一种中药复方制剂中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法转让专利
申请号 : CN201510181799.3
文献号 : CN104730171B
文献日 : 2016-07-20
发明人 : 郭东晓 , 林永强 , 徐丽华 , 崔伟亮
申请人 : 山东省食品药品检验研究院
摘要 :
本发明公开了一种中药复方制剂中赤芍、金银花的多成分含量测定方法。本发明使用一个色谱条件同时对含有赤芍和金银花的中药复方制剂中的芍药苷和6个咖啡酰奎宁酸进行含量测定，操作简便，分析数据准确。梯度洗脱条件合理，在兼顾目标成分色谱峰峰形和分离度的条件下，大大缩短了检测时间；7个成分同时检测节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率；流动相中有机相比例低，降低了检验成本，减少了环境污染。
权利要求 :
1.一种中药复方制剂中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：
照《中国药典》2010年版一部附录VID的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.1％～1％的磷酸溶液：92％→84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温为10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比40％～60％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为
10μg、50μg、10μg、100μg、10μg、10μg、10μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂，混匀，取相当于金银花药材
0.3～0.5g的量，精密称定或量取，置50ml量瓶中，加入体积百分比40％～60％甲醇40ml，密塞，超声处理30～40min，放冷，用体积百分比40％～60％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，特征在于，所述中药复方制剂是指，由含有赤芍和金银花的组合物原料药，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的任何一种剂型，包括丸剂、散剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏剂、糖浆剂、贴膏剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、酊剂、流浸膏剂与浸膏剂、膏药、凝胶剂、软膏剂、搽剂、注射剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、栓剂、鼻用制剂、眼用制剂、气雾剂、喷雾剂。
3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，所述中药复方制剂为抗感颗粒，其原料药组成为金银花700g、赤芍700g、绵马贯众233g，制成总量1000g。
4.权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，所述中药复方制剂为抗感胶囊，其原料药组成为金银花1500g、赤芍1500g、绵马贯众500g，制成总量450g。
5.一种原料药组成为金银花700g、赤芍700g、绵马贯众233g，制成总量1000g的中药复方制剂抗感颗粒中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，其特征在于，步骤如下：照《中国药典》2010年版一部附录VID的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.4％的磷酸溶液：92％→84％→84％→
76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～
38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于
5000；
对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比50％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10μg、50μg、10μg、100μg、10μg、10μg、10μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感颗粒，研细，混匀，取
0.6g，相当于金银花药材0.42g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积百分比50％甲醇40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用体积百分比50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.一种原料药组成为金银花1500g、赤芍1500g、绵马贯众500g，制成总量450g的中药复方制剂抗感胶囊中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：照《中国药典》2010年版一部附录VID的高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.4％的磷酸溶液：92％→84％→84％→
76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～
38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于
5000；
对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比50％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10μg、50μg、10μg、100μg、10μg、10μg、10μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感胶囊内容物，研细，混匀，取0.1g，相当于金银花药材0.33g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积百分比50％甲醇
