一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法

摘要

本发明提供一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法，具体步骤包括：1)发酵虫草菌丝中挥发性成分的提取；2)确定GC-MS分析发酵虫草菌丝中挥发性成分的条件并对样品进行测定；3)对挥发性化学成分进行定性分析；4)通过化学计量学手段进行GC-MS数据分析，鉴别发酵虫草菌丝的品种。本发明的优点在于选择GC-MS技术对发酵虫草菌丝中挥发性成分进行鉴定，解决了对发酵虫草菌丝品种的鉴别问题；该方法操作简便、实验结果直观可靠，为发酵虫草菌丝产品的质量控制和评价提供一种方法。

权利要求

1.一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法，包括如下步骤：

(a)供试品溶液的制备：精密称取发酵虫草菌丝5～20g，置于500ml的圆底烧瓶中，加入100～250ml的去离子水，另取50ml的无水乙醚作为萃取溶剂，置于250ml的圆底烧瓶中，两个烧瓶装在SDE同时蒸馏萃取装置上，置加热套加热使去离子水沸腾，以45℃油浴加热萃取溶剂，连续提取4～24h，冷却至室温，将U型管和250ml圆底烧瓶里的乙醚层合并，加入NaCl粉末至过量，取出乙醚层，加入过量的无水硫酸钠粉末过夜干燥，滤出干燥剂，取出乙醚层，室温下氮吹至干，得到黄色透明油状物，称重；复溶在100～5000μl的无水乙醚中，4℃下保存，作为供试品溶液；

(b)GC-MS测定条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱；程序升温条件：初始温度40℃，停留

2min，以5℃/min的速度升至70℃，停留2min，以15℃/min的速度升至160℃，停留5min，以2℃/min上的速度升至180℃，停留2min，以5℃/min的速度升至280℃，停留2min；进样方式：分流进样，分流比100:1；载气流速1ml/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度280℃；四级杆温度150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)35-480amu；

(c)GC-MS色谱图的测定：将上述步骤(a)得到的供试品溶液，注入GC-MS联用仪，测定，计算各峰的相对含量；

(d)发酵虫草菌丝挥发性成分的鉴定：以NIST谱库检索，对发酵虫草产品挥发性成分进行鉴定；

(e)化学计量学分析：通过化学计量学软件进行数据分析，直观区分不同发酵虫草产品和伪品。

2.如权利要求1所述的一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法，其特征在于，在所述的步骤(a)中，所述的发酵虫草菌丝与去离子水的质量体积比为1:10～1:50，提取时间为4～24h。

3.如权利要求1所述的一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中，GC-MS色谱分析的条件包括：色谱柱：HP-5MS毛细管柱，其尺寸为

30m×0.25cm×0.25μm；程序升温条件：初始温度40℃，停留2min，以5℃/min的速度升至70℃，停留2min，以15℃/min的速度升至160℃，停留5min，以2℃/min上的速度升至

180℃，停留2min，以5℃/min的速度升至280℃，停留2min；进样方式：分流进样，分流比

100:1；载气流速1ml/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度

280℃；四级杆温度150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)35-480amu。

4.如权利要求1所述的一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法，其特征在于，在所述的步骤(c)中，所述的相对含量采用采用面积归一化方法进行计算。

5.如权利要求1所述的一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法，其特征在于，在所述的步骤(e)中，所用的化学计量学软件为SIMCA P+12.0软件。

说明书

一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及药物检测领域，具体为一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法。【背景技术】

[0002] 冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，具有补肺益肾、秘精益气等功效，是我国的一种珍贵中药材。现代药理学研究也表明冬虫夏草对人体的免疫系统、循环系统、心血管系统、呼吸系统等都是有益的。但是野生冬虫夏草主要存在于我国青海、四川、西藏、贵州、云南等省3500-5000m海拔的高寒高原草甸，这种生长环境的限制加上人们的疯狂采挖，使天然冬虫夏草的资源短缺且价格昂贵，普通百姓消费不起。

