一种检测IgM抗体的免疫检测方法

摘要

本发明公开了一种检测IgM抗体的免疫检测方法，涉及IgM抗体免疫检测技术；包括以下步骤：一、抗IgM的固化处理；二、待测IgM与抗IgM结合；三、抗原、标记单抗与固相载体上的待测IgM结合；四、信号检测。本发明极大的降低IgG对检测结果的干扰，降低检测的背景和假阳性率，提高检测特异性；同时又增强检测信号，降低假阴性率，提高检测灵敏度。

权利要求

1.一种检测IgM 抗体的免疫检测方法，其特征在于：包含以下步骤：

步骤一、抗IgM 的固化处理，将抗IgM 置于固相载体上，在2℃～ 8℃的条件下，孵育12小时及以上，然后洗涤3 ～ 5 次；

步骤二、待测IgM 与抗IgM 结合，将作为样本的待测IgM 加入已经固化了抗IgM 的固相载体中，孵育0.5 ～ 1.0 小时，洗涤3 ～ 5 次；

步骤三、抗原、标记单抗与固相载体上的待测IgM 结合，先将抗原与标记单抗混合均匀后，再加入步骤二中洗涤好的固相载体中，在恒温箱中，37℃恒温条件孵育0.5 ～ 1 小时，孵育结束，洗涤3 ～ 5 次；或者依次将抗原、标记单抗加入步骤二中洗涤好的固相载体中，即先将抗原加入，紧接着加入标记单抗，在恒温箱中，37℃条件恒温孵育0.5 ～ 1 小时，孵育结束，洗涤3 ～ 5 次，留待检测；

步骤四、信号检测，待步骤三完成后，根据标记单抗上的指示物的不同，在相应的仪器设备上进行其反应信号检测；

所述抗原、标记单抗与待测IgM 的孵育过程中，一个抗原分子可同时结合2 个及以上不同结合位点的标记单抗，以增加反应信号。

2.如权利要求1 所述的一种检测IgM 抗体的免疫检测方法，其特征在于：所述固相载体为微孔板、玻璃板或NC 膜。

3.如权利要求1 所述的一种检测IgM 抗体的免疫检测方法，其特征在于：所述洗涤过程采用含有表面活性剂的洗涤液。

4.如权利要求1 所述的一种检测IgM 抗体的免疫检测方法，其特征在于：所述抗IgM 为羊抗IgM 或者鼠抗IgM。

5.如权利要求1 所述的一种检测IgM 抗体的免疫检测方法，其特征在于：所述标记单抗中的指示物为酶、胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶、放射性物质、化学发光物质及荧光物质。

说明书

一种检测IgM抗体的免疫检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及IgM抗体免疫检测技术领域。

背景技术

[0002] 现有免疫检测方法中，主要是应用免疫学检测技术检测样本中待测物质；在临床检验中，主要通过抗原抗体反应检测体液中抗体或抗原等物质。根据检测原理的不同，免疫检测可以分为间接法、夹心法、竞争法和捕获法。

[0003] 在正常血清中，IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75％，而IgM则大约占血清中免疫球蛋白总量的6％，针对某种抗原的特异性IgM经常与特异性IgG同时存在，且特异性IgG经常会干扰IgM抗体的测定。现有的四种检测方法中，特异性IgG对IgM抗体测定的干扰主要表现在如下：

[0004] 间接法测IgM抗体时，通过包被抗原，用酶或者其他指示物标记二抗的模式进行检测，这类方法容易出现特异性不强，易受待测样本中IgG的干扰；

[0005] 夹心法测IgM抗体时，同样出现特异性不强，容易受IgG的干扰，检测灵敏度较捕获法不高，同时标记的抗原与包被的抗原会相互竞争与待测的IgM结合，导致检测信号不强或者没有；

[0006] 竞争法测IgM抗体时，由于IgM抗体分子量较大，不是非常适合使用此方法，且与间接法一样，其特异性不强，易受待测样本中IgG的干扰，同时标记所用的IgM抗体不易获得。

[0007] 目前测定IgM抗体时，主要用捕获法，捕获法则是通过包被抗IgM，用酶或其他指示物标记抗原的模式进行检测，即，先将血清中所有免疫球蛋白IgM(包括特异性IgM和非特异性IgM)都固定于固相中，去除IgG干扰后，再检测待测特异性IgM，但是这种在检测过程中，容易出现检测灵敏度不高，容易导致假阴性现象。

发明内容

[0008] 针对现检测IgM抗体的免疫检测方法中存在的特异性不强，容易受到待测样本中IgG干扰和检测灵敏度不高，容易出现假阴性的问题，本发明的目的是为了解决前述问题而提出一种检测IgM抗体的免疫检测方法。