40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用体积百分比50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
说明书 :
一种中药复方制剂中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药复方制剂的含量测定方法，特别涉及一种中药复方制剂中赤芍和金银花的含量测定方法，属于医药技术领域。
背景技术
[0002] 抗感系列制剂(抗感颗粒和抗感胶囊)由金银花、赤芍、绵马贯众等3味药组成，处方中3味药材重量比为3:3:1，具有清热解毒的功效，用于外感风热引起的感冒。抗感颗粒执行《中国药典》2010年版第一增补本标准；抗感胶囊执行国家药品监督管理局国家药品标准WS3-225(X-215)-2002Z。标准收载项目均包括：绿原酸和芍药苷的薄层色谱鉴别；芍药苷的HPLC含量测定。
[0003] 金银花为方中主药，上述标准均以绿原酸的薄层色谱鉴别控制金银花的投料，未进行金银花内含成分的含量测定，这不能制止药材少投料的问题，难以保证药物的有效性。文献RP-HPLC法测定抗感颗粒中芍药苷和绿原酸的含量(中国药房2011年22卷40期3820页)提供了抗感颗粒中赤芍和金银花的含量测定方法，其中金银花的指标成分仅使用了绿原酸。但绿原酸是一种多种植物共有的成分，甚至在废弃烟叶中也能分离得到，提取率达到
1.71％。仅以绿原酸作为指标成分，控制金银花制剂的质量显然是不够的。文献HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量(药物分析杂志2012年32卷1期57页)对银黄含片中金银花药材6个指标成分：3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸进行含量测定。该文献在327nm波长处测定，而芍药苷在327nm左右则没有吸收，其含量测定一般使用其最大吸收波长230nm，因而该文献条件下不能同时实现芍药苷的含量测定。目前，现有技术中没有对制剂中芍药苷和上述6个咖啡酰奎宁酸同时进行含量测定的方法。
1.71％。仅以绿原酸作为指标成分，控制金银花制剂的质量显然是不够的。文献HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量(药物分析杂志2012年32卷1期57页)对银黄含片中金银花药材6个指标成分：3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸进行含量测定。该文献在327nm波长处测定，而芍药苷在327nm左右则没有吸收，其含量测定一般使用其最大吸收波长230nm，因而该文献条件下不能同时实现芍药苷的含量测定。目前，现有技术中没有对制剂中芍药苷和上述6个咖啡酰奎宁酸同时进行含量测定的方法。
发明内容
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种中药复方制剂中赤芍和金银花多成分含量测定方法。其中，赤芍指标成分为芍药苷，金银花指标成分为6个咖啡酰奎宁酸，包括3-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸(5-O-咖啡酰奎宁酸)、4-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。
[0005] 术语说明：
[0006] 抗感颗粒是中国药典2010年版第一增补本记载的药品名称。处方量：金银花700g、赤芍700g、绵马贯众233g，制成总量：1000g。
[0007] 抗感胶囊是国家食品药品监督管理局国家药品标准新药转正标准第38册记载的药品名称。标准编号：WS3-225(X-215)-2002Z。处方量：金银花1500g、赤芍1500g、绵马贯众500g，制成总量：450g。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明使用一个色谱条件同时对中药复方制剂中赤芍(芍药苷)和金银花(6个咖啡酰奎宁酸)进行了含量测定，操作简便，分析数据准确。既节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率，同时又提高了制剂的安全性、有效性及可控性。
[0010] 本发明的技术方案如下：
[0011] 一种中药复方制剂中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：
[0012] 照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定；
[0013] 色谱条件与系统适用性试验：
[0014] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.1％～1％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.1％～1％的磷酸溶液：92％→
84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在317～337nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在220～240nm波长下检测芍药苷；26～38min，在317～337nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温4～15℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在317～337nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在220～240nm波长下检测芍药苷；26～38min，在317～337nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温4～15℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
[0015] 对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比40％～60％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10μg、50μg、10μg、100μg、10μg、10μg、10μg的混合溶液，即得；
