一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒

摘要

本发明属于家禽性别检测技术领域，具体涉一种鸭胚早期性别鉴定的方法及专用试剂盒。本发明通过采集孵化早期鸭胚尿囊液，利用针对雌二醇检测的单克隆抗体，及抗原抗体反应，建立鸭胚早期性别鉴定方法。根据雌性胚胎中雌二醇含量高于1ng/ml，雄性胚胎中雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定雌雄性别。本发明可以在孵化早期鉴定雌雄性别并且不影响胚胎的继续发育，有益于动物福利和降低垂直疾病的传播。

权利要求

1.一种鸭胚早期性别鉴定的间接ELISA方法，其步骤包括制备酶标板和样品处理，其特征在于下列步骤:(1)从孵化机中取出鸭胚，大头向上，静置3-5min，利用照蛋器照蛋，寻找抽取尿囊液的定位处，在定位开口抽取尿囊液的区域，避开血管分布处，定位后做上标记，用75％酒精溶液消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存于-20℃冰箱备用；

(2)配制ELISA核心试剂，该核心试剂包括：雌二醇蛋白包被的酶标板，雌二醇单克隆抗体，标准品，标准品稀释剂，显色剂，终止液，洗涤液和酶标二抗；所述的标准品为雌二醇，所述的标准品稀释剂为含有1％氯化钾的1×磷酸盐缓冲液，所述的显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所述的终止液为2mol/l的稀硫酸，所述的洗涤液为0.01mol/L PBST；所述的酶标二抗为山羊抗小鼠IgG；

按如下步骤制备得到：

1)ELISA酶标板的包被：以雌二醇蛋白作为抗原，用pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至包被浓度0.2μg/mL，包被ELISA酶标板，加入封闭液，制备包被好的酶标板；

2)山羊抗小鼠酶标二抗的制备：将山羊抗小鼠IgG-HRP酶标抗体，用1×磷酸盐缓冲液按体积比1:600稀释成工作浓度，再用0.22μm的滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

3)显色剂的制备：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于二甲亚砜制成；

4)终止液的制备：将浓硫酸配制为2mol/L的稀硫酸；

5)洗涤液的制备：

a.储备液A液和储备液B液

0.2mol/L的储备液A液：将6.2404g的NaH2PO4·2H2O溶于200ml ddH2O中；

0.2mol/L的储备液B液：将71.628g的Na2HPO4·12H2O溶于1000ml ddH2O中；

b.0.01mol/L的PBST缓冲液

将0.2mol/L的储备液A液47.5ml，0.2mol/L的储备液B液202.5ml，ddH2O 4747.5ml，NaCl 

45g，1N的NaOH 10ml和吐温-20 2.5ml，混合；

6)封闭液的制备：将5g脱脂乳溶于100ml洗涤液中得到封闭液；

(3)标准品浓度梯度的确定及检测步骤：

1)标准品浓度梯度的确定：设置标准品梯度浓度依次为0ng/ml，0.05ng/ml，0.15ng/ml，0.45ng/ml，1.0ng/ml和2.0ng/ml；

2)检测步骤：

a.将配制的核心试剂及收集的待测样品鸭胚尿囊液移至20-25℃室温下进行平衡至少

30min；

b.取一块酶标板，在酶标板的每孔中依次添加标准品浓度梯度试剂，然后按顺序在每孔中加入待检鸭胚尿囊液50μL，此后再加入雌二醇单克隆抗体50μL，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；

c.取出步骤b的酶标板，甩干酶标板孔内的液体，按250μL/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

d.向酶标板的孔中加入100μL山羊抗小鼠IgG-HRP，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；

e.取出酶标板，甩干孔内液体，按250μL/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡

30秒，在吸水纸上拍干；

f.在酶标板的每孔中加入显色剂100μL，轻轻震荡，于37℃避光显色15min；

g.向酶标板的每孔中加入终止液50μL，当酶标板的小孔中的颜色由蓝色转为黄色时判定为终止反应；

h.加入终止液后5min内立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值；

2 2

i.标准曲线公式的拟合：Y＝1.6474X -3.662X+0.6417和Y＝1.3414X -3.4603X+

0.6809；

(4)结果判定

将待测样品的OD值带入i步骤所示的公式得到样品中雌二醇的含量；当测定的样品中的雌二醇含量高于1ng/ml时，判定为雌性；当测定的样品中的雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定为雄性。

