一种用黄芩苷制备黄芩素的方法转让专利
申请号 : CN201510147657.5
文献号 : CN104710392B
文献日 : 2016-06-01
发明人 : 王慧 , 张立伟 , 陈够娟
申请人 : 山西大学
摘要 :
本发明提供了一种用黄芩苷制备黄芩素的方法，是以低共熔溶剂为水解媒介，酶法水解黄芩苷制备黄芩素的新方法。本发明的优点在于采用挥发性低、安全无毒的绿色溶剂--低共熔溶剂的水溶液为水解媒介,克服了现有技术所存在的对黄芩苷的破坏作用大，转化率低，污染严重，分离纯化工艺复杂等缺点。该制备方法简单易行、安全环保，利用黄芩苷含量为80％的原料制备黄芩素，黄芩苷的转化率可达90％以上、黄芩素的纯度可达75％以上。
权利要求 :
1.一种用黄芩苷制备黄芩素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)黄芩粗酶粉的制备：按质量比1:1.5～2.5取新鲜黄芩和pH为4～6的缓冲液，加入少量石英砂，研磨、离心过滤，得到黄芩粗酶液，粗酶液经过滤，透析，真空冷冻干燥得黄芩粗酶粉；
(2)酶水解黄芩苷：取含量至少80％的黄芩苷，用低共熔溶剂溶解，再依次加入pH为4～
6的缓冲液、黄芩粗酶粉，混合均匀，加热至40～50℃，保温、搅拌反应2.0～4.0小时，冷却至室温，过滤，回收沉淀物，滤液可再次用于水解黄芩苷；其中：黄芩苷、低共熔溶剂、缓冲液、黄芩粗酶粉的质量比为1:40～60:150～250:0.025～0.1；
(3)黄芩素纯化：将上述得到的沉淀物用95％的乙醇溶解，过滤，弃去不溶物；滤液中加入5～6倍量去离子水，搅拌均匀，静置，析出黄芩素，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤至少3次，过滤、干燥，得精制黄芩素。
2.如权利要求1所述的一种用黄芩苷制备黄芩素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中新鲜黄芩和缓冲液的质量比1:2。
3.如权利要求1所述的一种用黄芩苷制备黄芩素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中黄芩苷、低共熔溶剂、缓冲液、黄芩粗酶粉的质量比为1:50:200:0.025～0.1。
4.如权利要求1、2或3所述的一种用黄芩苷制备黄芩素的方法，其特征在于，所述的低共熔溶剂是通过如下方法制备得到：按摩尔比1:0.5～2将氯化胆碱和尿素混合，在60～90℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。
5.如权利要求1、2或3所述的一种用黄芩苷制备黄芩素的方法，其特征在于，所述的缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液或磷酸-磷酸盐缓冲液。
说明书 :
一种用黄芩苷制备黄芩素的方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及黄芩素的制备方法，具体地说是一种用黄芩苷制备黄芩素的方法。背景技术：
[0002] 黄芩苷和黄芩素为中药黄芩的主要活性成分。目前大量药物代谢研究表明，黄芩苷经口服后，在消化系统内被肠道菌群转化为苷元才能被吸收利用(Lai,et al.,2003)，因此，黄芩苷的生物利用率较低，而黄芩素容易被吸收，生物利用度高(赵晶等，1998)。此外，大量体内外药理活性研究表明，黄芩素的药理活性也远高于黄芩苷，尤其是清除自由基及抗氧化(Gao,et al.，1999)、抗艾滋病毒(Wu,ea al.,2001)、抗血管生成(Liu,et al.，2003)作用等方面。由于黄芩素在黄芩药材中含量低微，无直接提取价值，所以目前涉及黄芩素的制备主要有三种方式。第一是利用化工原料进行有机合成制备(申请号
