一种烟草专用的海洋生物肥料及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种烟草专用的海洋生物肥料及其制备方法和应用，本发明利用对烟草的外观及内在质量提高有明显促进作用的浒苔多糖，以及筛选到的一种具有抗病毒及真菌病的花域芽孢杆菌SJ菌株（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7571）所产的胞外多糖，制备出所述烟草专用的海洋生物肥料。本发明可降低烟叶重金属含量，烟叶总糖及还原糖含量增加，可使增强烟草的抗病促生的能力。将所述海洋生物肥料用于烟草使用不仅可以达到绿色环保、高效新型的目的，而且可显著提高烟叶质量，更可为农户增收、地方财税增收做出重要贡献，具有良好的市场应用前景。

权利要求

1.一种烟草专用的海洋生物肥料的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）花域芽孢杆菌SJ菌株的胞外多糖的提取：将菌株接种于pH6.8 ～ 7.4的种子培养基，在温度30～35℃、培养18～24 小时，获种子培养液；

种子培养液以质量比3％～10％的接种量接种于多糖发酵培养基中，在发酵温度24 ～ 

32℃、通风比1∶0.3～0.8 发酵18～24h，离心去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液；

按照质量比为发酵上清液：95%乙醇：CaCl2=1：1.5：2.5混匀，均匀搅拌后产生沉淀，真空干燥，得微生物胞外多糖即为菌株SJ的胞外多糖；

（2）浒苔多糖的提取：将浒苔干粉溶于水中浸泡，在温度为60℃、200W超声波频率下破壁，向破壁后溶液中加入20PFU/g纤维素酶和30PFU/g蛋白酶复合酶提取得到浒苔多糖水溶液；离心分离取上清液进行电场絮凝沉淀，进一步固液分离，将清液真空浓缩，低温冷冻干燥，制得呈粉剂的浒苔多糖；

（3）胞外多糖和浒苔多糖的复配：将所述浒苔多糖和菌株SJ的胞外多糖混合溶于水中，控制浒苔多糖的质量比浓度为0.05‰～2‰，控制胞外多糖的质量比浓度为0.05‰～2‰，加热使其溶解，过筛灭菌密封即得所述海洋生物肥料；

所述花域芽孢杆菌SJ菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7571；

所述种子培养基配方为：蛋白胨5-10g/L，牛肉膏1-3g/L，氯化钠1-5g/L，氯化铁0.05-

0.3g/L，余量为蒸馏水，pH6.8～7.4；

所述多糖发酵培养基配方为：蔗糖1.0～25g/L，淀粉5.0～10g/L，豆粕10.0～30g/L，蛋白胨1.0～10g/L，碳酸钙1.0～8.0g/L，磷酸氢二钾1.0～1.0g/L，硫酸镁0.5～1.0g/L，硫酸锰0.001～0.2g/L，余量为蒸馏水，pH 7.0～8.5。

2.根据权利要求1所述的制备方法制得的海洋生物肥料。

3.根据权利要求2所述的海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用。

4.根据权利要求3所述的海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用，其特征在于：所述烟草专用肥料为叶面肥、滴灌肥。

5.根据权利要求1所述的烟草专用的海洋生物肥料的制备方法，其特征在于：所述浒苔多糖对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附达到平衡的时间分别为1.0h、2.0h、2.0h，吸附量Pb2+＞ Cu2+＞Cd2+。

6.根据权利要求4所述的海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用，其特征在于：所述烟草专用肥料的使用量为3kg/亩 5kg/亩。

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7.根据权利要求4所述的海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用，其特征在于：所述烟草专用肥料中还添加有尿素、磷酸氢二钾、硫酸钾、硝酸钾、生腐酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锌、钼酸铵、硫酸锰中的一种或多种。

说明书

一种烟草专用的海洋生物肥料及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种烟草专用的海洋生物肥料及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 海藻多糖是海藻中的主要活性物质，可增强作物抗性，通过调节细胞渗透作用，增强细胞的渗透压，从而增强抗寒、抗旱、抗盐碱能力；可参与机体光合作用，间接提高机体免疫力，防治病毒性及真菌性病害，对重金属及其它有毒物质有阻吸作用，有效改善作物品质。海藻多糖作为一种添加剂，可以增强产品的稳定性及提高增溶作用，增强系统的乳化作用、吸水性和对无机离子、重金属的螯合作用。多糖是所有生命有机体的重要组分,并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面具有重要作用。

[0003] 微生物胞外多糖是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。它与普通多糖相比，理化性质独特，结构和功能具优良特异性。目前对微生物胞外多糖生物活性的研究主要集中在医药、食品、化工领域，如抗肿瘤药物、增强免疫力的功能性食品、絮凝剂等化工产品；但对于胞外多糖在农业方面的应用研究还较少。