说明书

一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于家禽性别鉴定技术领域，具体涉及一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒。

背景技术

[0002] 鸭的性别鉴定方法一般为外观鉴定法、摸肛鉴定法、声音鉴定法和分子鉴定法。外观鉴定法根据公母鸭的体型外貌特征区别，常有误判；摸肛鉴定法虽然准确率较高，存在一些垂直传播病菌交叉感染的风险，摸肛对技术要求比较高，需要生产实践经验丰富才能保证准确率；声音鉴定法需要鸭的鸣管发育好后才能区别，在出壳至青年期很难区分；分子鉴定法虽然简单准确，利用性染色体上(Z染色体、W染色体)特殊基因的片段大小不同而判定性别，在胚胎期鉴定性别以终止胚胎发育为代价，不能做到鉴定性别后胚胎仍然可以继续孵化出壳。

[0003] 现有专利US6506570B1利用放射性免疫法鉴定了禽类性别，然而，放射性法由于存在污染的危害，现在已经很少使用。而且国外试剂盒成本非常高，一般研究单位很难承受昂贵的成本。国内有南京某公司建立了基于生物素双抗体夹心技术原理的ELISA试剂盒，在检测了我们收集的尿囊液样品后，无法利用检测结果区别雌雄性别。而且，建立小分子的酶联免疫试剂盒一般不适用生物素双抗体夹心技术原理。因此，目前生产上急需开发一种方法简单、重复性好、成本低、方便取样的性别鉴定方法及检测试剂盒，既能准确快速在早期鉴定鸭的胚胎性别，又能大大降低成本。这种方法易于实施，取样后胚胎可以继续孵化出壳，还可替代出壳后雌雄分开的人工性别鉴定，防止了由于翻肛鉴定导致垂直疾病的传播，不存在将不需要的公鸭或母鸭杀死而导致的动物福利问题。

[0004] 尽管ELISA检测方法和试剂盒是一个常用的技术，到目前为止还未见有禽类性别鉴定方法尤其是鸭胚性别鉴定方法中采用间接ELISA方法的报道，

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用间接ELISA方法建立一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒。本发明实现了方便简洁的获取试验样本和建立一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒，减少因传统出壳后的翻肛鉴定性别导致垂直传播疾病的继续流行的弊端，对鸭胚早期性别鉴定准确率达到100％。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现：

[0007] 申请人建立了一种鸭胚早期性别鉴定的间接ELISA方法，其步骤包括制备酶标板和样品处理，具体包括下列步骤:

[0008] (1)从孵化机中取出鸭胚，大头向上，静置3-5min，利用照蛋器照蛋，寻找抽取尿囊液的定位处，在定位开口抽取尿囊液的区域，避开血管分布处，定位后做上标记，用75％酒精溶液消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存于-20℃冰箱备用；

[0009] (2)配制ELISA核心试剂，所述核心试剂包括：雌二醇蛋白包被的酶标板(购自武汉华美生物工程有限公司)，雌二醇单克隆抗体(购自武汉华美生物工程有限公司)，标准品，标准品稀释剂，显色剂，终止液，洗涤液和酶标二抗；所述的标准品为雌二醇，所述的标准品稀释剂为含有1％氯化钾的1×磷酸盐缓冲液，所述的显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所述的终止液为2mol/l的硫酸，所述的洗涤液为0.01mol/L PBST；所述的酶标二抗为山羊抗小鼠IgG；

[0010] 按如下步骤制备得到：

[0011] 1)ELISA酶标板的包被：以雌二醇蛋白作为抗原，用pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至包被浓度0.2ug/mL，包被ELISA酶标板，加入封闭液(5g脱脂乳溶于100ml洗涤液)，制备包被好的酶标板；

