VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法

摘要

本发明公开了VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法，具体是用于制备检测帕金森患者对于采用左旋多巴治疗时的药物敏感性的试剂盒。该试剂盒中含有检测VEGFR2基因Val297Ile位点的探针和引物，所述探针和引物能与VEGFR2基因Val297Ile位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含VEGFR2基因Val297Ile位点的基因序列。本发明是基于Taqman分型方法检测基因多态性的试剂盒，该试剂盒能准确、快速、简便地检测与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关的基因位点(VEGFR2基因Val297Ile多态性)。

权利要求

1.检测VEGFR2基因Val297Ile位点多态性的制剂在制备判断帕金森患者对于采用左旋多巴治疗时的药物敏感性的制剂上的应用，其特征在于，制剂包括试剂盒，所述的试剂盒中含有如下探针：VIC-CCTTAACTATAGATGGTGTAACC-MGB；

FAM-CTTAACTATAGATGGTATAACC-MGB；

所述的试剂盒中含有如下引物：

5’-CAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAAT-3’；

5’-GGTCATCAGCCCACTGGAT-3’；

VIC和FAM为报告基团，VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；FAM吸收波长485-

505nm，发射波长515-530nm；MGB为淬灭基团。

说明书

VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种左旋多巴治疗帕金森病药物敏感性相关的VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法。

背景技术

[0002] 血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)超家族，主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，是血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor,VEGF-A)促进血管内皮细胞分裂增殖，提高血管通透性的主要调节因子，并且在VEGF-A的信号传导中起主导作用。

[0003] 研究报道左旋多巴(levodopa,L-dopa)治疗帕金森病诱发运动障碍并发症，可能与血脑屏障功能退化，使得原本难以通过血脑屏障的药物渗入黑质和纹状体，引起L-dopa脑内有效浓度的变化所致。多项研究证实L-dopa导致运动障碍与VEGF-A上调，诱导血脑屏障内皮生成，改变血脑屏障渗透性相关。

[0004] 研究表明VEGFR2基因多态性与多种疾病相关，并采用了不同的基因分型方法来进行检查。例如，有研究采用质谱分型方法证实VEGFR2(rs2071559)多态性与胶质瘤风险增加有关；有研究采用Taqman探针法研究了VEGFR2-604T/C多态性与鼻咽癌易感性及侵袭性的关系。质谱分型是针对大样本多位点的高通量分型方法，而Taqman探针法是中通量分型的金标准，并且具有灵敏度高、花费相对较少的优点。

[0005] Taqman探针法是在PCR上下游引物间选取一段序列作为探针，并在探针上下标记荧光基团和淬灭基团，该探针可与模板结合，在延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处时，Taq酶的5’外切酶活性可以降解探针的5’端，使荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光。相对于传统的限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)，Taqman探针法具有灵敏度更高、操作更简单的优势，且通路更高。

发明内容

[0006] 本发明旨在提供VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法，具体地说是一种检测与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关基因的多态性的试剂盒，该试剂盒可用于制备检测与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关基因的多态性的试剂。

[0007] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

[0008] VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法，所述的VEGFR2基因Val297Ile位点用于制备检测帕金森患者对于采用左旋多巴治疗时的药物敏感性的制剂。

[0009] 上述制剂包括试剂盒，特别是包括采用Taqman探针法的试剂盒。

[0010] 所述的试剂盒中含有检测VEGFR2基因Val297Ile位点的探针和引物，所述探针和引物能与VEGFR2基因Val297Ile位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含VEGFR2基因Val297Ile位点的基因序列。

[0011] 所述的探针和引物优选是与VEGFR2基因Val297Ile位点前后500bp的基因序列特异性结合并能扩增出包含VEGFR2基因Val297Ile位点的基因序列。

[0012] 所述的试剂盒中含有如下探针：

[0013] VIC-CCTTAACTATAGATGGTGTAACC-MGB；

[0014] FAM-CTTAACTATAGATGGTATAACC-MGB；

[0015] 所述的试剂盒中含有如下引物：

[0016] 5’-CAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAAT-3’；

[0017] 5’-GGTCATCAGCCCACTGGAT-3’。

[0018] VIC和FAM为报告基团，VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；MGB为淬灭基团。

[0019] 上述试剂盒检测时根据FAM与VIC荧光强度相当，说明VEGFR2基因Val297Ile位点为AG基因型；VIC荧光强度远大于FAM荧光强度，说明VEGFR2基因Val297Ile位点为GG基因型；FAM荧光强度远大于VIC荧光强度，说明VEGFR2基因Val297Ile位点为AA基因型。

