面体纳米结构作为信号探针(RTSPS)用于结合多个信号分子如HRP酶，它可以扩增酶电化学信号，从而提供一种超高灵敏度检测目标DNA的方案。在这里，生物素标记的DNA四面体结构信号探针实际上作为捕获探针和HRP之间的桥梁。这一战略是为了实现多信号放大。

[0069] (4)由于信号探针的底座的特殊结构(大小，构型)，可以使DNA识别序列高取向朝外的排列，使得DNA识别序列有高的自由度。

[0070] (5)本发明大大提高了电化学检测目标DNA或miRNA的灵敏度，，检测限低至1fM。

[0071] (6)本发明不止针对一种目标DNA或miRNA，可以设计不同的探针检测不同的目标DNA或miRNA。

附图说明

[0072] 图1(A)基于DNA四面体信号探针电化学DNA传感器的循环伏安曲线。该图含有典型的TMB氧化还原峰，说明可以成功的检测目标DNA。三条线分别不含目标DNA(实线)，含1pM目标DNA(短线)，和含10nM目标DNA(点线)。扫描速率：100mV/s。(B)基于DNA四面体信号探针电化学DNA传感器的电流时间曲线。从上到下分别是含有0fM，1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM目标DNA。扫描电势为100mV，扫描时间为100s。

[0073] 图2(A)检测柱状图。从左到右分别是有0fM，1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM目标DNA时在100s检测的电流值，信号依次增大；(B)根据电流值绘制的模拟分析曲线，发现电流值与目标DNA浓度的的曲线符合剂量响应曲线。

[0074] 图3表明该样本的本底信号是67nA，1pM目标DNA的信号是218nA。

具体实施方式

[0075] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

[0076] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

[0077] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

[0078] 以下实施例中TMB底物购自NEOGEN公司，其中已包含双氧水。辣根过氧化物酶购自eBioscience公司。Tris，TCEP购自Sigma公司，其他所有试剂购自国药集团。

[0079] 本发明中所用的缓冲溶液包括：TM缓冲溶液(20mM tris buffer and 50mM MgCl2,pH8.0)；杂交缓冲液(H-buffer，20mM tris and 50mM MgCl2)；30mM TECP水溶液。Avidin-HRP用0.5％酪蛋白溶液稀释1000倍。用于电化学检测的溶液是购买的TMB底物溶液。所有溶液用Milli-Q水(18MΩcm电阻)配制。

[0080] 实施例1

[0081] 四条用于组装形成四面体DNA纳米结构信号探针的单链DNA：tetra-a-reporter(77bp,分子量23718.43，ssDNA)；tetra-b-biotin(55bp，分子量17032.04,5’端修饰生物素ssDNA)；tetra-c-biotin(55bp，分子量16909.915’端修饰生物素ssDNA)；tetra-d-biotin(55bp，分子量16888.84，5’端修饰生物素)；均由上海生工公司合成。

[0082] 构成四面体纳米结构信号探针的四条DNA含有三个结构域，每个结构域分别和其它三条单链DNA的相对应结构域互补(17对碱基互补)，每条单链DNA分别围绕四面体结构的一个面一圈，在每个顶点处含有两个碱基(非互补，柔性)起弯折作用，单链DNA3’端和5’端汇聚在四面体的四个顶点。Tetra-a-reporter在5’端延伸出一段DNA序列作为识别序列，tetra-b/c/d-biotin分别在5’末端修饰生物素biotin，分别在四面体的顶点上衍生出来。

[0083] 构成四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列如下表1所示：

[0084] 表1

[0085]

[0086] 四面体捕获探针的设计与信号探针的设计类似：四条用于组装形成四面体捕获探针的单链DNA：tetra-a(80bp，分子量24539.0，ssDNA)；tetra-b(55bp，分子量17018.0，5’端修饰巯基，ssDNA)；tetra-c(55bp，分子量16898，5’端修饰巯基，ssDNA)；tetra-d(55bp,分子量16877，5’端修饰巯基，ssDNA)；均由上海生工公司合成。

[0087] 构成四面体捕获探针的四条DNA含有三个结构域，每个结构域分别和其它三条单链DNA的相对应结构域互补(17个碱基互补)，每条单链DNA分别围绕四面体结构的一个面一圈，在每个顶点处含有两个碱基(非互补，柔性)起弯折作用，单链DNA3’端和5’端汇聚在四面体的四个顶点。Tetra-a在5’端延伸出一段DNA序列作为识别序列。tetra-b/c/d-分别在5’末端修饰巯基，分别在四面体的顶点上衍生出来。

[0088] 构成四面体捕获探针的四条单链DNA的序列如下表2所示：

[0089] 表2

[0090]

[0091] Tetra-a-reporter上的识别序列为：5'-TCTGATAAGCTA-3'。(SEQ ID NO.17)[0092] Tetra-a上的识别序列为：5'-TCAACATCAG-3'。(SEQ ID NO.18)

[0093] 待测目标DNA的序列为：5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'。(SEQ ID NO.19)[0094] 待测目标DNA和四面体DNA纳米结构信号探针识别序列以及四面体DNA纳米结构探针识别序列互补，从而形成夹心结构。

[0095] 实施例2

[0096] 电化学检测方法如下：

[0097] 1)自组装四面体DNA捕获探针和四面体DNA纳米结构信号探针

[0098] 捕获探针合成：分别取等量的tetra-a,b,c,d四条单链DNA，用TM buffer(20mM tris,50mM MgCl2,pH8.0)稀释，使其浓度为1uM，体积100uL。95摄氏度3min后，立即降温到4摄氏度。