[0012] 2)山羊抗小鼠酶标二抗的制备：将山羊抗小鼠IgG-HRP酶标抗体，用1×磷酸盐缓冲液按体积比1:600稀释成工作浓度，再用0.22μm的滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0013] 3)显色剂的制备：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于二甲亚砜制成；

[0014] 4)终止液的制备：将浓硫酸配制为2mol/L的盐酸；

[0015] 5)洗涤液的制备：

[0016] a.储备液A液和储备液B液

[0017] 0.2mol/L的储备液A液：将6.2404g的NaH2PO4·2H2O溶于200ml ddH2O中；

[0018] 0.2mol/L的储备液B液：将71.628g的Na2HPO4·12H2O溶于1000ml ddH2O；

[0019] b.0.1mol/L PBST缓冲液，pH＝7.2-7.4

[0020] 将0.2mol/L PBST缓冲液A液95ml+，0.2mol/L B液405ml，ddH2O 500ml，NaCl 8.5g和0.05％吐温-20混合；

[0021] c.0.01mol/L的PBST缓冲液

[0022] 将0.2mol/L的储备液A液47.5ml，0.2mol/L的储备液B液202.5ml，ddH2O 4747.5ml，NaCl 45g，1N的NaOH 10ml和吐温-20 2.5ml混合；

[0023] (3)标准品浓度梯度的确定及检测步骤：

[0024] 1)标准品浓度梯度的确定：设置标准品梯度浓度依次为0ng/ml，0.05ng/ml，0.15ng/ml，0.45ng/ml，1.0ng/ml和2.0ng/ml；

[0025] 2)检测步骤：

[0026] a.将配制的核心试剂及收集的待测样本移至20-25℃室温下进行平衡至少30min；

[0027] b.取一块酶标板，在酶标板的每孔中依次添加标准品浓度梯度试剂，然后按顺序在每孔中加入待检鸭胚尿囊液50μL，此后再加入雌二醇单克隆抗体50μL，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；

[0028] c.取出步骤b的酶标板，甩干酶标板孔内的液体，按250μL/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

[0029] d.向酶标板的孔中加入100μL山羊抗小鼠IgG(购自武汉谷歌生物科技有限公司)，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；

[0030] e.取出酶标板，甩干孔内液体，按250μL/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

[0031] f.在酶标板的每孔中加入显色剂100μL，轻轻震荡，于37℃避光显色15min；

[0032] g.向酶标板的每孔中加入终止液50μL，当酶标板的小孔中的颜色由蓝色转为黄色时判定为终止反应；

[0033] h.加入终止液后5min内立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值(标准曲线公式如图3和图4)；

[0034] i.标准曲线公式的拟合：如图3所示，Y＝1.6474x2-3.662x+0.6417，和如图4所示，Y＝1.3414x2-3.4603x+0.6809；

[0035] (4)结果判定

[0036] 将样品的OD值带入如图3和图4所示的公式得到样品中雌二醇的含量；当测定的样品中的雌二醇含量高于1ng/ml时，判定为雌性；当测定的样品中的雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定为雄性。

[0037] 基于上述方法，申请人研制了一种鸭胚早期性别鉴定的ELISA试剂盒，其包括固相载体，酶标板、显色剂、终止液和洗涤液；所述的试剂盒还包括一抗雌二醇单克隆抗体，酶标二抗山羊抗小鼠IgG，标准品，标准品稀释剂和板贴，所述的固相载体为雌二醇蛋白，所述的标准品为雌二醇，所述的标准品雌二醇的浓度依次设置为0ng/ml，0.05ng/ml，0.15ng/ml，0.45ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml梯度；所述的标准品稀释剂为含有1％氯化钾的1×磷酸盐缓冲液，所述的显色剂是将3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶于二甲亚砜获得；所述的终止液为
2mol/L的硫酸。