200410008987.8)，有机合成法的大量制备，可能成本较低，但由于使用大量有机溶剂，存在对环境污染较大的问题。第二是利用含黄芩自身酶或其它酶的水溶液提取黄芩药材，在黄芩苷被提取出的同时又被黄芩自身酶或其它酶水解而转化为黄芩素，然后再利用有机溶剂萃取、柱分离等方式进一步纯化获得高纯度的黄芩素(申请号201110422999.5)。该方法虽然具有一定的优势，但由于含酶的水溶液对黄芩苷的溶解度较小，因而水解效率较低。此外，因而后续处理较复杂。第三是采用酸水解(申请号200410019726.6，200302129372.4)和含黄芩苷水解酶的水溶液直接水解黄芩苷制备黄芩素(申请号200410020649.6)。酸水解法需要在100℃下水解16-20小时，反应时间长，且如入强酸对黄芩苷破坏较大，环境污染严重。酶法水解黄芩苷葡萄糖醛酸基制备黄芩素的方法虽然克服了污染严重的缺点，但同样由于含酶的水溶液对黄芩苷的溶解度较小，反应时间长，水解效率较低。
200410008987.8)，有机合成法的大量制备，可能成本较低，但由于使用大量有机溶剂，存在对环境污染较大的问题。第二是利用含黄芩自身酶或其它酶的水溶液提取黄芩药材，在黄芩苷被提取出的同时又被黄芩自身酶或其它酶水解而转化为黄芩素，然后再利用有机溶剂萃取、柱分离等方式进一步纯化获得高纯度的黄芩素(申请号201110422999.5)。该方法虽然具有一定的优势，但由于含酶的水溶液对黄芩苷的溶解度较小，因而水解效率较低。此外，因而后续处理较复杂。第三是采用酸水解(申请号200410019726.6，200302129372.4)和含黄芩苷水解酶的水溶液直接水解黄芩苷制备黄芩素(申请号200410020649.6)。酸水解法需要在100℃下水解16-20小时，反应时间长，且如入强酸对黄芩苷破坏较大，环境污染严重。酶法水解黄芩苷葡萄糖醛酸基制备黄芩素的方法虽然克服了污染严重的缺点，但同样由于含酶的水溶液对黄芩苷的溶解度较小，反应时间长，水解效率较低。
[0003] 低共熔溶剂是一类由天然物质合成的、可再生的、易大量合成的新型绿色溶剂，它具有低于室温的熔点，低的挥发性和高的热稳定性，更重要的是脂肪酶水解酶、糖苷水解酶等在低共熔溶剂中仍表现出良好的催化活性。例如，脂肪酶在低共熔溶剂中可较好的催化戊酸乙酯转化为戊酸丁酯的酯交换反应(Johnathan T.Gorke，Chem.Commun.,2008)。因此，低共熔溶剂在水解酶催化生物转化方面具有广泛的应用前景。目前尚未见到关于以低共熔溶剂为溶剂，酶催化水解黄芩苷制备黄芩素的报导。发明内容：
[0004] 本发明目的在于提供一种绿色环保、效率高、简单易行的由黄芩苷制备黄芩素的方法。
[0005] 本发明提供的一种由黄芩苷制备黄芩素的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)黄芩粗酶粉的制备：按质量比1:1.5～2.5取新鲜黄芩和pH为4～6的缓冲液，加入少量石英砂，研磨、离心过滤，得到黄芩粗酶液，粗酶液经过滤，透析，真空冷冻干燥得黄芩粗酶粉；
[0007] (2)酶水解黄芩苷：取含量至少80％的黄芩苷，用低共熔溶剂溶解，再依次加入pH为4～6的缓冲液、黄芩粗酶粉，混合均匀，加热至40～50℃，保温、搅拌反应2.0～4.0小时，冷却至室温，过滤，回收沉淀物，滤液可再次用于水解黄芩苷；其中：黄芩苷、低共熔溶剂、缓冲液、黄芩粗酶粉的质量比为1:40～60:150～250:0.025～0.1；
[0008] (3)黄芩素纯化：将上述得到的沉淀物用95％的乙醇溶解，过滤，弃去不溶物；滤液中加入5～6倍量去离子水(体积比)，搅拌均匀，静置，析出黄芩素，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤至少3次，过滤、干燥，得精制黄芩素。
[0009] 步骤(1)中新鲜黄芩和缓冲液的质量比优选1:2。
[0010] 步骤(2)中黄芩苷、低共熔溶剂、缓冲液、黄芩粗酶粉的质量比优选1:50:200:0.025～0.1。
[0011] 步骤(2)中所述的低共熔溶剂为一种铵盐和一种氢键给体化合物按1:0.5～2(摩尔比)的比例混合，在60～90℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。其中的铵盐优选氯化胆碱，氢键给体化合物优选尿素。