[0020] 本课题组的前期研究表明，VEGFR2基因多态Val297Ile(rs2305948)可能通过影响VEGFR2表达水平，从而与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关，而之前并无相关报道。

[0021] VEGFR2蛋白的胞外域包含7个免疫球蛋白样袢。胞外第1袢是与VEGF结合的必须部位，第2-3袢是与VEGF紧密结合的主要部位，VEGFR2基因Val297Ile位点编码VEGFR2胞外域第3袢。在中国汉族人群中，其最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)为29.71％。由于目前还没有有关Val297Ile基因多态性及其功能的相关报道，本课题组近期研究才发现其与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关，所以还没有人检测过VEGFR2基因Val297Ile多态性，更没有相关检测的试剂盒产品面世。因此，探索检测与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关基因的多态性的方法及产品显得意义深远。

[0022] 本发明的试剂盒能准确、快速、简便地检测与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关的基因位点(VEGFR2基因Val297Ile多态性)。

附图说明

[0023] 图1为Taqman探针法检测VEGFR2基因Val297Ile位点基因型；

[0024] 图2为质谱法检测VEGFR2基因Val297Ile位点基因型。

具体实施方式

[0025] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0026] 实施例1

[0027] 1.设计Taqman探针及引物

[0028] 1.1查找VEGFR2基因Val297Ile位点前后500bp序列

[0029] 在PUBMED SNP数据库中搜索VEGFR2，进入Gene view，选择NC_000004.12转录本并显示整个基因区域的单核苷酸多态性(SNP)，进入rs2305948，在Fasta sequence中可获得此多态位点前、后500bp的序列(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)，用于寻找合适的探针和引物。

[0030]CAGGCTATGAATATTAGTTTTCTCTAGGTGATTACATCTTTCCACATTATGTCATTTCTCTGTTCTCCAAAGTTTTTGATCTACATTCCTTTTAAGGGAATTTCTCTTTAAGAGGTGGCATGAGATACACTGCTCCTTAAACAGTGGTCACATTTACTTGTGTTTCTGCAGTTTATATCCATCTCACTTTCACCACGTGAGGTTTTAAAAATCCTAATTCAGTTGGTTCCATTTATTTCTCCTGAAACAAAATATATTTGTTGTCTGCATGAGGTTAAAAGTTCTGGTGTCCCTGTTTTTAGCATTAAATAATGTTTACCAAAGCCCAGATTTAATTCTGTGTGTTACTAGAAGTTATTGGGTAATGTTATATGCTGTGCTTTGGAAGTTCAGTCAACTCTTTTTTTCAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGT(SEQ ID NO.5)

[0031] Y(Y是指VEGFR2基因Val297Ile位点)

[0032]TAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGGTAAGCTATGGTCTTGGAAATTATTCTGTGCCTTGACAAGTGAGATAATTTAAATAAATTTAGGTCACTTAGTGATTCCTATTTTGTTCATTCAGAAGATAGTTTCTAGTTTTTCTTGTTAGGGAGGCCACATGACCTAGAGGTCAAGAGCATAGCTTTGTAGTCAGGAACTTGGGTTCAAACCTCAACTTTAAAGATGAGATGTGCTGATATACAGTAAGAGTTCATTTAGTATTACTTATTATAGTTATTGCTGCTATTAGGATTGTTACTATGATAAATAGTATTAGCTAAGGTAGTTTTTAAATTTTCATTTTATTGCAAGGCTGAGAGGCCTACTTGAATAAGCATGAGCTTTGCAAACTGGGGAAACATTTAGCAATATACAGTTGACCTGTGAGCAACTCAGGGAT(SEQ ID NO.6)

[0033] 1.2利用Primer Express3.0进行探针和引物设计

[0034] (1)探针设计原则：

[0035] 1.确保G-C含量在20％-80％之间。

[0036] 2.探针5’端的第一个碱基不能是G。

[0037] 3.用Primer Express软件计算出来的探针Tm值应当在68-70℃之间。

[0038] 4.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。

[0039] 5.避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上。

[0040] 6.尽量使用含C多于含G的探针。如果C少于G，则使用互补链上的探针。

[0041] 7.如果是SNP，多态性位点尽量位于探针中央。

[0042] (2)引物设计原则：

[0043] 1.在探针确定以后再选择引物。

[0044] 2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。

[0045] 3.保持G-C含量在20％-80％之间。

[0046] 4.避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。

[0047] 5.用Primer Express软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间。

[0048] 6.在3’端的5个碱基中，G和C碱基加起来不要超过2个。

[0049] (3)Primer Express 3.0操作方法

[0050] 进入Primer Express 3.0软件，File/New/选择Taqman MGB Allelic。粘贴SNP位点前后500bp序列，标定SNP位置并选择变异类型。然后选择引物/探针查找，软件即开始查找合适的引物和探针。若没有匹配的引物和探针，则可手动设计。确定VEGFR2基因Val297Ile位点Taqman探针及引物如下：