[0038] 本发明的ELISA试剂盒可在鸭胚早期性别鉴定的间接ELISA方法中的应用，优选是荆江麻鸭和白改鸭胚胎早期性别鉴定。

[0039] 与现有技术相比本发明的积极效果是：

[0040] (1)本发明取样方法不影响鸭胚胎的继续正常发育。

[0041] (2)本发明建立的检测方法利于动物福利并能降低垂直疾病传播。

[0042] (3)本发明的原材料来源稳定，方法简单易行，能够在鸭胚胎发育早期中使用。

[0043] (4)本发明建立的检测试剂盒结果稳定、重复性好，对鸭胚早期性别鉴定准确率达到100％且检测成本较低，适合基层单位推广应用。

附图说明

[0044] 图1：是本发明的间接竞争ELISA法技术流程图。

[0045] 图2：本发明的试剂盒组装流程。

[0046] 图3：是白改鸭尿囊液测定时制作的标准曲线及拟合的标准曲线公式。

[0047] 图4：是荆江麻鸭尿囊液测定时制作的标准曲线及拟合的标准曲线公式。

具体实施方式

[0048] 下面结合实例，对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

[0049] 实施例1前期样本的收集及核心试剂的配制

[0050] 1、鸭胚尿囊液的收集

[0051] 从孵化机中取出鸭胚(品种为荆江麻鸭或白改鸭，但不限于这两个品种)，大头向上，静置3-5min，利用照蛋器照蛋，寻找抽取尿囊液的定位处，在定位开口抽取尿囊液的区域应避开血管分布处，作标记，用75％酒精消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存于-20℃冰箱备用；

[0052] 2、利用抗原蛋白(雌二醇蛋白)包被酶标板

[0053] 将终浓度为40μg/ml的雌二醇蛋白(购自武汉华美生物工程有限公司)用包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液：Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g,用ddH2O定容至1000ml，pH9.6)分别进行体积比1:200稀释(终浓度均为0.2μg/ml)，雌二醇蛋白以1:1的体积比按每孔100μl的量加到酶标板(购自武汉华美生物工程有限公司)中，置4℃下作用10～12h；弃去包被液，用洗涤液(见《发明内容》中试剂盒的洗涤液配方)洗涤2～3次，每次2min，甩干洗涤液，每孔加封闭液(5g脱脂乳溶于100ml洗涤液)100μl，置37℃下温育100min；拍干，再置37℃下干燥30min，用锡箔封口膜将抗原包被板封闭，置4℃下保存。

[0054] 3、二抗和核心试剂的制备

[0055] 1)山羊抗小鼠酶标二抗：将山羊抗小鼠IgG(购自武汉谷歌生物科技有限公司)，用1×磷酸盐缓冲液按体积比1:100稀释成工作浓度，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0056] 2)显色剂的制备：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶于二甲亚砜(DMSO)制成；

[0057] 3)终止液的制备：将浓硫酸配制为2mol/L含量的稀硫酸；

[0058] 4)洗涤液的制备：

[0059] a.储备液A液和储备液B液

[0060] 0.2mol/L储备液A液：将6.2404g的NaH2PO4·2H2O溶于200ml ddH2O中；

[0061] 0.2mol/L储备液B液：将，71.628g的Na2HPO4·12H2O溶于1000ml ddH2O；

[0062] b.0.1mol/L PBST缓冲液(pH＝7.2-7.4)：

[0063] 取0.2mol/L的储备液A液95ml，0.2mol/L B液405ml，ddH2O 500ml。NaCl 8.5g，0.05％吐温-20进行混合；

[0064] c.0.01mol/L PBST缓冲液

[0065] 0.2mol/L储备液A液47.5ml，0.2mol/L B液202.5ml，ddH2O 4747.5ml，NaCl 45g，1N的NaOH 10ml和吐温-20 2.5ml进行混合；

[0066] 5)封闭液的制备：将5g脱脂乳溶于100ml洗涤液中得到。

[0067] 实施例2雌二醇标准品稀释浓度的确定及标准曲线的制作

[0068] 本发明经过多次摸索测定条件确定标准品雌二醇的浓度依次设置为0ng/ml，0.05ng/ml，0.15ng/ml，0.45ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml。