[0012] 所述的缓冲液可为乙酸-乙酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、磷酸-磷酸盐缓冲液中的任一种缓冲液。
[0013] 本发明利用黄芩苷含量为80％的原料制备黄芩素，黄芩苷的转化率可达90％以上、黄芩素的纯度可达75％以上。
[0014] 与现有技术相比本发明具有如下优点：
[0015] (1)本发明的制备方法使用的低共熔溶剂水溶液对黄芩酶和黄芩苷均有较好的溶解度，因此，黄芩苷水解效率高，黄芩苷的转化率可达90％以上、黄芩素的纯度可达75％以上。
[0016] (2)本发明使用溶剂为低共熔溶剂，具有低于室温的熔点，低的挥发性，高的热稳定性和安全无毒，并可回收再利用，是一种绿色环保溶剂。
[0017] (3)本发明的制备方法中未使用有机溶剂(除少量乙醇外)和酸碱，对环境无污染。附图说明：
[0018] 图1.本实验室制备的黄芩苷的HPLC图谱
[0019] 图2.本发明实例3制备方法制备的黄芩素的HPLC图谱具体实施方式：
[0020] 本发明通过以下实施例进一步详细描述，应理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和理解本发明，并不用于限制本发明。
[0021] 实施例1
[0022] A.黄芩粗酶粉的制备：取黄芩新鲜药材200g切碎，置于研钵中，加入少量石英砂和400mlpH值为4.0的乙酸-乙酸盐缓冲液，研磨、过滤，滤液置透析袋内，用去离子水透析，直到外液无色为止，取透析袋内酶液、真空冷冻干燥，得到黄芩粗酶粉0.18g。
[0023] B.低共熔溶剂制备：取140g氯化胆碱和60g尿素，置于250ml的圆底烧瓶内，在80℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。
[0024] C.酶水解黄芩苷制备黄芩素：取黄芩苷(黄芩苷含量80％)2g，用100g低共熔溶剂溶解，再依次加入400mL pH值为pH值为4.0的乙酸-乙酸盐缓冲液、黄芩粗酶粉100mg，混合均匀。将上述溶液加热至45℃，保温、搅拌反应2.5小时，反应完成后，冷却至室温，过滤，回收沉淀物(滤液可再次用于水解黄芩苷)。将上述得到的沉淀物用95％乙醇溶解，过滤，弃去不溶物。滤液中加入5倍量去离子水(体积比)，搅拌均匀，静置，黄芩素析出，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤3次，过滤、干燥，得黄芩素1.081g.经HPLC检测纯度为80.2％，黄芩苷转化率为90.3％。
[0025] 实施例2
[0026] A.黄芩粗酶粉的制备：取黄芩新鲜药材200g切碎，置于研钵中，加入少量石英砂和400mlpH值为4.5的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液，研磨、过滤，滤液置透析袋内，用去离子水透析，直到外液无色为止，取透析袋内酶液、真空冷冻干燥，得到黄芩粗酶粉0.20g。
[0027] B.低共熔溶剂制备：取140g氯化胆碱和60g尿素，置于250ml的圆底烧瓶内，在60℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。
[0028] C.酶水解黄芩苷制备黄芩素：取黄芩苷(黄芩苷含量80％)2g，用100g低共熔溶剂溶解，再依次加入400mL pH值为4.5的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、黄芩粗酶粉100mg，混合均匀。将上述溶液加热至45℃，保温、搅拌反应2.6小时，反应完成后，冷却至室温，过滤，回收沉淀物(滤液可再次用于水解黄芩苷)。将上述得到的沉淀物用95％乙醇溶解，过滤，弃去不溶物。滤液中加入5倍量去离子水(体积比)，搅拌均匀，静置，黄芩素析出，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤3次，过滤、干燥，得黄芩素1.07g。经HPLC检测纯度为83.0％，黄芩苷转化率为92.5％。
