高正电荷荧光蛋白在糖胺聚糖分析检测中的应用

摘要

本发明涉及高正电荷绿色荧光蛋白在糖胺聚糖研究中的应用，所述高正电荷荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次将高正电GFP作为生物相容性、高灵敏度和高选择性荧光探针，应用于用于活细胞表面的GAGs的可视化，血清中GAGs的高灵敏性定量分析，肝素中过硫酸化的硫酸软骨素污染分析等。从而克服了传统阳离子染料在GAGs检测中的生物相容性差、选择性低、灵敏度低等缺点，具有重要应用价值，可被广泛应用于GAGs相关的基础和应用研究、临床诊断、医药和食品的检测等。

权利要求

1.高正电荷荧光蛋白作为荧光标记物在糖胺聚糖分析检测中的应用，具体步骤如下：（1）使样品与高正电荷荧光蛋白接触，进行孵育结合，孵育时间5～30 min，孵育后待测样品；

（2）去除孵育后待测样品中未与糖胺聚糖结合的高正电荷荧光蛋白，或者采用荧光淬灭剂淬灭孵育后待测样品中未与糖胺聚糖结合的高正电荷荧光蛋白，制得待检测样品；

（3）对待检测样品进行荧光测定，根据荧光强度对样品中糖胺聚糖含量进行定性和/或定量分析；

所述高正电荷荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的样品为液体、固相载体、细胞、组织、器官。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，高正电荷荧光蛋白的接触浓度为0.01-5.0μg/ml。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，荧光淬灭剂选自：石墨烯、纳米金和/或有机小分子荧光淬灭剂。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，定量分析是通过检测不同稀释度的标准样品的荧光强度绘制标准曲线，根据标准曲线的浓度与荧光强度之间的线性关系获得线性方程，将待测样品的荧光强度数值代入所得线性方程，计算获得样品中糖胺聚糖的含量。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中荧光测定为采用荧光显微镜、流式细胞仪或活体成像设备进行定性分析。

说明书

高正电荷荧光蛋白在糖胺聚糖分析检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及高正电荷绿色荧光蛋白在糖胺聚糖研究中的应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

[0002] 糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)又称为粘多糖，是重复二糖单位组成的直链聚阴离子多糖。主要包括透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS)，硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角质素(Keratan Sulfate，KS)。除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺组成以外，其它GAGs的二糖单位均是由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸)与己糖胺(N-乙酰葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺)组成。其中HA结构相对简单，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的二糖单位经β-1,4-糖苷键连接而成。其它GAGs则由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂，主要表现在糖链中不同部位羟基(-OH)和氨基(-NH2)的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。GAGs糖链结构的这种高度复杂性不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。

[0003] GAGs广泛存在于动物细胞细胞表面和细胞基质中，通过与各种蛋白的特异相互作用参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程[1-4]，GAGs所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如Hep、CS、HA等[5,6]。

[0004] GAGs的结构相对于核酸和蛋白质来说更为复杂，它的结构复杂性和多样性为研究其结构与功能的关系带来了很大的挑战。各种阳离子染料(如：阿利新蓝,甲苯胺蓝和酰胺黑等)常被用于样品中GAGs的染色和检测。然而这类染料具有很多缺点，如生物相容性较差，不适用于对活细胞和组织染色；选择性较低，致使出现很高的背景值；灵敏度较低等。近年来，各种新型的阳离子发色团被合成并用于缓冲液或血清中的Hep进行高灵敏度检测，但其生物相容性及在其它糖胺聚糖检测方面的应用有待进一步研究。因此，亟待发展一种生物相容性好、灵敏度高的多用途GAG探针用于各种生物样品中GAGs的观察和检测。

[0005] 绿色荧光蛋白(GFP)是最早在一种学名为Aequorea victoria的水母中发现的。因为GFP与活体生物的生物相报道基因被用于细胞生物学和分子生物学研究。并且GFP可以作为分子探针用于活体的实时监测。最近，通过将GFP上的一些非保守氨基酸突变为赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，从而在不影响GFP荧光特性的情况下使其带大量的正电荷，这种高正 电荷绿色荧光蛋白已被成功用于蛋白与核酸进入细胞的运输载体，并作为核酸检测的高灵敏度探针[7,8]。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种新的检测糖胺聚糖的手段，即运用高正电绿色荧光蛋白对糖胺聚糖进行定性定量分析检测。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 高正电荷荧光蛋白作为荧光标记物在糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物分析检测中的应用，所述高正电荷荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 根据本发明优选的，所述的糖胺聚糖类似物选自天然或人工半合成及全合成的聚阴离子多糖；进一步优选，所述的糖胺聚糖类似物选自：硫酸化多糖、多聚唾液酸、褐藻胶、卡拉胶，岩藻聚糖或脂多糖。