[0069] 利用CurveExpert软件拟合标准曲线并获得标准曲线公式。

[0070] 按照如下检测步骤进行检测：

[0071] a.将配制的试剂及收集的待测样品(即鸭胚尿囊液)移至20-25℃室温下进行平衡至少30min；

[0072] b.取一块酶标板，在酶标板的每孔中依次添加标准品浓度梯度，然后向每孔中按顺序加入待检鸭胚尿囊液50μL，此后加入雌二醇单克隆抗体(购自武汉华美生物工程有限公司产品)50μL，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；

[0073] c.取出该酶标板，甩干酶标板孔内的液体，按250μL/孔用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

[0074] d.向酶标板的孔中加入100μL山羊抗小鼠IgG，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；

[0075] e.取出酶标板，甩干孔内液体，按250μL/孔用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

[0076] f.在酶标板的每孔中加入显色剂100μL，轻轻震荡，于37℃避光显色15min；

[0077] g.向酶标板的每孔中加入终止液50μL，当酶标板的小孔中的颜色由蓝色转为黄色时判定为终止反应；

[0078] h.在加入终止液后5min内立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值。

[0079] i.标准曲线公式的拟合：用CurveExpert软件拟合标准曲线并获得标准曲线公式。如图3，其中：Y＝1.6474x2-3.662x+0.6417；以及如图4，Y＝1.3414x2-3.4603x+0.6809。

[0080] 实施例3检测方法的应用实例1

[0081] 利用常规的白改鸭胚尿囊液样本和建立的白改鸭标准曲线公式测定白改鸭胚尿囊液中雌二醇含量，从而可以准确鉴定白改鸭雌雄胚胎性别。具体方法如下：

[0082] (1)取14d胚龄的白改鸭(从中国福建省某鸭场采集，但本发明不限于该品种)胚胎尿囊液100ul，共22个样本，根据雌雄性腺发育外形的差别肉眼判定并记录性别，其中雄性样本10个，雌性样本12个，放于-20℃保存备用；

[0083] (2)利用间接竞争ELISA法[1]测定雌二醇含量(按照实施例2操作步骤)。建立标准曲线(见图3)，建立标准曲线计算公式Y＝1.6474x2-3.662x+0.6417，所有样品在ELISA测定雌二醇含量时不标记雌雄性别；

[0084] (3)根据图3所述的白改鸭的标准曲线及计算公式Y＝1.6474x2-3.662x+0.6417计算样品中雌二醇的含量，并与先前记录的雌雄性别对应，最后根据雌雄性腺中雌二醇含量的分布建立雌雄性别判定标准。并统计鉴定结果的准确性。结果如表1。

[0085] 表1 14d胚龄白改鸭鸭胚中雌性、雄性雌二醇含量的检测结果

[0086]

[0087] 根据图3所述的标准曲线计算出所有样品的雌二醇含量，发现雌性性腺中雌二醇含量全部高于1ng/ml，雄性性腺中雌二醇含量全部低于0.2ng/ml，本发明的鉴定准确率达100％。

[0088] 实施例4检测方法的应用实例2

[0089] 利用常规的荆江麻鸭尿囊液样本和建立的荆江麻鸭标准曲线公式测定荆江麻鸭尿囊液中雌二醇含量，从而可以准确鉴定荆江麻鸭雌雄胚胎性别。

[0090] 具体方法如下：

[0091] (1)取15d胚龄到22d胚龄的荆江麻鸭(样品采自湖北省荆州市，但本发明不限于该品种)胚胎尿囊液100ul，共119个样本，全部根据雌雄性腺形态差异用肉眼首先判断并记录性别，雄性样品65个，雌性样本54个，放于-20℃保存备用；