[0016] 供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂，混匀，取相当于金银花药材0.3～0.5g的量，精密称定或量取，置50ml量瓶中，加入体积百分比40％～60％甲醇40ml，密塞，超声处理30～40min，放冷，用体积百分比40％～60％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0017] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0018] 所述的含有赤芍和金银花的中药复方制剂是指含有赤芍和金银花的组合物原料药，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的任何一种剂型，包括丸剂、散剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏剂、糖浆剂、贴膏剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、酊剂、流浸膏剂与浸膏剂、膏药、凝胶剂、软膏剂、搽剂、注射剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、栓剂、鼻用制剂、眼用制剂、气雾剂、喷雾剂。
[0019] 所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。
[0020] 根据本发明优选的，
[0021] 流动相B磷酸溶液的体积份数比为0.4％；
[0022] 色谱条件与系统适用性试验中采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃。
[0023] 进一步优选的，一种原料药组成为金银花700g、赤芍700g、绵马贯众233g，制成总量1000g的中药复方制剂抗感颗粒中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：
[0024] 照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定；
[0025] 色谱条件与系统适用性试验：
[0026] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.4％的磷酸溶液：92％→84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
[0027] 对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比50％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10μg、50μg、10μg、100μg、10μg、10μg、10μg的混合溶液，即得；
[0028] 供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感颗粒，研细，混匀，取0.6g，相当于金银花药材0.42g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积百分比50％甲醇40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用体积百分比50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0029] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0030] 中药复方制剂抗感颗粒中赤芍含量以芍药苷计，不得少于5.5mg/g；金银花含量以5-O-咖啡酰奎宁酸计，不得少于2.1mg/g，以6个咖啡酰奎宁酸的总重量计，不得少于5.6mg/g。
[0031] 进一步优选的，一种原料药组成为金银花1500g、赤芍1500g、绵马贯众500g，制成总量450g的中药复方制剂抗感胶囊中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：
[0032] 照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定；
[0033] 色谱条件与系统适用性试验：
[0034] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.4％的磷酸溶液：92％→84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
[0035] 对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比50％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10μg、50μg、10μg、100μg、10μg、10μg、10μg的混合溶液，即得；
[0036] 供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感胶囊内容物，研细，混匀，取约0.1g，相当于金银花药材0.33g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积百分比50％甲醇40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用体积百分比50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0037] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0038] 中药复方制剂抗感胶囊中赤芍含量以芍药苷计，不得少于28.9mg/g；金银花含量以5-O-咖啡酰奎宁酸计，不得少于10.0mg/g，以6个咖啡酰奎宁酸的总重量计，不得少于26.7mg/g。
[0039] 本发明使用一个液相色谱条件，运用波长切换技术，同时对含有赤芍和金银花的中药复方制剂中的赤芍和金银花中7个成分进行了含量测定，操作简便，分析数据准确。梯度洗脱条件合理，在兼顾目标成分色谱峰峰形和分离度的条件下，大大缩短了检测时间；7个成分同时检测节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率。
