6,7‑二甲氧基‑喹唑啉‑4‑胺衍生物、其制备方法及医药用途

摘要

一类含苯并咪唑结构的6，7‑二甲氧基‑喹唑啉‑4‑胺衍生物，其特征是它有如下通式：式中R1代表：氢、甲基、甲氧基、羟基、氯、氟、三氟甲基；R2代表：氢、甲基、氟、氯、溴、三氟甲基；R3代表：氢、甲基、乙基、氟、氯、溴、三氟甲基；R4代表：氢、氟、氯；R5代表：氢、氯；研究结果表明，本发明的含苯并咪唑结构的6，7‑二甲氧基‑喹唑啉‑4‑胺衍生物对小鼠黑色素瘤细胞(F10)及人子宫颈癌细胞(Hela)有显著的抑制作用，因此本发明的含苯并咪唑结构的6，7‑二甲氧基‑喹唑啉‑4‑胺衍生物可以应用于制备抗肿瘤的药物。本发明公开了其制法。

权利要求

1.一类含苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物，其结构式为：

2.一种制备权利要求1所述的含苯并咪唑结构的喹啉-4-胺衍生物的方法，它由下列步骤组成：步骤1：将10mmol取代苯甲酸，11mmol4-硝基邻苯二胺，40g多聚磷酸(PPA)投入反应瓶中，加热搅拌，150℃反应5小时，反应液稍微冷却后，将其缓慢倒入500mL冰水中，用20％NaOH水溶液调节pH至6，大量固体析出，抽滤，并用水和石油醚分别洗涤，真空干燥；

步骤2：将步骤1制得的化合物5mmol加入30mL甲醇中，室温搅拌，待其完全溶解后，加入

0.13g10％Pd/C，常温常压下反应5h，抽滤，将滤液中的甲醇旋干，得固体或油状产物；

步骤3：将6，7-二甲氧基-4-氯喹唑啉1mmol与步骤2制得的化合物1.2mmol加入20mL异丙醇中，回流搅拌，反应5小时，旋干溶剂，柱层析分离，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，得到目标化合物其中：R1为H，R2为F，R3为H，R4为H，R5为H；

或R1为H，R2为H，R3为F，R4为H，R5为H；

或R1为H，R2为H，R3为Cl，R4为H，R5为H。

3.权利要求1所述的含苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

6,7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物、其制备方法及医药用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一类含苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物，它们的制备方法，及其医药用途。

背景技术

[0002] 癌症是严重危害人类生命健康的重大疾病，据WHO报道，全世界每年有820万人死于癌症。近年来，随着肿瘤生物学的迅速发展，针对肿瘤发生、发展机制的分子靶点治疗药物成为研究热点，并且已有一大批此类抗肿瘤新药上市，这类药物大部分都含有喹唑啉结构，如吉非替尼、埃罗替尼等。基于此，近年来药物化学家对喹唑啉类化合物进行了广泛研究、设计并合成了大量化合物，其中有些化合物已进入临床研究阶段(参见：P.A.N.Gray，J.Settleman，Nature Rev.Drug Discov.2009，8，709-723.)。

[0003] 苯并咪唑环是含有两个氮原子的芳香杂环，该结构可以与金属离子配位，与酶或受体形成氢键、发生疏水作用、电性作用、π-π相互作用等。因此含有苯并咪唑环的药物分子具有广泛的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫、抗高血压、抗炎、抗溃疡等(参见：Y.Bansal，O.Silakari，Bioorg.Med.Chem.2012，20，6208-6236.)。目前，已有许多含有苯并咪唑结构的药物广泛用于治疗多种疾病：如治疗过敏性炎症的药物阿司咪唑；治疗胃溃疡的药物奥美拉唑；抗肿瘤药物苯达莫司汀；抗高血压药坎地沙坦；抗寄生虫药阿苯达唑等。
含有苯并咪唑结构片段药物的研究现已成为医药研发十分活跃的领域之一。基于结构拼合原理，本专利发现含有苯并咪唑结构片段的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物具有良好的抗肿瘤活性。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一类含苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物，及其制备方法和医药用途。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一类含苯并咪唑结构的喹啉-4-胺衍生物，它有如下通式：

[0007]

[0008] 式中R1代表：氢、甲基、甲氧基、羟基、氯、氟、三氟甲基；

[0009] R2代表：氢、甲基、氟、氯、溴、三氟甲基；

[0010] R3代表：氢、甲基、乙基、氟、氯、溴、三氟甲基；

[0011] R4代表：氢、氟、氯；

[0012] R5代表：氢、氯；

[0013] 一种制备上述含苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物的方法，它由以下步骤组成：