[0010] 根据本发明优选的，具体步骤如下：

[0011] (1)使样品与高正电荷荧光蛋白接触，进行孵育结合，孵育时间5～30min，孵育后待测样品；

[0012] (2)去除未与待检测样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物结合的高正电荷荧光蛋白，或者采用荧光淬灭剂淬灭与待检测样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物结合的高正电荷荧光蛋白，制得待检测样品；

[0013] (3)对待检测样品进行荧光测定，根据荧光强度对样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物含量进行定性和/或定量分析。

[0014] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的样品为液体、固相载体、细胞、组织、器官。

[0015] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，高正电荷荧光蛋白的接触浓度为0.01-5.0μg/ml。

[0016] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，荧光淬灭剂选自：石墨烯、纳米金和/或有机小分子荧光淬灭剂。

[0017] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，定量分析是通过检测不同稀释度的标准样品的荧光强度绘制标准曲线，根据标准曲线的浓度与荧光强度之间的线性关系获得线性方程，将待测样品的荧光强度数值代入所得线性方程，计算获得样品中糖胺聚糖和/或糖胺聚糖类似物的含量。

[0018] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中荧光测定为采用荧光显微镜、流式细胞仪或活体成像设备进行定性分析。

[0019] 有益效果

[0020] 本发明首次将高正电GFP(ScGFP)作为生物相容性、高灵敏度和高选择性荧光探针，应用于用于活细胞表面的GAGs的可视化，血清中GAGs的高灵敏性定量分析，肝素中过硫酸化的硫酸软骨素污染分析等。从而克服了传统阳离子染料在GAGs检测中的生物相容性差、选择性低、灵敏度低等缺点，具有重要应用价值，可被广泛应用于GAGs相关的基础和应用研究、临床诊断、医药和食品的检测等。

附图说明

[0021] 图1：重组高正电绿色荧光蛋白(ScGFP)表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：M：蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1：对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道
2：重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3：重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4：经镍柱纯化的ScGFP，上样量10μL。

[0022] 图2：不同浓度的糖胺聚糖对抑制氧化石墨烯淬灭ScGFP荧光的作用。A：透明质酸(HA)；B：硫酸软骨素A(CS-A)；C：硫酸皮肤素(DS)；D：肝素(Hep)。由下向上，糖胺聚糖的浓度分别为0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45,0.5,0.55,0.6,0.65,0.7,0.75,0.8,0.85,0.9,0.95,1μg/ml.

[0023] 图3：血清中不同浓度的肝素抑制氧化石墨烯淬灭ScGFP荧光的作用。由下向上，Hep的浓度分别为0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45,0.5,0.55,0.6,0.65,0.7,0.75,0.8,0.85,0.9,0.95,1μg/ml.

[0024] 图4：含不同过硫酸化硫酸软骨素(OSCS)的肝素经肝素酶降解后对抑制氧化石墨烯淬灭ScGFP荧光的作用。

[0025] 图5：共聚焦显微镜辅助检测细胞表面的糖胺聚糖。

[0026] 图6：流式细胞仪辅助检测细胞表面的糖胺聚糖。A：未用酶处理；B：经硫酸软骨素降解酶ABC处理；C：经肝素酶I、II和III处理；D：经硫酸软骨素降解酶ABC和肝素酶I、II和III共处理。

具体实施方式

[0027] 以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。

[0028] 实施例1、ScGFP基因的获得

[0029] 通过文献报道获得ScGFP(+36)的氨基酸序列[7]，并将所得的氨基酸序列转变为相应的碱基序列，并对所对应的碱基进行密码子优化，使其更容易在大肠杆菌中表达。所对应的DNA序列由生工生物工程公司全合成。

[0030] 实施例2、ScGFP(+36)蛋白的表达与纯化

[0031] 以实施例1得到的ScGFP基因为模板，进行PCR扩增。引物如下：

[0032] 正向引物ScGFP-F：

[0033] (gCATATGATGGGTCACCATCATCATCATCACG)

[0034] 反向引物ScGFP-R：

[0035] (gCTCGAGTTTGTAGCGTTCGTCACGACCGTG)

[0036] 正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。对PCR产物进行双酶切，并将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切 pET-22b载体连接，并且筛选阳性的重组质粒(pET22b-ScGFP)。基因测序结果表明，在pET-22b的Nde I和Xho I酶切位点之间插入ScGFP基因，且插入方向正确。

[0037] 将pET22b-ScGFP转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组高正电绿色荧光蛋白pET22b-ScGFP诱导表达。并用Ni SepharoseTM 6Fast Flow(GE)凝胶对scGFP进行纯化，纯化条件按照GE公司的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组ScGFP的纯化情况，结果如图1所示，纯化后的重组ScGFP在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；经测序，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0038] 实施例3、不同浓度的糖胺聚糖抑制氧化石墨烯淬灭scGFP荧光的作用[0039] 在10mM Tris-HCl 100mM NaCl(pH7.0)溶液中加入0.01-0.5μg的ScGFP，然后分别加入肝素(Hep)、硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸皮肤素(DS)、透明质酸(HA)使其终浓度为0-1μg/ml，总体积为190μl，室温放置10min后，加入10μl的氧化石墨烯，混匀、室温放置10min。用荧光分光光度计(F-4600，日立)进行荧光强度测定。结果显示，在糖胺聚糖浓度为0-1μg/ml时，反应体系的荧光强度与糖胺聚糖的浓度存在线性关系(如图2)。