[0040] 文献HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量(药物分析杂志2012年32卷1期57页)中检测6个咖啡酰奎宁酸需要60min；文献HPLC法测定赤芍中芍药苷的含量(临床医学工程2011年18卷4期487页)中只检测芍药苷1个成分，检测时间也需要
50min。本发明与以上两篇文献液相梯度区别明显(见附图1)，更特别的是，引入波长切换技术，仅需39min即可同时测定上述7个成分的含量。此外，由附图1可见，本发明与文献相比显著地降低了有机溶剂的消耗，节约了检验成本，相应地减少了环境污染。
50min。本发明与以上两篇文献液相梯度区别明显(见附图1)，更特别的是，引入波长切换技术，仅需39min即可同时测定上述7个成分的含量。此外，由附图1可见，本发明与文献相比显著地降低了有机溶剂的消耗，节约了检验成本，相应地减少了环境污染。
[0041] 本发明对现有的抗感颗粒和抗感胶囊检测标准进行了相应提高，使用一个色谱条件同时对赤芍和金银花中共7个成分进行了质量控制，提高了工作效率，同时提高了制剂的可控性，从而确保了其临床疗效和广大患者的身体健康。
附图说明
[0042] 图1为本发明与文献流动相的比较图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是流动相中乙腈比例(v/v，％)；银黄含片文献是指HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量(药物分析杂志2012年32卷1期57页)，赤芍文献是指HPLC法测定赤芍中芍药苷的含量(临床医学工程2011年18卷4期487页)。
[0043] 图2为混合对照品高效液相色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是毫吸光度值(mAu)；峰1是3-O-咖啡酰奎宁酸，峰2是5-O-咖啡酰奎宁酸，峰3是4-O-咖啡酰奎宁酸，峰4是芍药苷，峰5是4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰6是3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰7是3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。
[0044] 图3为抗感颗粒样品高效液相色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是毫吸光度值(mAu)；峰1是3-O-咖啡酰奎宁酸，峰2是5-O-咖啡酰奎宁酸，峰3是4-O-咖啡酰奎宁酸，峰4是芍药苷，峰5是4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰6是3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰7是3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。
[0045] 图4为金银花阴性高效液相色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是毫吸光度值(mAu)；峰4是芍药苷。
[0046] 图5为赤芍阴性高效液相色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是毫吸光度值(mAu)；峰1是3-O-咖啡酰奎宁酸，峰2是5-O-咖啡酰奎宁酸，峰3是4-O-咖啡酰奎宁酸，峰5是4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰6是3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰7是3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。
[0047] 图6为文献HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量(药物分析杂志2012年32卷1期57页)液相条件下的抗感颗粒样品高效液相色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是毫吸光度值(mAu)；峰1是3-O-咖啡酰奎宁酸，峰2是5-O-咖啡酰奎宁酸，峰3是4-O-咖啡酰奎宁酸，峰4是芍药苷，峰5是4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰6是3,5-O-二咖啡酰奎宁酸，峰7是3,4-O-二咖啡酰奎宁酸。
具体实施方式
[0048] 下面结合实验例和实施例对本发明作详细的阐述，但不限于这些具体记载的实验例和实施例。
[0049] 实验例1含量测定实验
[0050] 1.仪器、试药和供试样品
[0051] Agilent 1200高效液相色谱仪(包括G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B VWD检测器，ChemStation工作站)；Sartorius CP225D电子天平(德国赛多利斯集团)。
[0052] 对照品绿原酸(5-O-咖啡酰奎宁酸)、芍药苷，批号分别为110753-201314、110736-201337，含量分别为96.6％、94.9％，均购自中国食品药品检定研究院；对照品3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸，批号分别为ps100603-07、ps100512-06、ps100623-01、ps100623-02、ps100623-03，均购自成都普思生物科技有限公司，纯度≥98％；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。抗感颗粒共10批，收集自3家生产企业：企业A提供3批，规格均为10g·袋-1，批号分别为130401、130402、130403；企业B提供4批，其中规格为5g·袋-1的2批，批号分别为
140901、140902，规格为10g·袋-1的2批，批号分别为140901、140902；企业C提供3批，规格均为10g·袋-1，批号分别为110939、130805、131103。抗感胶囊共3批，均收集自生产企业D，规格均为0.45g/粒，批号分别为22004、22006、22007。