[0004] 烟草是重要的经济作物，也是高效益作物，烟叶质量的好坏直接影响着亿万人口的家庭收入和生活水平。对于烟草来说，以前人们主要考虑的是焦油对健康的危害，很少关注镉等重金属对主动或被动吸烟者健康的危害。如今越来越多的研究证实，吸烟已成为烟民体内某些重金属特别是镉的主要来源之一。由于镉沸点低，卷烟中大部分Cd进入烟雾(约70％)，每天吸40支烟所提供的镉相当于食物的2倍，对主动和被动吸烟者均构成潜在的、巨大的健康风险。20世纪50年代以来，随着吸烟与健康关系研究的不断深入，烟草中的重金属含量及其对人体健康的潜在风险日益受到关注。对烟草降焦减害技术的研究和开发不仅关系到烟民的健康，而且关系到烟草行业的生存和发展。所以开发一种绿色环保、高效新型的海洋生物肥料，不仅可提高烟叶质量，更可为农户增收、地方财税增收做出重要贡献。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种烟草专用的海洋生物肥料及其制备方法和应用，所述海洋生物肥料的主要活性成分为海藻多糖和微生物胞外多糖，即浒苔多糖和花域芽孢杆菌SJ的胞外多糖。使用本发明所述的海洋生物肥料用于烟草使用，利用多糖在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面的重要作用来促进烟草的生长。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0007] 一种烟草专用的海洋生物肥料的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

[0008] (1)花域芽孢杆菌SJ菌株的胞外多糖的提取：将菌株接种于pH6.8～7.4的种子培养基，在温度30～35℃、培养18～24小时，获种子培养液；

[0009] 种子培养液以质量比3％～10％的接种量接种于多糖发酵培养基中，在发酵温度24～32℃、通风比1∶0.3～0.8发酵18～24h，离心去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液；

[0010] 按照质量比为发酵上清液：95％乙醇：CaCl2＝1：1.5：2.5混匀，均匀搅拌后产生沉淀，真空干燥，得微生物胞外多糖即为菌株SJ的胞外多糖；

[0011] (2)浒苔多糖的提取：将浒苔干粉溶于水中浸泡，在温度为60℃、200W超声波频率下破壁，向破壁后溶液中加入20PFU/g纤维素酶和30PFU/g蛋白酶复合酶提取得到浒苔多糖水溶液；离心分离取上清液进行电场絮凝沉淀，进一步固液分离，将清液真空浓缩，低温冷冻干燥，制得呈粉剂的浒苔多糖；

[0012] (3)胞外多糖和浒苔多糖的复配：将所述浒苔多糖和菌株SJ的胞外多糖混合溶于水中，控制浒苔多糖的质量比浓度为0.05‰～2‰，控制胞外多糖的质量比浓度为0.05‰～2‰，加热使其溶解，过筛灭菌密封即得所述海洋生物肥料。

[0013] 进一步的，所述花域芽孢杆菌SJ菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7571。

[0014] 进一步的，所述种子培养基配方为：蛋白胨5-10g/L，牛肉膏1-3g/L，氯化钠1-5g/L，氯化铁0.05-0.3g/L，余量为蒸馏水，pH6.8～7.4。

[0015] 进一步的，所述多糖发酵培养基配方为：蔗糖1.0～25g/L，淀粉5.0～10g/L，豆粕10.0～30g/L，蛋白胨1.0～10g/L，碳酸钙1.0～8.0g/L，磷酸氢二钾1.0～1.0g/L，硫酸镁
0.5～1.0g/L，硫酸锰0.001～0.2g/L，余量为蒸馏水，pH 7.0～8.5。

[0016] 本发明一种以上所述的制备方法制得的海洋生物肥料。

[0017] 本发明以上所述海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用。

[0018] 进一步的，以上所述烟草专用肥料为叶面肥、滴灌肥。

[0019] 以上所述一种烟草专用的海洋生物肥料的制备方法中，所述浒苔多糖对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附达到平衡的时间分别为1.0h、2.0h、2.0h，吸附量Pb2+＞Cu2+＞Cd2+。

[0020] 以上所述的海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用中，所述烟草专用肥料的使用量为3kg/亩～5kg/亩。

[0021] 以上所述的海洋生物肥料在制备烟草专用肥料中的应用中，所述烟草专用肥料中还添加有尿素、磷酸氢二钾、硫酸钾、硝酸钾、生腐酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锌、钼酸铵、硫酸锰中的一种或多种。