[0092] (2)利用间接竞争ELISA法测定荆江麻鸭雌二醇含量(按照实施例2操作步骤)。用CurveExpert软件拟合标准曲线(荆江麻鸭含量标准曲线见图4)并获得标准曲线公式，Y＝1.3414x2-3.4603x+0.6809，所有样品在ELISA测定雌二醇含量时不标记雌雄性别；

[0093] (3)根据图4所示的标准曲线及计算公式Y＝1.3414x2-3.4603x+0.6809计算样品中雌二醇含量，并与先前记录的雌雄性别对应，最后根据雌雄性腺中雌二醇含量的分布建立雌雄性别判定标准。并统计鉴定结果的准确性。结果如表2和表3。

[0094] 表2 15--22d胚龄雄性荆江麻鸭尿囊液中雌二醇含量

[0095]

[0096] 表3 15--22d胚龄雌性荆江麻鸭尿囊液中雌二醇含量

[0097]

[0098]

[0099] 根据标准曲线计算出所有样品的雌二醇含量，发现雌性性腺中雌二醇含量全部高于1ng/ml，雄性性腺中雌二醇含量全部低于0.6ng/ml，鉴定准确率达100％。综合实施例3与实施例4的检测结果，本发明的试剂盒根据雌二醇含量判定雌雄性别的标准为：当测定的雌二醇含量高于1ng/ml，判定为雌性；当测定雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定为雄性，本鉴定结果准确率达100％。

[0100] 实施例5鸭胚早期性别鉴定方法的重复性试验

[0101] 本实施例用3块不同批次的包被抗原的酶标板同时检测5个荆江麻鸭尿囊液样本(按照实施例2操作步骤)。获得5个样本的雌二醇含量结果，计算平均值与标准差。CV(％)＝标准差/平均值×100％。结果显示：5个荆江麻鸭样本的变异系数分别为5.2％，2.9％，7.0％，4.8％，1.1％，变异系数均小于10％。通过本发明重复性试验，表明本发明的ELISA方法重复性好。结果见表4。

[0102] 表4 鸭胚早期性别鉴定方法的重复性试验

[0103]

[0104] 实施例6

[0105] 利用市场上现有试剂盒检测鸭胚尿囊液含量，比较现有ELISA试剂盒的检测效果。

[0106] 1、鸭胚尿囊液的收集

[0107] 从孵化机中取出鸭胚(品种为白改鸭，来源同上，孵化期14d-24d胚龄)，大头向上，静置3-5min，利用照蛋器照蛋，寻找定位处，在定位开口抽取尿囊液的区域应避开血管分布处，作标记，用75％酒精消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存于-20℃冰箱备用；

[0108] 2、利用市场上购买的南京某公司基于生物素双抗体夹心技术原理的生产的ELISA试剂盒检测，按照试剂盒提供的组分和操作步骤获得如表5所示的结果：

[0109] 1)拟合标准曲线公式：y＝45.019-0.6336

[0110] 2)利用标准曲线公式计算雌二醇含量(参见表5)：

[0111] 表5 现有ELISA试剂盒检测鸭胚尿囊液中雌二醇含量的结果分析

[0112]

[0113] 3)将获得的白改鸭雌二醇含量值与记录的性别对应，发现各不同时期雌雄个体检出的雌二醇含量没有显著差异，无法靠雌二醇含量区别雌雄性别。比较实施例6与实施例4、5，结果表明，一种鸭胚早期性别鉴定专用试剂盒检测结果区分度好，重复性好，结果可靠。
现有试剂盒不能区分雌雄胚胎尿囊液中雌二醇含量。

[0114] 实施例7

[0115] 鸭胚早期性别鉴定专用试剂盒的组装

[0116] 申请人组装了一种鸭胚早期性别鉴定专用试剂盒(表6)包括：

[0117] 表6 一种鸭胚早期性别鉴定专用试剂盒组装

[0118]组份 96T 48T
酶标板 96孔 48孔
标准品 6x 1mL/瓶 6x 0.5mL/瓶
酶结合物(酶标二抗) 1x 12mL/瓶 1x 6mL/瓶
抗体 1x 7mL/瓶 1x 3.5mL/瓶
显色液 1x 12mL/瓶 1x 6mL/瓶
终止液 1x 10mL/瓶 1x 5mL/瓶