[0014] 步骤1：将10mmol取代苯甲酸，11mmol 4-硝基邻苯二胺，40g多聚磷酸(PPA)投入反应瓶中，加热搅拌，150℃反应5小时。反应液稍微冷却后，将其缓慢倒入500ml冰水中，用20％NaOH水溶液调节pH至6，大量固体析出。抽滤，并用水和石油醚分别洗涤，真空干燥。

[0015]

[0016] 步骤2：将步骤1制得的化合物5mmol加入30mL甲醇中，室温搅拌，待其完全溶解后，加入0.13g 10％Pd/C，常温常压下反应5h。抽滤，将滤液中的甲醇旋干，得固体或油状产物。

[0017]

[0018] 步骤3：将6，7-二甲氧基-4-氯喹唑啉1mmol与步骤2制得的化合物1.2mmol加入20mL异丙醇中，回流搅拌，反应5小时。旋干溶剂，柱层析分离，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，得到目标化合物。

[0019]

[0020] MTT法体外抗肿瘤活性实验结果表明，本发明的含有苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺类化合物对小鼠黑色素瘤细胞(F10)和人子宫颈癌细胞(Hela)具有较强的抑制作用。因此本发明的含有苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺衍生物可应用于制备抗肿瘤药物。

具体实施方式

[0021] 通过以下实施例进一步详细说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

[0022] 实施例一：6，7-二甲氧基-N-(2-苯基-1H-苯并咪唑-6-基)喹唑啉-4-胺(化合物1)的制备

[0023]

[0024] 将10mmol苯甲酸，11mmol 4-硝基邻苯二胺，40g多聚磷酸(PPA)投入反应瓶中，加热搅拌，150℃反应5小时，反应液稍微冷却后，将其缓慢倒入300ml冰水中，用20％NaOH水溶液调节pH至6，大量黄色固体析出，抽滤，并用水和石油醚分别洗涤，真空干燥。取所得的化合物5mmol，加入30mL甲醇中，室温搅拌，待其完全溶解后，加入0.13g 10％Pd/C，常温常压下反应5h，抽滤，将滤液中的甲醇旋干，得橘红色固体。取所得化合物1.2mmol与6，7-二甲氧基-4-氯喹唑啉1mmol加入20mL异丙醇中，回流搅拌，反应5小时，旋干溶剂，柱层析分离，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，得到目标化合物。黄色粉末，产率：56％，mp：305-306℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.98(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.33(1H，s，ArH)；7.52-7.61(4H，m，ArH)；7.70(1H，d，J＝8.7Hz；ArH)；8.02(1H，d，J＝1.8Hz，ArH)；8.22-8.24(2H，m，ArH)；8.30(1H，s，ArH)；8.75(1H，s，ArH)；11.28(1H，s，-NH).ESI-MS：398.2(C23H20N5O2+，[M+H]+).

[0025] 实施例二：6，7-二甲氧基-N-(2-邻甲苯基-1H-苯并咪唑-6-基)喹唑啉-4-胺(化合物2)的制备

[0026]

[0027] 制备方法同实施例一。以邻甲基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉末，产率：45％，mp：275-277℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：2.62(3H，s，-CH3)；3.98(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.34-7.48(4H，m，ArH)；7.57(1H，dd，J1＝1.8Hz，J2＝8.7Hz，ArH)；7.71-7.80(2H，m，ArH)；8.05(1H，d，J＝1.5Hz；ArH)；8.33(1H，s，ArH)；8.75(1H，s，ArH)；11.31(1H，s，-NH).ESI-MS：412.2(C24H22N5O2+，[M+H]+).

[0028] 实施例三：6，7-二甲氧基-N-(2-间甲苯基-1H-苯并咪唑-6-基)喹唑啉-4-胺(化合物3)的制备

[0029]

[0030] 制备方法同实施例一。以间甲基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。草绿色粉末，产率：40％，mp：287-288℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：2.42(3H，s，-CH3)；3.97(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.35(2H，d，J＝7.2Hz，ArH)；7.43-7.48(1H，m，ArH)；7.55(1H，dd，J1＝1.6Hz，J2＝8.6Hz，ArH)；7.68(1H，d，J＝8.4Hz，ArH)；8.01-8.07(3H，m，ArH)；8.31(1H，s，ArH)；8.73(1H，s，ArH)；11.26(1H，s，-NH).ESI-MS：412.2(C24H22N5O2+，[M+H]+).[0031] 实施例四：6，7-二甲氧基-N-(2-对甲苯基-1H-苯并咪唑-6-基)喹唑啉-4-胺(化合物4)的制备

[0032]