[0051] 探针(Applied Biosystems公司)：

[0052] Probe 1(G)：VIC-CCTTAACTATAGATGGTGTAACC-MGB(SEQ ID NO.1)；

[0053] Probe 2(A)：FAM-CTTAACTATAGATGGTATAACC-MGB(SEQ ID NO.2)；

[0054] VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；

[0055] FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；

[0056] MGB为淬灭基团。

[0057] 引物(Applied Biosystems公司)：

[0058] Primer-F：5’-CAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAAT-3’(SEQ ID NO.3)；

[0059] Primer-R：5’-GGTCATCAGCCCACTGGAT-3’(SEQ ID NO.4)。

[0060] 2.SNP检测

[0061] 2.1PCR扩增体系及程序

[0062] 2X Master Mix 12.5μl

[0063] 20X Assay Working Stock 1.25μl

[0064] (包含Probe 1、2和Primer-F、Primer-R)

[0065] Nuclease-free water 10.25μl

[0066] gDNA 1μl(1–20ng)

[0067] Total volume 25μl

[0068] 程序(Applied Biosystems 7500)

[0069] AmpliTaq UP,Enzyme Activation：95℃，10minutes，HOLD

[0070] [Denaturation：95℃，15seconds；

[0071] Annealing/Extension：60℃，1minute]40cycles

[0072] 扩增产物(108bp)：

[0073] CAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGT

[0074] Y(Y是指VEGFR2基因Val297Ile位点)

[0075] TAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACC(SEQ ID NO.7)。

[0076] 2.2实验方法准确性验证

[0077] 对未知VEGFR2基因Val297Ile位点基因型的51个样本用本检测方法进行检测，实验结果如图1所示，其中取代表性3个样本：45号样本FAM与VIC荧光强度相当，说明其为AG基因型；46号样本VIC荧光强度(533-580nm)明显大于FAM荧光强度(465-510nm)，说明其为GG基因型；47号样本FAM荧光强度(465-510nm)明显大于VIC荧光强度(533-580nm)，说明其为AA基因型；No Template Control为阴性对照。采用质谱分析对上述51个样本进行基因型检测(图2)，其中45号样本为AG基因型；46号样本为GG基因型；47号样本为AA基因型。我们所建立Taqman探针法检测出的对应样本的基因型与已知基因型完全一致，表明我们的Taqman SNP检测方法成功建立。

[0078] 2.3实验样本的SNP检测

[0079] 根据上述建立的Taqman探针法检测VEGFR2基因Val297Ile多态性的方法，我们对51个样本进行了分型实验。实验结果如表1所示，表1中Call代表分析的实验结果(Homozygous 1/1为GG基因型，Homozygous 2/2为AA基因型，Heterozygous 1/2为AG基因型)，所检测51例样本有36例为GG基因型，14例为AG基因型，1例为AA基因型，三种基因型在图1中呈组内分布集中，组间分布差异明显。更进一步说明我们成功建立Taqman探针法对VEGFR2基因Val297Ile多态的检测方法。

[0080] 采用本发明所述试剂盒能迅速快捷地检测VEGFR2基因Val297Ile多态性，且灵敏度高。

[0081] 我们前期研究中收集了69例帕金森病患者样本，其中，实验组(使用L-dopa治疗5年内发生运动障碍)32例，对照组(使用L-dopa治疗8年以上未发生运动障碍)37例。对VEGFR2基因Val297Ile(rs2305948)进行基因分型实验，发现rs2305948位点AA型的最大L-dopa使用剂量(mg/day)[565.00±163.55,P＝0.038]显著高于AG型[396.88±200.39]和GG型[300.00±80.18]；且AA型的MAIMS量表值[17.00±5.24,P＝0.026]显著高于AG型[8.94±6.53]和GG型[7.86±4.45]。此结果表明，携带AA型的帕金森患者所需L-dopa剂量要高于AG型和GG型基因型患者，且AA型的MAIMS量表值显著升高，提示AA型在L-dopa的治疗过程中可能与运动功能障碍存在相关性。因此，VEGFR2基因Val297Ile对帕金森患者L-dopa治疗具有一定的临床指导意义。

[0082] 表1Taqman探针法检测VEGFR2基因Val297Ile多态性结果

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