[0099] 信号探针合成：分别取等量的tetra-a-reporter,b-biotin,c-biotin,d-biotin四条单链DNA，用TM buffer(20mM tris,50mM MgCl2,pH8.0)稀释，使其浓度为1uM，体积100uL。95摄氏度3min后，立即降温到4摄氏度。

[0100] 2)清洗打磨电极并组装

[0101] 取直径为2mm的金电极，先用0.3um和0.5um的氧化铝粉依次打磨，然后用乙醇和水各超声3min，在0.5M的硫酸中测定其伏安曲线，最后用超纯水冲洗然后用氮气吹干备用。在电极上滴加3uL四面体捕获探针溶液，室温下过夜组装。

[0102] 3)进行杂交反应

[0103] 将不同浓度的待测目标DNA和四面体DNA纳米结构信号探针混合，buffer为杂交缓冲液H-buffer(10mM PB，1MNaCl，20mM MgCl2)置于4度预杂交半小时，然后将组装好四面体捕获探针的电极插入到该溶液，杂交3小时，最后用在4度中保存的1XPBS洗涤(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，37mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)冲洗金电极，氮气吹干。

[0104] 4)检测

[0105] 在每根电极表面滴加3uL avidin-HRP，只有在目标的DNA存在的情况下，DNA四面体信号探针才可以连接到捕获探针上，捕获avidin-HRP。最后用在4度中保存的1XPBS洗涤(10mM Na2HPO4+2mM KH2PO4+37mM NaCl+2.7mM KCl(pH 7.4)冲洗金电极。取1mL TMB底物到电解池中，将电极浸没的TMB底物中检测，采用三电极系统，金电极为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极。使用CHI电化学分析仪检测。扫描循环伏安图和时间电流曲线。其中循环伏安法的起始电压0V，最高电压0.7V，最低电压0V，扫描速度0.1v/s。时间电流曲线，电压为0.1V，时间100秒。

[0106] 如图1(A)基于DNA四面体信号探针电化学DNA传感器的循环伏安曲线。该图含有典型的TMB氧化还原峰，说明可以成功的检测目标DNA。三条线分别不含目标DNA(实线)，含1pM目标DNA(短线)，和含10nM目标DNA(点线)。扫描速率：100mV/s。(B)基于DNA四面体信号探针电化学DNA传感器的电流时间曲线。从上到下分别是含有0fM，1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM目标DNA。扫描电势为100mV，扫描时间为100s。

[0107] 如图2.(A)检测柱状图。从左到右分别是有0fM，1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM目标DNA时在100s检测的电流值，信号依次增大。(B)根据电流值绘制的模拟分析曲线，发现电流值与目标DNA浓度的的曲线符合剂量响应曲线。

[0108] 实验结果表明，检测灵敏度为1fM，线性范围从1fM到1nM。

[0109] 该样本的本底信号是130nA，通过分别计算空白样本的3倍标准差和10倍标准差得到该方法测量的检测限为1fM。

[0110] 对比例

[0111] 电化学检测方法如下：

[0112] 1)自组装四面体DNA捕获探针

[0113] 捕获探针合成：分别取等量的tetra-a,b,c,d四条单链DNA，用TM buffer(20mM tris,50mM MgCl2,pH8.0)稀释，使其浓度为1uM，体积100uL。95摄氏度3min后，立即降温到4摄氏度。

[0114] 2)清洗打磨电极并组装

[0115] 取直径为2mm的金电极，先用0.3um和0.5um的氧化铝粉依次打磨，然后用乙醇和水各超声3min，在0.5M的硫酸中测定其伏安曲线，最后用超纯水冲洗然后用氮气吹干备用。在电极上滴加3uL四面体捕获探针溶液，室温下过夜组装。

[0116] 3)进行杂交反应

[0117] 将不同浓度的待测目标DNA和单链DNA信号探针混合，buffer为杂交缓冲液H-buffer(10mM PB，1MNaCl，20mM MgCl2)置于4度预杂交半小时，然后将组装好四面体捕获探针的电极插入到该溶液，杂交3小时，最后用在4度中保存的1X PBS洗涤(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，37mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)冲洗金电极，氮气吹干。

[0118] 所述单链DNA信号探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，具体为：5'-TCTGATAAGCT-3'，其3'修饰有Biotin。

[0119] 4)检测

[0120] 在每根电极表面滴加3uL avidin-HRP，只有在目标的DNA存在的情况下，单链DNA信号探针才可以连接到捕获探针上，捕获avidin-HRP。最后用在4度中保存的1X PBS洗涤(10mM Na2HPO4+2mM KH2PO4+37mM NaCl+2.7mM KCl(pH 7.4)冲洗金电极。取1mL TMB底物到电解池中，将电极浸没的TMB底物中检测，采用三电极系统，金电极为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极。使用CHI电化学分析仪检测。扫描循环伏安图和时间电流曲线。其中循环伏安法的起始电压0V，最高电压0.7V，最低电压0V，扫描速度0.1v/s。时间电流曲线，电压为0.1V，时间100秒。

[0121] 实验结果如图3所示，表明该样本的本底信号是67nA，1pM目标DNA的信号是218nA。

[0122] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。