[0033] 制备方法同实施例一。以对甲基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉末，产率：92％，mp：353-354℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：2.39(3H，s，-CH3)；3.98(3H，s，-OCH3)；4.01(3H，s，-OCH3)；7.3(1H，s，ArH)；7.39(2H，d，J＝8.1Hz，ArH)；7.52(1H，d，J＝8.4Hz，ArH)；7.67(1H，d，J＝8.4Hz，ArH)；8.02(1H，s，ArH)；8.1(2H，d，J＝8.1Hz，ArH)；8.22(1H，s，ArH)；8.71(1H，s，ArH)；11.02(1H，s，-NH).ESI-MS：412.2(C24H22N5O2+，[M+H]+).[0034] 实施例五：6，7-二甲氧基-N-(2-对乙基苯基-1H-苯并咪唑-6-基)喹唑啉-4-胺(化合物5)的制备

[0035]

[0036] 制备方法同实施例一。以对乙基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉末，1
产率：44％，mp：285-287℃.H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：1.23(3H，t，J＝7.5Hz，-CH3)；2.69(2H，q，J＝7.5Hz，-CH2)；3.98(3H，s，-OCH3)；4.01(3H，s，-OCH3)；7.31(1H，s，ArH)；7.43(2H，d，J＝8.1Hz，ArH)；7.52-7.55(1H，m，ArH)；7.69(1H，d，J＝8.7Hz，ArH)；8.02(1H，s，ArH)；
8.14(2H，d，J＝8.1Hz，ArH)；8.24(1H，s，ArH)；8.74(1H，s，ArH)；11.13(1H，s，-NH).ESI-MS：
+ +
426.2(C25H24N5O2，[M+H]).

[0037] 实施例六：6，7-二甲氧基-N-[2-(2-甲氧基苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物6)的制备

[0038]

[0039] 制备方法同实施例一。以邻甲氧基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉1
末，产率：11％，mp：273-274℃.H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.98(3H，s，-OCH3)；4.01(3H，s，-OCH3)；4.05(3H，s，-OCH3)；7.17(1H，t，J＝7.2Hz，ArH)；7.30(2H，d，J＝7.5Hz，ArH)；7.53-
7.59(2H，m，ArH)；7.75(1H，d，J＝8.7Hz，ArH)；8.11(1H，s，ArH)；8.20(1H，s，ArH)； 8.30(1H，dd，J1＝1.8Hz，J2＝7.8Hz，ArH)；8.72(1H，s，ArH)；11.99(1H，s，-NH).ESI-MS：428.2+ +
(C24H22N5O3，[M+H]).

[0040] 实施例七：6，7-二甲氧基-N-[2-(2-羟基苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物7)的制备

[0041]

[0042] 制备方法同实施例一。以邻羟基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。棕色粉末，产率：28％，mp：3268-269℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.97(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.00-7.08(2H，m，ArH)；7.33-7.42(2H，m，ArH)；7.60(1H，d，J＝8.4Hz，ArH)；7.73(1H，d，J＝8.4Hz，ArH)；8.12(2H，t，J＝7.5Hz，ArH)；8.31(1H，s，ArH)；8.75(1H，s，ArH)；11.28(1H，s，-NH).ESI-MS：414.2(C23H20N5O3+，[M+H]+).

[0043] 实施例八：6，7-二甲氧基-N-[2-(2-氟苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物8)的制备

[0044]

[0045] 制备方法同实施例一。以邻氟苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉末，产率：56％，mp：298-299℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.98(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.36-7.62(5H，m，ArH)；7.72(1H，d，J＝8.7Hz，ArH)；8.01(1H，d，J＝1.5Hz，ArH)；8.25(1H，td，J1＝1.5Hz，J2＝7.8Hz，ArH)；8.35(1H，s，ArH)；8.77(1H，s，ArH)；11.45(1H，s，-NH).ESI-MS：416.2(C23H19FN5O2+，[M+H]+).

[0046] 实施例九：6，7-二甲氧基-N-[2-(3-氟苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物9)的制备

[0047]

[0048] 制备方法同实施例一。以间氟苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。棕色粉末，产率：49％，mp：277-278℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.99(3H，s，-OCH3)；4.03(3H，s，-OCH3)；7.32-7.38(2H，m，ArH)；7.53-7.72(3H，m，ArH)；8.01-8.09(3H，m，ArH)；8.32(1H，s，ArH)；
8.75(1H，s，ArH)；11.34(1H，s，-NH).ESI-MS：416.1(C23H19FN5O2+，[M+H]+).[0049] 实施例十：6，7-二甲氧基-N-[2-(4-氟苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物10)的制备

[0050]

[0051] 制备方法同实施例一。以对氟苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色固体，产率：80％，mp：308-309℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.99(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.32(1H，s，ArH)；7.40-7.46(2H，t，J＝8.7Hz，ArH)；7.51(1H，dd，J1＝1.8Hz，J2＝8.7Hz，ArH)；7.69(1H，d，J＝8.7Hz，ArH)；7.98(1H，d，J＝1.8Hz，ArH)；8.24-8.29(3H，m，ArH)；8.76(1H，s，ArH)；11.26(1H，s，-NH).ESI-MS：416.2(C23H19FN5O2+，[M+H]+).