[0040] 在用10mM Tris-HCl 100mM NaCl(pH7.0)稀释10倍的血清中加入0.01-0.5μg的ScGFP，然后分别加入不同量的肝素(Hep)使其终浓度为0-1μg/ml，总体积为190μl，室温放置10min后，加入10μl的氧化石墨烯，混匀、室温放置10min。用荧光分光光度计(F-4600，日立)进行荧光强度测定。结果显示，在血清中，荧光强度与Hep的浓度也存在线性关系(如图3)。该方法可以用于检测病人血清中肝素的含量。

[0041] 实施例4、对血清样品中的肝素进行定量分析

[0042] 标准曲线的绘制，将肝素标准品溶解在血清中配制成100μl浓度为0-10μg/ml的标准溶液。取20μl标准溶液，加入0.1μg的ScGFP，并用PBS定容至190μl，室温放置10min后，加入10μl的氧化石墨烯，混匀、室温放置10min。用荧光分光光度计(F-4600，日立)进行荧光强度测定，并依据标准溶液浓度和相对应的荧光强度进行标准曲线的绘制。所得的标准曲线为：F＝2.98C+126.09，其中F代表的为荧光强度，C代表的是肝素的浓度。

[0043] 取20μl待测样品，然后加入0.1μg的ScGFP，并用PBS定容至190μl，室温放置10min后，加入10μl的氧化石墨烯，混匀、室温放置10min。用荧光分光光度计(F-4600，日立)进行荧光强度测定。测得的荧光强度为140.2，带入标准曲线可得血清样品中肝素的浓度为4.73μg/ml。

[0044] 实施例5、用ScGFP对被过硫酸化硫酸软骨素(OSCS)污染的肝素进行检测[0045] 含有不同含量OSCS的肝素10μg，用肝素酶I、II、和III适度降解。向10mM Tris-Cl100mM NaCl溶液中加入0.01-0.5μg的ScGFP，然后向溶液中加入污染的肝素使其终浓度为0-50μg/ml，室温放置10min后，加入10μl的氧化石墨烯，补加10mM Tris-Cl 100mMNaCl缓冲液使其总体积为200μl，混匀、室温放置10min.最后用荧光分光光度计(F-4600， 日立)进行测定。结果显示，OSCS的含量大于10-6％时，用本发明所述的方法检测，结果如图4所示，比现在存在的大部分检测肝素污染的方法都要简单和灵敏。

[0046] 实施例6、用ScGFP对细胞表面的糖胺聚糖进行可视化检测

[0047] 在直径为35mm的盖玻片底培养皿上培养适量的A549细胞，共培养5盘，其中一盘用肝素酶I、II、和III处理，一盘用硫酸软骨素降解酶ABC处理，一盘用两种酶共处理，还有两盘不用酶处理,30℃处理1-5h。将所有的5盘细胞都用DAPI进行染色，除了一盘不用酶处理的细胞不加入ScGFP作为阴性对照，其余的加入0.1-10μg ScGFP(200μl PBS)孵育5-30min，然后用100-1,000μl PBS洗涤2-5次。进行共聚焦显微镜观察(LSM 700，Zeiss)。激发波长分别为405nm和488nm。结果显示，与对照相比，ScGFP对细胞表面强烈染色，用酶肝素酶或硫酸软骨素酶分别处理，细胞的ScGFP荧光染色显著减弱；加入两种酶时，细胞表面荧光染色基本消除(如图5)。说明ScGFP可以特异性的与细胞表面的糖胺聚糖结合，同时验证ScGFP有较好的组织相容性，可以用于后细胞和组织的糖胺聚糖的检测。

[0048] 用直径为10cm细胞培养皿培养满2板293T细胞，然后将细胞吹悬，平均分成4份。一份用肝素酶I、II、和III处理，一份用硫酸软骨素降解酶ABC处理，一盘用两种酶共处理，还有两份不用酶处理,用PBS补齐500μl，30℃处理1-5h。处理后用PBS洗涤2-5次，每次1-5ml。然后每份加入0.5-3μg ScGFP(100μl)，室温放置10min。用PBS洗涤2-5次，每次1-5ml。最后过滤进行流式细胞仪(FACS Aria III，BD)分析。结果显示，与对照相比，用酶处理的细胞的ScGFP荧光强度变弱；加入两种酶时，荧光强度最弱(如图6)。这也说明ScGFP可以特异性的与细胞表面的糖胺聚糖结合，并且利用该方法可以对细胞表面的糖胺聚糖进行定量分析。

[0049] 参考文献

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