[0003] 应运而生的是从新鲜冬虫夏草中分离得到多种菌株为菌种，采用液体发酵培养法来生产虫草菌丝。已有文献报道采用液体发酵培养法生产的冬虫夏草虫草菌丝与天然冬虫夏草的化学成分和药理作用相似，发酵虫草菌丝已经成为稀缺名贵药材冬虫夏草的替代品，有效的缓解了市场需求，在中成药和保健食品中广泛使用。中国市场上有以下五种品牌的发酵虫草菌丝产品被中国食品与药品监督局批准为药品或保健品：金水宝、百令、至灵、宁心宝、心肝宝。金水宝虫草菌丝为麦角菌科真菌蝙蝠蛾拟青霉菌株(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)CS-4菌株经液体深层发酵所得；百令采用中华束丝孢(Synnematium sinense yin.et Shen)Cs-C-Q80菌株发酵得到；至灵由麦角菌科孢霉属真菌蝙蝠蛾被孢霉(Mortierella hepiali)菌株经人工培育发酵得到；心肝宝为粉红胶霉菌(Gliocadium roseum)的液体发酵产品；宁心宝采用虫草头孢菌(Cephalosporium sinensis)菌株液体深层发酵制备。这些虫草制剂已被广泛地应用于多种疾病的治疗，在临床上有治疗心律不齐、房室传导受阻，慢性肾功能不全等功能。但由于这些发酵虫草产品是由不同的菌株人工发酵培育的，它们可能含有不同的有效成分，有不同的药理作用，因此要区别运用。另外，在市场上还流通有许多厂家自行生产的虫草发酵产品，这些产品大多菌种来源不明确，且未获得相关部门的正式批文，在市场上造成诸多鱼目混杂的现象。因此，发酵虫草菌丝品种的鉴别对这类药品或保健品的质量评价及安全、合理地使用有着重要的意义。

[0004] 本发明采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，对发酵虫草菌丝产品的品种进行鉴别。采用SDE同时蒸馏萃取的方法提取发酵虫草菌丝中的挥发性成分，通过质谱谱库匹配鉴定挥发油中的化学成分，结合化学计量学方法鉴别发酵虫草产品品种，该方法操作简便、实验结果直观可靠，为发酵虫草菌丝产品的质量控制和评价提供一种方法。

[0005] 发酵虫草菌丝的成分主要有虫草素、腺苷、虫草多糖、虫草酸、麦角甾醇、脂肪酸、氨基酸等，以往的研究工作也主要关注于核苷、多糖类非挥发性成分，对虫草菌丝中挥发性成分的研究较少，本发明所涉及的采用GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的研究尚未有报道。【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种基于GC-MS技术鉴别发酵虫草菌丝品种的方法。

[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0008] (a)供试品溶液的制备：精密称取发酵虫草菌丝5～20g，置于500ml的圆底烧瓶中，加入100～250ml的去离子水，另取50ml的无水乙醚作为萃取溶剂，置于250ml的圆底烧瓶中，两个烧瓶装在SDE同时蒸馏萃取装置上，置加热套加热使去离子水沸腾，以45℃油浴加热萃取溶剂，连续提取4～24h，冷却至室温，将U型管和250ml圆底烧瓶里的乙醚层合并，加入NaCl粉末至过量，取出乙醚层，加入过量的无水硫酸钠粉末过夜干燥，滤出干燥剂，取出乙醚层，室温下氮吹至干，得到黄色透明油状物，称重。复溶在100～5000μl的无水乙醚中，4℃下保存，作为供试品溶液；

[0009] (b)GC-MS测定条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25cm×0.25mm)；程序升温条件：初始温度40℃，停留2min，以5℃/min的速度升至70℃，停留2min，以15℃/min的速度升至160℃，停留5min，以2℃/min上的速度升至180℃，停留2min，以5℃/min的速度升至280℃，停留2min；进样方式：分流进样，分流比100∶1；载气流速1ml/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度280℃；四级杆温度150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)35-480amu；