[0022] 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明利用一种对烟草的外观及内在质量提高有明显促进作用的浒苔多糖，以及筛选到的一种具有抗病毒及真菌病的花域芽孢杆菌SJ菌株(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7571)所产的胞外多糖，制备出所述烟草专用的海洋生物肥料。本发明可降低烟叶重金属含量，烟叶总糖及还原糖含量增加，可使增强烟草的抗病促生的能力。将所述海洋生物肥料用于烟草使用不仅可以达到绿色环保、高效新型的目的，而且可显著提高烟叶质量，更可为农户增收、地方财税增收做出重要贡献，具有良好的市场应用前景。

具体实施方式

[0023] 本发明通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的描述。

[0024] 实施例1

[0025] 1、花域芽孢杆菌SJ的胞外多糖的提取工艺

[0026] 取花域芽孢杆菌SJ菌株(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7571)，菌落形态呈圆形，边缘整齐，直径4-6mm，白色粘液质。实验室条件下对烟草镰刀菌、烟草赤星病、烟草黑胫病等真菌性病害，烟草病毒病(TMV)均有明显的抑制作用。

[0027] 制备种子培养液：将菌株斜面接种于种子培养基，种子培养基为：蛋白胨5-10g，牛肉膏1-3g，氯化钠1-5g，氯化铁0.05-0.3g，蒸馏水1000ml，pH6.8～7.4。在温度30～35℃、170rp转速、培养18～24小时，获种子培养液。

[0028] 发酵生产：将种子培养液以占发酵培养基质量比为3％～10％的接种量接种于多糖发酵培养基中。培养基组分按重量比，分别为：蔗糖1.0～25g/L，淀粉5.0～10g/L，豆粕10.0～30g/L，蛋白胨1.0～10g/L，碳酸钙1.0-8.0g/L，磷酸氢二钾1.0～1.0g/L，硫酸镁0.5～1.0g/L，氯化铁0.05-0.3g/L，硫酸锰0.001～0.2g/L，pH7.0～8.5，水1L。在发酵温度24～
32℃、搅拌速度210rpm、通风比1︰0.3～0.8、发酵24h。4℃，12000rpm离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液。

[0029] 按照质量比为发酵上清液：95％乙醇：CaCl2＝1：1.5：2.5将上述组分混合，搅拌30分钟后4℃冰箱放置过夜，6000～12000rpm离心10～25分钟取沉淀，真空干燥，得微生物胞外多糖即为菌株SJ的胞外多糖。

[0030] 2、浒苔多糖的提取工艺

[0031] 将浒苔干粉投入反应釜中，加入5倍体积的水浸泡1-2小时，升温至60℃，在200W超声波频率条件下破壁2小时，向破壁后溶液中加入20PFU/g纤维素酶和30PFU/g蛋白酶复合酶提取4h,所得为海藻多糖水溶液。

[0032] 多糖溶液经大型离心机分离，取上清液进行电场絮凝1h沉淀，进一步固液分离，将清液真空浓缩至固形物含量约30％，低温冷冻干燥，所得产品即为呈粉剂的浒苔多糖。

[0033] 3、胞外多糖和浒苔多糖的复配：将所述浒苔多糖和菌株SJ的胞外多糖混合溶于水中，控制浒苔多糖的质量比浓度为0.05‰～2‰，控制胞外多糖的质量比浓度为0.05‰～2‰，加热使其溶解，过筛灭菌密封即得所述海洋生物肥料。

[0034] 实施例2、胞外多糖对TMV抑制作用

[0035] 胞外多糖对TMV抑制作用：取所述菌株SJ的胞外多糖，分别稀释100倍、500倍、1000倍、2000倍分别与等体积40倍TMV病毒汁液混合15min，接种三生NN烟，以无菌水与等体积TMV混合为对照，检测其枯斑抑制率。

[0036] 表1 菌株LJ-2提取的多糖粗品对TMV的抑制作用

[0037]

[0038] 实施例3、浒苔多糖保水性、吸附重金属离子实验

[0039] 1)浒苔多糖保水性测定

[0040] 采用计算土壤水分蒸发速率的方式测定浒苔多糖保水性。以长宽高均为10厘米，体积为1立方分米的正方体为容器，土壤为普通黄土，经105℃,4小时烘干至恒重，填入容器压实，记下土壤质量(Ms)；以自来水为对照，使土壤充分吸水，记下所用自来水质量(Mw)；分别以十万分之一(A)、万分之一(B)浓度的浒苔多糖多糖溶液为实验对象，将与对照相同质量的土壤和胞外多糖溶液填入空置容器，分别将其在30℃恒温放置3～15天，测定水分蒸发情况。通过测量放置若干天后，单位容器内土壤的质量(M)，经过下面公式计算出水分蒸发率。