[0119]样本稀释液 1x 50mL/瓶 1x 25mL/瓶
洗涤液(10×) 1x 50mL/瓶 1x 25mL/瓶
板贴 4 4

[0120] 2、相关试剂的配制

[0121] 1)山羊抗小鼠酶标二抗：将山羊抗小鼠IgG-HRP酶标抗体，用1×磷酸盐缓冲液按体积比1:600稀释成工作浓度，再用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；

[0122] 2)显色剂的制备：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶于二甲亚砜(DMSO)制成；

[0123] 3)终止液的制备：利用浓硫酸配制为2mol/L稀硫酸；

[0124] 4)洗涤液的制备：

[0125] a.储备液A液和储备液B液

[0126] 0.2mol/L储备液A液：将6.2404g的NaH2PO4·2H2O溶于200ml ddH2O中；

[0127] 0.2mol/L储备液B液：将71.628g的Na2HPO4·12H2O溶于1000ml ddH2O；

[0128] b.0.1mol/L PBST缓冲液(pH＝7.2-7.4)：

[0129] 取0.2mol/L储备液A液95ml+0.2mol/L储备液B液405ml+ddH2O 500ml+NaCl 8.5g+0.05％吐温-20，混合；

[0130] c.0.01mol/L PBST缓冲液：

[0131] 取0.2mol/L储备液A液47.5ml+0.2mol/L储备液B液202.5ml+ddH2O 4747.5ml+NaCl 45g+1N NaOH 10ml+吐温-20 2.5ml，混合；

[0132] 5)封闭液的制备：将5g脱脂乳溶于100ml洗涤液中得到。

[0133] 3、试剂盒操作步骤：

[0134] a.将配制的核心试剂及收集的待测样本移至20-25℃室温下进行平衡至少30min；

[0135] b.取一块酶标板，在酶标板的每孔中依次添加标准品浓度梯度(参见实施例2的浓度梯度)，然后顺序向酶标板的每孔中加入待检鸭胚尿囊液50μL，此后加入雌二醇单克隆抗体50μL，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃下反应30min；

[0136] c.取出酶标板，甩干酶标板孔内的液体，按250μL/孔用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

[0137] d.向酶标板的每孔中加入100μL山羊抗小鼠IgG，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃下反应30min；

[0138] e.取出酶标板，甩干孔内液体，按250μL/孔用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；

[0139] f.在酶标板的每孔中加入显色溶液100μL，轻轻震荡，于37℃避光显色15min；

[0140] g.向酶标板的每孔中加入终止液50μL，当酶标板的小孔中的颜色由蓝色转为黄色时判定为终止反应；

[0141] h.在加入终止液后5min内立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值；

[0142] i.利用标准曲线公式进行拟合(标准曲线分别参见图3和图4)。

[0143] 4、结果判定

[0144] 将样品的实际OD值带入标准曲线公式得到样品中雌二醇的含量；当测定样品中雌二醇含量高于1ng/ml，判定为雌性；当测定样品中雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定为雄性。

[0145] 综上所述的实施例，仅是本发明的较佳实施例，并非是本发明的全部实施例，也不是对本发明做任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例做任何简单修改、变更及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

[0146] 主要参考文献：

[0147] [1]高纪振等.山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法的建立，西北农林科技大学学报(自然科学版.2009,37(8)：25-30.

[0148] [2]Mikhail G,,et al..Radioimmunoassay of plasma estrone and estradiol.Steroids.1970,15(3):333–352.

[0149] [3]Dhar TK,Samanta AK,Ali E.Homogeneous enzyme immunoassay of estradiol using estradiol-3-0-carboxymethyl ether as hapten.Steroids.1988,51(5-6):519-526

[0150] [4]Jabri JE.Enzyme immunoassay for plasma estradiol using a monoclonal antibody.The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.1991,38(3):339-343.