[0010] (c)GC-MS色谱图的测定：将上述步骤(a)得到的供试品溶液，注入GC-MS联用仪，测定，计算各峰的相对含量；

[0011] (d)发酵虫草菌丝挥发性成分的鉴定：以NIST谱库检索，对发酵虫草产品挥发性成分进行鉴定；

[0012] (e)化学计量学分析：通过化学计量学软件进行数据分析，直观区分不同发酵虫草产品和伪品；

[0013] 所述的发酵虫草菌丝挥发油的提取方式采用SDE同时蒸馏萃取法；

[0014] 所述的发酵虫草菌丝与去离子水的质量体积比为1∶10～1∶50，提取时间为4～24h。

[0015] 所述的GC-MS色谱分析的条件包括：色谱柱：HP-5MS 毛细管柱(30m×0.25cm×0.25mm)；程序升温条件：初始温度40℃，停留2min，以5℃/min的速度升至70℃，停留2min，以15℃/min的速度升至160℃，停留5min，以2℃/min上的速度升至
180℃，停留2min，以5℃/min的速度升至280℃，停留2min；进样方式：分流进样，分流比
100∶1；载气流速1ml/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度280℃；四级杆温度150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)35-480amu。

[0016] 所述的相对含量采用采用面积归一化方法进行计算。

[0017] 所述的发酵虫草菌丝挥发性成分的鉴定采用NIST谱库检索的方法。

[0018] 所用的化学计量学软件为SIMCA P+12.0软件。

[0019] 与现有技术相比，本发明的积极效果是：

[0020] (1)本发明首次采用GC-MS技术对发酵虫草菌丝挥发性成分进行鉴定。确定了制备供试品溶液及GC-MS色谱仪的色谱条件的最优参数，分离效果好，灵敏度高，提高了结果的准确性，为发酵虫草菌丝的鉴别提供新的方法。

[0021] (2)本发明将发酵虫草菌丝挥发性成分的GC-MS色谱图与化学计量学手段相结合，可以直观的区别不同的发酵虫草菌丝，方法简便，可用于发酵虫草菌丝的鉴别。【附图说明】

[0022] 图1为具有卫健字号的发酵虫草菌丝产品1的GC-MS总离子流图；

[0023] 图2-1为具有卫健字号的发酵虫草菌丝产品2的GC-MS总离子流图；

[0024] 图2-2为具有卫健字号的发酵虫草菌丝产品3的GC-MS总离子流图；

[0025] 图2-3为具有卫健字号的发酵虫草菌丝产品4的GC-MS总离子流图；

[0026] 图2-4为具有卫健字号的发酵虫草菌丝产品5的GC-MS总离子流图；

[0027] 图2-5为无卫健字号的发酵虫草菌丝产品6的GC-MS总离子流图；

[0028] 图2-6为无卫健字号的发酵虫草菌丝产品7的GC-MS总离子流图；

[0029] 图2-7为无卫健字号的发酵虫草菌丝产品8的GC-MS总离子流图；

[0030] 图3为具有卫健字号的5种发酵虫草菌丝产品1、2、3、4、5及其他3种无卫健字号的发酵虫草菌丝产品6、7、8的多元化统计结果图；【具体实施方式】

[0031] 以下提供本发明一种基于GC-MS技术鉴定发酵虫草菌丝中挥发性成分的方法的具体实施方式，结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

[0032] 实施例1

[0033] 本实施例以一种发酵虫草菌丝胶囊中挥发性成分的检测为例说明其GC-MS的提取、分析和鉴定过程，但本发明的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：

[0034] 1、仪器与试药

[0035] 安捷伦7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪配自动进样器；发酵虫草菌丝胶囊，0.2g*60粒。

[0036] 2、发酵虫草产品挥发性成分的提取

[0037] 分别精密称取发酵虫草产品约10g，置于500ml的圆底烧瓶中，加入250ml的去离子水，另取50ml的无水乙醚作为萃取溶剂，置于250ml的圆底烧瓶中，两个烧瓶装在SDE同时蒸馏萃取装置上，置加热套加热使去离子水沸腾，以45℃油浴加热萃取溶剂，连续萃取12h，冷却至室温，将U型管和250ml圆底烧瓶里的乙醚层合并，加入NaCl粉末至过量，取出乙醚层，加入过量的无水硫酸钠粉末过夜干燥，滤出干燥剂，取出乙醚层，室温下氮吹至干，得到黄色透明油状物，称重。继续复溶在1000ul的无水乙醚中，4℃下保存，待测。