140901、140902，规格为10g·袋-1的2批，批号分别为140901、140902；企业C提供3批，规格均为10g·袋-1，批号分别为110939、130805、131103。抗感胶囊共3批，均收集自生产企业D，规格均为0.45g/粒，批号分别为22004、22006、22007。
[0053] 2.检测波长的选择
[0054] 研究可知，芍药苷在230nm波长处有最大吸收，220～240nm均可用于测定，以230nm为最优；6个咖啡酰奎宁酸类成分均在327nm波长处有最大吸收，317～337nm均可用于测定，以327nm为最优。
[0055] 3.流动相选择
[0056] 7个目标成分极性相差较大，采用等度洗脱很难进行同时测定，故选择梯度洗脱进行色谱分离。
[0057] 使用甲醇-水体系进行分离时发现，在检测波长下，改变梯度时甲醇-水体系易形成较大的梯度峰，影响测定。使用乙腈-水进行梯度洗脱时，以上问题得到解决，但目标峰峰形较差，对称性不好。使用乙腈-酸的水溶液时，问题得到解决。研究发现酸的水溶液可以是0.1％～1％(v/v)磷酸溶液，其中以0.4％磷酸溶液最为稳定为最优。故确定最优流动相A为乙腈，B为体积百分比0.4％磷酸溶液。
[0058] 4.梯度洗脱条件的选择
[0059] 混合对照品溶液的制备：分别精密称取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸的对照品适量，加50％(v/v)甲醇，制成上述7个成分的质量浓度分别为10.73、44.90、9.98、99.93、10.31、10.57、10.07(单位μg/ml)的混合对照品溶液。
[0060] 供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感颗粒，研细，混匀，取0.6g，相当于金银花药材0.42g，精密称定，置50ml量瓶中，加入50％(v/v)甲醇40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用50％(v/v)甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0061] 阴性样品溶液：按工艺方法分别制备缺少赤芍、金银花的阴性样品，并按上述供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
[0062] 通过摸索，发现按以下梯度进行洗脱时，供试品溶液(抗感颗粒，批号110939)7个成分均能达到基线分离，色谱峰对称性良好，并且阴性样品没有干扰。见表1和附图2～5。
[0063] 表1 梯度洗脱表
[0064]
[0065] 另外，以文献HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量(药物分析杂志2012年32卷1期57页)的色谱条件(见表2)进行试验，6个咖啡酰奎宁酸色谱峰处以327nm检测，芍药苷色谱峰处以230nm检测，色谱图见附图6。由于梯度改变速度快，在该条件下多种成分不能达到基线分离，5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷色谱峰附近有严重的干扰峰，不能得到准确的峰面积积分值。此外，文献总检测时间为60min，远超过表
1的检测时间。
1的检测时间。
[0066] 表2 文献梯度洗脱表
[0067]
[0068] 5.柱温的选择
[0069] 芍药苷色谱峰易拖尾，会影响色谱峰的对称性、分离效果和测量精度。拖尾因子用于评价色谱峰的对称性，《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法中规定，拖尾因子在0.95～1.05之间为佳。我们考察了柱温对芍药苷峰拖尾因子的影响，结果发现随柱温的降低，拖尾因子改善明显。柱温为40℃时拖尾因子为2.07，30℃时为1.63，20℃时为1.08。柱温在4～15℃时，拖尾因子可达到分析要求。综合考虑色谱峰对称性和色谱仪能耗，最优柱温为10℃，拖尾因子为1.02。在该条件下，其它6个成分也有良好的拖尾因子、理论板数及分离度。
[0070] 6.标准曲线和线性关系的考察
[0071] 精密吸取“4”项下的混合对照品溶液各1、3、5、7、10、12、15、18、20(单位μl)。以进样量X(μg)为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归，见表3～9。
[0072] 表3 3-O-咖啡酰奎宁酸线性关系考察结果
[0073]
[0074] 表4 5-O-咖啡酰奎宁酸线性关系考察结果
[0075]
[0076] 表5 4-O-咖啡酰奎宁酸线性关系考察结果
[0077]
[0078] 表6 芍药苷线性关系考察结果
[0079]
[0080] 表7 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸线性关系考察结果
[0081]
[0082]
[0083] 表8 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸线性关系考察结果
[0084]
[0085] 表9 3,4-O-二咖啡酰奎宁酸线性关系考察结果
[0086]
[0087] 结果表明：3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸分别在0.0107～
0.2146、0.0449～0.8980、0.0100～0.1996、0.0999～1.9986、0.0103～0.2062、0.0106～
0.2114、0.0101～0.2014(单位：μg)范围内与峰面积呈良好线性关系，回归方程分别为：
0.2146、0.0449～0.8980、0.0100～0.1996、0.0999～1.9986、0.0103～0.2062、0.0106～
0.2114、0.0101～0.2014(单位：μg)范围内与峰面积呈良好线性关系，回归方程分别为：
[0088] A＝2944.8X+1.0041r＝1.000
[0089] A＝3144.4X+2.3454r＝1.000
[0090] A＝2503.3X+0.2974r＝1.000
[0091] A＝1369.3X+1.8338r＝1.000
[0092] A＝3205.4X+0.4530r＝1.000
[0093] A＝3544.5X-0.6147r＝1.000
[0094] A＝3313.4X-0.9800r＝1.000
[0095] 7.精密度试验