[0009] 为达到上述技术目的，本发明采用了如下技术方案：

[0010] 本发明为一种检测IgM抗体的免疫检测方法：包含以下步骤：

[0011] 步骤一、抗IgM的固化处理，将抗IgM置于固相载体上，在2℃～8℃的条件下，孵育12小时及以上，然后洗涤3～5次；

[0012] 步骤二、待测IgM与抗IgM结合，将作为样本的待测IgM加入已经固化了抗IgM的固相载体中，孵育0.5～1.0小时，洗涤3～5次；

[0013] 步骤三、抗原、标记单抗与固相载体上的待测IgM结合，可以先将抗原与标记单抗混合均匀后，再加入步骤二中洗涤好的固相载体中，在恒温箱中，37℃恒温条件孵育0.5～1小时，孵育结束，洗涤3～5次；或者依次将抗原、标记单抗加入步骤二中洗涤好的固相载体中，即先将抗原加入，紧接着加入标记单抗，在恒温箱中，37℃条件恒温孵育0.5～1小时，孵育结束，洗涤3～5次，留待检测；

[0014] 步骤四、信号检测，待步骤三完成后，根据标记单抗上的指示物的不同，在相应的仪器设备上进行其反应信号检测。

[0015] 较优地，所述抗原、标记单抗与待测IgM的孵育过程中，一个抗原份额子可同时结合2个及以上不同结合位点的标记单抗，以增加反应信号。

[0016] 较优地，所述固相载体为微孔板、玻璃板或NC膜。

[0017] 较优地，所述洗涤过程采用含有表面活性剂的洗涤液。

[0018] 较优地，所述抗IgM为羊抗IgM或者鼠抗IgM。

[0019] 较优地，所述标记单抗中的指示物为酶、胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶、放射性物质、化学发光物质及荧光物质。

[0020] 本发明的有益效果：本发明首先排除了样本中IgG与待测IgM竞争性与抗原的结合，极大的降低了IgG对检测结果的干扰，从而降低检测的背景和假阳性率，提高检测特异性，同时采用2个及以上不同结合位点的标记单抗，增强检测信号，降低假阴性率，提高检测灵敏度。

附图说明

[0021] 图1为本发明一种检测IgM抗体的免疫检测方法的反应原理示意图。

[0022] 其中，1-固相载体；2-抗IgM；3-样本中待测IgM；4-抗原；5-标记单抗。

具体实施方式

[0023] 为了更好地说明本发明，现结合实施例与附图作进一步说明。

[0024] 本发明为一种检测IgM抗体的免疫检测方法，如图1所示的反应原理，涉及的步骤为：

[0025] 步骤一、抗IgM2的固化处理。将抗IgM2置于检测系统的微孔板或者玻璃板或者NC膜上，这些微孔板或者玻璃板或者NC膜为实验的固相载体1，在2℃～8℃的条件下，孵育12小时及以上，然后用含表面活性剂的洗涤液洗涤3～5次，洗涤的目的主要是去除尚未结合上固相载体1的抗IgM2。

[0026] 步骤二、待测IgM3与抗IgM2结合。将含待测IgM3样本加入已经固化了抗IgM2的固相载体1中，孵育0.5～1.0小时，待待测IgM3和固相载体1上的抗IgM2结合后，用含表面活性剂的洗涤液洗涤3～5次，以除去样本中的特异性IgG，避免特异性IgG对检测的干扰。

[0027] 步骤三、抗原、标记单抗与固相载体上的待测IgM3结合。可以将抗原与至少2个标记单抗混合均匀后，加入已经附着了抗IgM2和待测IgM3的固相载体中，在恒温箱内，恒温温度37℃，孵育0.5～1小时，孵育结束，采用含表面活性剂的洗涤液洗涤3～5次；或者可以先将抗原加入放置在37℃的恒温箱中的已经附着了抗IgM2结和样本zhogn待测IgM3的固相载体中，紧接着加入至少2个标记单抗，同样孵育0.5～1小时，孵育结束，采用含表面活性剂的洗涤液洗涤3～5次，得到孵育物，待检测；

[0028] 步骤四、信号检测。待步骤三完成后，根据标记单抗上指示物的不同，在相应的仪器设备上进行其反应信号检测。

[0029] 具体地，本发明涉及的标记单抗是2个及以上具有不同结合位点的单抗。

[0030] 具体地，本发明所使用的抗IgM可以是羊抗IgM或者鼠抗IgM。

[0031] 具体地，本发明可以应用于酶联免疫法、快速检测法、放射免疫检测法、荧光免疫检测法。

[0032] 具体地，本发明的指示物可以是酶、胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶、放射性物质、化学发光物质及荧光物质。