[0052] 实施例十一：6，7-二甲氧基-N-[2-(3-氯苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物11)的制备

[0053]

[0054] 制备方法同实施例一。以间氯苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。棕色粉末，产率：41％，mp：295-296℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.98(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.34(1H，s，ArH)；7.51-7.63(3H，m，ArH)；7.69(1H，d，J＝8.7Hz，ArH)；8.00(1H， d，J＝
1.8Hz，ArH)；8.17-8.20(1H，m，ArH)；8.28(2H，d，J＝8.4Hz，ArH)；8.74(1H，s，ArH)；11.26(1H，s，-NH).ESI-MS：432.1(C23H19ClN5O2+，[M+H]+).

[0055] 实施例十二：6，7-二甲氧基-N-[2-(4-氯苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物12)的制备

[0056]

[0057] 制备方法同实施例一。以对氯苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。暗黄色固体，产率：22％，mp：310-312℃.1H-NMR(500MHz；d6-DMSO)：3.99(3H，s，-OCH3)；4.01(3H，s，-OCH3)；7.30(1H，s，ArH)；7.49(1H，dd，J1＝1.8Hz，J2＝4.8Hz，ArH)；7.64-7.71(3H，m，ArH)；7.97(1H，d，J＝1.5Hz，ArH)；8.22(3H，d，J＝8.7Hz，ArH)；8.77(1H，s，ArH)；11.23(1H，s，-NH).ESI-MS：432.2(C23H19ClN5O2+，[M+H]+).

[0058] 实施例十三：6，7-二甲氧基-N-[2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物13)的制备

[0059]

[0060] 制备方法同实施例一。以对溴苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉末，产率：60％，mp：311-312℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.94(3H，s，-OCH3)；3.98(3H，s，-OCH3)；7.22(1H，s，ArH)；7.53(1H，dd，J1＝2.1Hz，J2＝8.7Hz，ArH)；7.62(1H，d，J＝9.0Hz，ArH)；
7.74(1H，s，ArH)；7.77(1H，s，ArH)；8.04(1H，s，ArH)；8.13(3H，dd，J1＝2.1Hz，J2＝6.9Hz，ArH)；8.51(1H，s，ArH)；10.05(1H，s，-NH).ESI-MS：476.1(C23H19BrN5O2+，[M+H]+).[0061] 实施例十四：6，7-二甲氧基-N-[2-(2-三氟甲基苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物14)的制备

[0062]

[0063] 制备方法同实施例一。以邻三氟甲基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。棕色粉末，产率：31％，mp：281-282℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.99(3H，s，-OCH3)；4.02(3H，s，-OCH3)；7.33(1H，s，ArH)；7.50(1H，d，J＝9.0Hz，ArH)；7.70-7.86(4H，m，ArH)；7.96(2H，d，J＝7.2Hz，ArH)；8.30(1H，s，ArH)；8.78(1H，s，ArH)；11.38(1H，s，-NH).ESI-MS：466.1(C24H19F3N5O2+，[M+H]+).

[0064] 实施例十五：6，7-二甲氧基-N-[2-(3-三氟甲基苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物15)的制备

[0065]

[0066] 制备方法同实施例一。以间三氟甲基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。棕色粉末，产率：31％，mp：275-276℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.98(3H，s，-OCH3)；4.03(3H，s，-OCH3)；7.37(1H，s，ArH)；7.59(1H，d，J＝7.8Hz，ArH)；7.73-7.91(3H，m，ArH)；8.03(1H，s，ArH)；8.38(1H，s，ArH)；8.53-8.58(2H，m，ArH)；8.79(1H，s，ArH)；11.56(1H，s，ArH).ESI-+ +MS：466.1(C24H19F3N5O2，[M+H]).