[0029] 实施例3
[0030] A.黄芩粗酶粉的制备：取黄芩新鲜药材200g切碎，置于研钵中，加入少量石英砂和400mlpH值为6.0的磷酸-磷酸盐缓冲液，研磨、过滤，滤液置透析袋内，用去离子水透析，直到外液无色为止，取透析袋内酶液、真空冷冻干燥，得到黄芩粗酶粉0.22g。
[0031] B.低共熔溶剂制备：取140g氯化胆碱和60g尿素，置于250ml的圆底烧瓶内，在90℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。
[0032] C.酶水解黄芩苷制备黄芩素：取黄芩苷(黄芩苷含量80％)2g，用100g低共熔溶剂溶解，再依次加入400mL pH值为6.0的磷酸-磷酸盐缓冲液、黄芩粗酶粉100mg，混合均匀。将上述溶液加热至45℃，保温、搅拌反应2.5小时，反应完成后，冷却至室温，过滤，回收沉淀物(滤液可再次用于水解黄芩苷)。将上述得到的沉淀物用95％乙醇溶解，过滤，弃去不溶物。滤液中加入5倍量去离子水(体积比)，搅拌均匀，静置，黄芩素析出，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤3次，过滤、干燥，得黄芩素1.076g。经HPLC检测纯度为85.0％，黄芩苷转化率为95.3％。
[0033] 实施例4
[0034] A.黄芩粗酶粉的制备：取黄芩新鲜药材200g切碎，置于研钵中，加入少量石英砂和400mlpH值为4.5的磷酸-磷酸盐缓冲液，研磨、过滤，滤液置透析袋内，用去离子水透析，直到外液无色为止，取透析袋内酶液、真空冷冻干燥，得到黄芩粗酶粉0.18g。
[0035] B.低共熔溶剂制备：取140g氯化胆碱和30g尿素，置于250ml的圆底烧瓶内，在80℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。
[0036] C.酶水解黄芩苷制备黄芩素：取黄芩苷(黄芩苷含量80％)2g，用100g低共熔溶剂溶解，再依次加入400mL pH值为4.5的磷酸-磷酸盐缓冲液、黄芩粗酶粉50mg，混合均匀。将上述溶液加热至50℃，保温、搅拌反应4.0小时，反应完成后，冷却至室温，过滤，回收沉淀物(滤液可再次用于水解黄芩苷)。将上述得到的沉淀物用95％乙醇溶解，过滤，弃去不溶物。滤液中加入5倍量去离子水(体积比)，搅拌均匀，静置，黄芩素析出，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤3次，过滤、干燥，得黄芩素1.07g。经HPLC检测纯度为82.8％，黄芩苷转化率为92.3％。
[0037] 实施例5
[0038] A.黄芩粗酶粉的制备：取黄芩新鲜药材200g切碎，置于研钵中，加入少量石英砂和400mlpH值为5.0的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液，研磨、过滤，滤液置透析袋内，用去离子水透析，直到外液无色为止，取透析袋内酶液、真空冷冻干燥，得到黄芩粗酶粉0.18g。
[0039] B.低共熔溶剂制备：取140g氯化胆碱和120g尿素，置于250ml的圆底烧瓶内，在90℃条件下加热、搅拌至形成均一透明液体。
[0040] C.酶水解黄芩苷制备黄芩素：取黄芩苷(黄芩苷含量80％)2g，用100g低共熔溶剂溶解，再依次加入400mL pH值为5.0的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、黄芩粗酶粉200mg，混合均匀。将上述溶液加热至40℃，保温、搅拌反应2.0小时，反应完成后，冷却至室温，过滤，回收沉淀物(滤液可再次用于水解黄芩苷)。将上述得到的沉淀物用95％乙醇溶解，过滤，弃去不溶物。滤液中加入5倍量去离子水(体积比)，搅拌均匀，静置，黄芩素析出，过滤获取沉淀，沉淀再用去离子水洗涤3次，过滤、干燥，得黄芩素1.177g，经HPLC检测纯度为78.2％，黄芩苷转化率为95.6％。