[0096] 精密吸取“4”项下混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差(RSD)，结果见表10。表明仪器精密度良好。
[0097] 表10 精密度试验结果
[0098]
[0099] 8.稳定性试验
[0100] 精密吸取同一供试品溶液(抗感颗粒，批号110939)，在0、5、10、15、20、25(单位h)分别进样10μl，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见表11。表明供试品溶液中的7个待测成分在室温放置25h内基本稳定。
[0101] 表11 稳定性试验结果
[0102]
[0103]
[0104] 9.重复性试验
[0105] 取同一样品(抗感颗粒，批号110939)，重复测定6次，计算样品中含量，结果见表12。表明分析方法重复性良好。
[0106] 表12 重复性试验结果
[0107]
[0108] 10.回收率试验
[0109] 取“9”项下已测知含量的样品(抗感颗粒，批号110939)6份，每份0.3g，精密称定，置50ml量瓶中，分别精密加入7个成分的等量对照品，按“4”项下方法制备供试品溶液。按上述色谱条件分别进样10μl，计算回收率，结果见表13。表明该方法的回收率良好。
[0110] 表13 回收率实验结果
[0111]
[0112]
[0113] 11.样品测定
[0114] 取中药复方制剂抗感颗粒10批和抗感胶囊3批，测定并计算7个成分的含量，结果见表14。
[0115] 表14 抗感颗粒和抗感胶囊含量测定结果(mg/g)
[0116]
[0117] 下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
[0118] 所检测的中药复方制剂抗感颗粒收集自3家生产企业，抗感胶囊收集自1家生产企业。
[0119] 实施例1：一种原料药组成为金银花700g、赤芍700g、绵马贯众233g，制成总量1000g的中药复方制剂抗感颗粒中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：
[0120] 照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定；
[0121] 色谱条件与系统适用性试验：
[0122] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.4％的磷酸溶液：92％→84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
[0123] 对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比50％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10、50、10、100、10、10、10(单位μg)的混合溶液，即得；
[0124] 供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感颗粒，研细，混匀，取0.6g，相当于金银花药材0.42g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积百分比50％甲醇40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用体积百分比50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0125] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0126] 中药复方制剂抗感颗粒中赤芍含量以芍药苷计，不得少于5.5mg/g；金银花含量以5-O-咖啡酰奎宁酸计，不得少于2.1mg/g，以6个咖啡酰奎宁酸的总重量计，不得少于5.6mg/g。
[0127] 实施例2：一种原料药组成为金银花1500g、赤芍1500g、绵马贯众500g，制成总量450g的中药复方制剂抗感胶囊中赤芍、金银花多指标成分含量测定方法，步骤如下：
[0128] 照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定；
[0129] 色谱条件与系统适用性试验：
[0130] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积份数比0.4％的磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→14min→22min→23min→38min→39min；乙腈：8％→16％→16％→24％→24％→8％，体积份数比0.4％的磷酸溶液：92％→84％→84％→76％→76％→92％；采用波长切换方式检测：0～22min，在327nm波长下检测3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸；22～26min，在230nm波长下检测芍药苷；26～38min，在327nm波长下检测4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸；柱温10℃；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000，按芍药苷峰计算应不低于5000；
[0131] 对照品溶液的制备：取3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，精密称定，加体积百分比50％甲醇制成每1ml含上述7个成分的质量浓度分别为10、50、10、100、10、10、10(单位μg)的混合溶液，即得；
[0132] 供试品溶液的制备：取含有赤芍和金银花的中药复方制剂抗感胶囊内容物，研细，混匀，取0.1g，相当于金银花药材0.33g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积百分比50％甲醇40ml，密塞，超声处理30min，放冷，用体积百分比50％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0133] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0134] 中药复方制剂抗感胶囊中赤芍含量以芍药苷计，不得少于28.9mg/g；金银花含量以5-O-咖啡酰奎宁酸计，不得少于10.0mg/g，以6个咖啡酰奎宁酸的总重量计，不得少于26.7mg/g。