[0041] 水分蒸发率的计算方法：

[0042] 表2 为土壤水分蒸发率结果：

[0043]  3天 7天 10天 15天
自来水对照％ 73.52 85.43 90.65 92.78
多糖溶液％ 72.43 82.02 86.25 89.36

[0044] 结果表明，浒苔多糖多糖对土壤有一定的保水性，且随着胞外多糖浓度的升高，土壤持水量增大，土壤水分蒸发速率降低。

[0045] 2)浒苔多糖吸附重金属离子效果实验

[0046] 分别配制20mg/L Pb2+、Cd2+、Cu2+溶液；准确称量0.02±0.0005g浒苔多糖样品于10个50mL干燥离心管中；各加入30mL Pb2+、Cd2+、Cu2+溶液，如下进行2组实验：

[0047] ①5个离心管于(28±1)℃恒温水浴中振荡，时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h，离心，萃取，用原子吸收分光光度计测定Pb2+、Cd2+、Cu2+浓度。结果如表3：

[0048] 表3 浒苔多糖吸附重金属离子效果实验结果

[0049]  1.0h 2.0h 3.0h 4.0h 5.0h
Pb2+吸附量(mg/L) 3.7081 3.7084 3.7036 3.7010 3.7042
Cd2+吸附量(mg/L) 3.1064 3.1024 3.1065 3.1082 3.1056
Cu2+吸附量(mg/L) 3.0125 3.0128 3.0132 3.0158 3.0154

[0050] 由表3可知，浒苔多糖对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附达到平衡的时间分别为1.0h、2.0h、2+ 2+ 2+
2.0h，吸附量Pb ＞Cu ＞Cd 。

[0051] ②5个离心管分别调pH值依次为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；于(28±1)℃恒温水浴中振荡2.0h，离心，萃取，用原子吸收分光光度计测定Pb2+、Cd2+、Cu2+浓度。结果如表4：

[0052] 表4

[0053]  pH4.0 pH5.0 pH6.0 pH7.0 pH8.0
2+
Pb 吸附量(mg/L) 1.8772 1.8647 1.8457 1.8552 1.8682
Cd2+吸附量(mg/L) 1.1955 1.8320 2.3021 2.1024 3.2301
Cu2+吸附量(mg/L) 1.8203 2.0365 2.9254 3.0145 3.4527

[0054] 实施例4、浒苔多糖与菌株SJ的胞外多糖复配制备新型复混肥料

[0055] 1、在叶面肥中的应用实例

[0056] 取浒苔多糖，SJ的胞外多糖，其它原料如尿素、磷酸氢二钾、硫酸钾、硫酸亚铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锌、钼酸铵、硫酸锰等按照一定比例制成氮磷钾含量分别为5％、3％、6％，微量元素总量大于2％的叶面肥。

[0057] 步骤是将浒苔多糖与胞外多糖溶于1kg自来水中，使浒苔多糖的质量比为1.0‰，使胞外多糖的质量比为1.0‰，打开搅拌加热至60℃，使其全部溶解；然后加入其它所需原料，搅拌20min至全部溶解，过40目筛网后，灭菌灌装于100mL的塑料瓶中，密封，即为多糖叶面肥成品。使用量3kg/亩，成熟期5kg/亩，叶面喷施，既可提供营养，又可刺激生长调控发育。

[0058] 2、在滴灌肥中的应用实例

[0059] 取浒苔多糖与胞外多糖，其它原料如尿素、磷酸氢二钾、硝酸钾、生腐酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锌、钼酸铵、硫酸锰等按照一定比成氮磷钾含量分别为2％、1.5％、5％，微量元素总量大于2％，有机质含量30％的滴灌肥。

[0060] 步骤是将浒苔多糖与胞外多糖溶于1kg自来水中，使浒苔多糖的质量比为1.5‰，使胞外多糖的质量比为1.5‰，打开搅拌加热60℃，使其全部溶解；然后加入生化黄腐酸，搅拌20min至全部溶解，加入其它所需原料，继续搅拌至全部溶解，过40目筛网后，灭菌灌装于500mL的塑料瓶中，密封，即为多糖滴灌肥成品。使用量3kg/亩，成熟期5kg/亩，既可提供营养，又可刺激生长调控发育。

[0061] 本发明所述海洋生物肥料包含浒苔多糖和抗烟草病害的菌株产胞外多糖，并复配了适合烟草生长的氮磷钾及中微量营养元素，制备海藻生物叶面肥及滴灌肥，既可提供营养，又可刺激生长调控发育。

[0062] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。