[0067] 实施例十六：6，7-二甲氧基-N-[2-(4-三氟甲基苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物16)的制备

[0068]

[0069] 制备方法同实施例一。以对三氟甲基苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。红棕色1
粉末，产率：22％，mp：310-311℃.H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：4.01(3H，s，-OCH3)； 4.03(3H，s，-OCH3)；7.31(1H，s，ArH)；7.53(1H，d，J＝8.5Hz，ArH)；7.75(1H，d，J＝8.3Hz，ArH)；7.95-
8.02(3H，m，ArH)；8.25(1H，s，ArH)；8.43(2H，d，J＝8.0Hz，ArH)；8.78(1H，s，ArH)；11.22(1H，s，-NH).ESI-MS：466.3(C24H19F3N5O2+，[M+H]+).

[0070] 实施例十七：6，7-二甲氧基-N-[2-(2，6-二氯苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物17)的制备

[0071]

[0072] 制备方法同实施例一。以2，6-二氯苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。白色粉末，产率：85％，mp：300-301℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.99(3H，s，-OCH3)；4.03(3H，s，-OCH3)；7，33(1H，s，ArH)；7.50(1H，dd，J1＝1.8Hz，J2＝8.7Hz，ArH)；7.59-7.74(4H，m，ArH)；7.98(1H，s，ArH)；8.32(1H，s，ArH)；8.78(1H，s，ArH)；11.44(1H，s，-NH).ESI-MS：466.1(C23H18Cl2N5O2+，[M+H]+).

[0073] 实施例十八：6，7-二甲氧基-N-[2-(3，4-二氯苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物18)的制备

[0074]

[0075] 制备方法同实施例一。以3，4-二氯苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。暗黄色粉末，产率：70％，mp：296-297℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：3.99(3H，s，-OCH3)；4.04(3H，s，-OCH3)；7.39(1H，s，ArH)；7.57(1H，d，J＝8.5Hz，ArH)；7.71(1H，d，J＝8.6Hz，ArH)；7.86(1H，d，J＝8.4Hz，ArH)；8.01(1H，s，ArH)；8.22(1H，d，J＝8.3Hz，ArH)；8.39(1H，s，ArH)；8.48(1H，s，ArH)；8.80(1H，s，ArH)；11.54(1H，s，-NH).ESI-MS：466.2(C23H18Cl2N5O2+，[M+H]+).[0076] 实施例十九：6，7-二甲氧基-N-[2-(3，5-二氯苯基)-1H-苯并咪唑-6-基]喹唑啉-4-胺(化合物19)的制备

[0077]

[0078] 制备方法同实施例一。以3，5-二氯苯甲酸代替苯甲酸，得到目标化合物。黄色粉末，产率：64％，mp：283-285℃.1H-NMR(300MHz；d6-DMSO)：4.01(3H，s，-OCH3)；4.04(3H，s，-OCH3)；7.34(1H，s，ArH)；7.54(1H，d，J＝8.6Hz，ArH)；7.72-7.78(2H，m，ArH)；7.95-8.02(2H，m，ArH)；8.25(1H，s，ArH)；8.31(1H，s，ArH)；8.81(1H，s，ArH)；11.41(1H，s，-NH).ESI-MS：466.3(C23H18Cl2N5O2+，[M+H]+).

[0079] 实施咧二十：新型含苯并咪唑结构的6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-胺类衍生物的体外抗肿瘤活性测试

[0080] 采用MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法测定含苯并咪唑结构的喹啉-4-胺类衍生物对小鼠黑色素瘤细胞(F10)和人子宫颈癌细胞(Hela)的抑制率，计算半数抑制浓度IC50值(μM)。

[0081] (1)培养液(每升)的配制：所选肿瘤细胞为贴壁细胞，RPMI-1640培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，HEPES 2.38g，青霉素溶液(20万U/mL)0.5mL，链霉素溶液(20万U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO3溶液调PH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。

[0082] (2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·12H2O0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g。高压灭菌。

[0083] (3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

[0084] (4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。DMSO在培养液中的浓度不宜过大，加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.05-0.1％。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

[0085] (5)细胞培养：所选细胞株为贴壁肿瘤细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内(含10％小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3-
4天传代一次。传代时先弃去原培养液，再用D-Hanks缓冲液洗涤；然后用0.5％胰蛋白酶消化30秒左右，加入少量新鲜培养液终止消化；吹打；移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(加入该瓶容量约1/10的新鲜培养液培养)。

[0086] (6)细胞孵育：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×105个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

[0087] (7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，
5％CO2培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

[0088] (8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μL DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

[0089] (9)抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：

[0090] 生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100％[0091] (OD实验表示测试药物组的平均光密度，OD对照表示对照组的平均光密度，OD空白表示对照组的平均光密度)

[0092] 半数抑制浓度(IC50)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

[0093] 测得的体外抗肿瘤活性数据如下表所示：

[0094]