[0033] 具体实施例：

[0034] 本实施例中采用风疹病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)。

[0035] 1.1 微孔板的制备

[0036] 包被：将抗IgM(具体为羊抗人IgM，购于sigma公司)用包被液(CBS(1L，pH＝9.6)：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g)按照1：1000配制，然后使用移液器加入微孔板(固相载体1的一种)中，每孔100uL，然后在2℃～8℃下，孵育时间大于等于12个小时，然后用洗涤液洗涤3次；

[0037] 封闭：将洗涤好的微孔板在纱布上拍干残留液体，然后在37℃下，每孔加入200μL的封闭液(PBS+0.5％BSA)，封闭2小时；结束后直接倒掉封闭液，拍干残留液后即可；如果不能立即使用，则在室温、湿度为50％以下的条件下晾干微孔板，然后密封保存；

[0038] 1.2 抗原的制备：采用样本稀释液(PBS)将风疹病毒抗原稀释成浓度为0.5～1mg/mL；

[0039] 1.3 HRP-单抗1和HRP-单抗2的制备：单抗1和单抗2(自制)采用辣根过氧化物酶(简称HRP，购于sigma公司)按照改良的戊二醛法进行标记，使用前先用样本稀释液按照1：20000进行稀释，再使用；

[0040] 1.4 底物液和终止液的制备：

[0041] 底物A液：TMB200mg，无水乙醇(或DMSO)100mL，加双蒸水至1000mL；

[0042] 底物B液：Na2HPO414.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加三蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

[0043] 终止液：量取13.6mL98％的浓硫酸，然后缓慢加入双蒸水中，并不停的搅拌，最终定容至500mL；

[0044] 1.5 试剂盒的检测方法：

[0045] 将带检测样本使用样品稀释液(PBS)按照1：100稀释，然后加入制备好的微孔板中，每孔加100uL，同时做2个临界对照，在37℃下，孵育1小时，然后用洗涤液(PBST)洗涤3次；

[0046] 将抗原、HRP-单抗1和HRP-单抗2按照1：1：1混合制成复合物后每孔加入100uL，在37℃下，孵育0.5～1小时，然后用洗涤液(PBST)洗涤3次；

[0047] 每孔加入底物A液和B液各一滴混匀，在室温下避光静置15～30分钟；

[0048] 每孔加终止液1滴，在30分钟内用酶标仪在450nm波长处读取其OD值；

[0049] 具体的结果判定标准如下：

[0050] 阴性：OD值＜0.9×临界对照孔的平均值；

[0051] 阳性：OD值＜1.1×临界对照孔的平均值；

[0052] 灰色区：OD值处在临界对照孔平均值的1±10％范围内。

[0053] 1.6 检测结果

[0054] 1.6.1 分析灵敏度和特异性

[0055] 用制备好的风疹病毒IgM抗体检测试剂盒测定经临床确认的100例阴性样本和30例阳性样本，读取的OD数值如表1所示。

[0056] 表1 试剂盒的检测结果

[0057]

[0058] 分析灵敏度：30/(30+0)×100％＝100％

[0059] 分析特异性：100/(100+0)×100％＝100％

[0060] 1.6.2 实验检测

[0061] 将采用风疹病毒单独制备的抗原+HRP-单抗1、抗原+HRP-单抗2、抗原+HRP-单抗1+HRP-单抗2、直接标记抗原的试剂盒(购买其他公司)，对28份血清盘(WHO)进行检测，检测结果如表2所示。

[0062] 表2 血清盘(WHO)的检测结果

[0063]

[0064] 从上述结果可以看出，本发明采用2个标记单抗后，检测信号明显加强，尤其在检测弱阳性样本时，表现尤为突出，而在检测阴性样本时，则与其他方法基本一致；同时从表中可以看出，市场上采用直接标记抗原模式的捕获法，在检测过程中还出现假阳性现象。

[0065] 综合上所述，本发明的技术方案可以充分有效的完成上述发明目的，且本发明的结构原理及功能原理都已经在实施例中得到充分的验证，而能达到预期的功效及目的，且本发明的实施例也可以根据这些原理在不同的固相载体上进行变换，也同样适用于其他类型的抗原，因此，本发明包括一切在申请专利范围中所提到范围内的所有替换内容。任何在本发明申请专利范围内所作的等效变化，皆属本案申请的专利范围之内。