[0038] 3、气相色谱-质谱分析条件

[0039] 色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25cm×0.25mm)；程序升温条件：初始温度40℃，停留2min，以5℃/min的速度升至70℃，停留2min，以15℃/min的速度升至160℃，停留5min，以2℃/min上的速度升至180℃，停留2min，以5℃/min的速度升至280℃，停留2min；进样方式：分流进样，分流比100∶1；载气流速1ml/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度280℃；四级杆温度150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)35-480amu。

[0040] 4、方法学考察

[0041] (1)精密度试验

[0042] 精密称取1批发酵虫草菌丝，按实施例1的方法提取挥发性成分提取物，按实施例1的气相色谱-质谱条件分析，连续进样5次。以GC-MS总离子流图中以4号峰的保留时间和峰面积为参照，分别计算10个特征峰(参见图1)的相对保留时间和峰面积，结果显示各特征峰的相对保留时间的RSD在0.2％以内，相对峰面积的RSD在8.1％以内，表明仪器的精密度良好。

[0043] (2)重复性试验

[0044] 按实施例1的方法平行制备同一批发酵虫草菌丝挥发性成分提取物5份，按实施例1的气相色谱-质谱条件分析，每份样品进样一次。以GC-MS总离子流图中以4号峰的保留时间和峰面积为参照，分别计算10个特征峰(参见图1)的相对保留时间和峰面积，结果显示各特征峰的相对保留时间的RSD在0.2％以内，相对峰面积的RSD在7.5％以内，提示方法的重复性良好。

[0045] (3)稳定性试验

[0046] 按实施例1的方法制备发酵虫草菌丝挥发性成分提取物，分别于制备后0、4、8、16、24h进样测定。以GC-MS总离子流图中以4号峰的保留时间和峰面积为参照，分别计算
10个特征峰(参见图1)的相对保留时间和峰面积，结果显示24h内各特征峰的相对保留时间的RSD在0.3％以内，相对峰面积的RSD在8.8％以内，结果表明溶液在24h内稳定性良好。

[0047] 5、数据处理和分析

[0048] 色谱图的保留时间和积分面积由工作站自动完成，利用NIST11谱库检索鉴定色谱峰。各挥发性成分的相对含量通过面积归一化法得到。通过化学计量学软件将色谱图进行多元化统计处理。

[0049] 表1发酵虫草产品挥发性成分的鉴定表

[0050]

[0051]

[0052] 实施例2

[0053] 本实施例以8种发酵虫草菌丝GC-MS测定和化学计量学数据分析为例，说明发酵虫草菌丝品种的鉴别方法，但本发明的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：

[0054] 1、仪器与试药

[0055] 安捷伦7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪配自动进样器；具有卫健字号的5种发酵虫草菌丝产品(各三批)及无卫健字号的3种发酵虫草菌丝产品各1批(网购)。

[0056] 2、发酵虫草产品挥发性成分的提取

[0057] 分别精密称取8种发酵虫草菌丝产品各约20g，分别提取。提取方法如下：将发酵虫草菌丝置于500ml的圆底烧瓶中，加入250ml的去离子水，另取50ml的无水乙醚作为萃取溶剂，置于250ml的圆底烧瓶中，两个烧瓶装在SDE同时蒸馏萃取装置上，置加热套加热使去离子水沸腾，以45℃油浴加热萃取溶剂，连续萃取16h，冷却至室温，将U型管和250ml圆底烧瓶里的乙醚层合并，加入NaCl粉末至过量，取出乙醚层，加入过量的无水硫酸钠粉末过夜干燥，滤出干燥剂，取出乙醚层，室温下氮吹至干，得到黄色透明油状物，称重。继续复溶在2000ul的无水乙醚中，4℃下保存，待测。

[0058] 3、气相色谱-质谱分析条件

[0059] 色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25cm×0.25mm)；程序升温条件：初始温度40℃，停留2min，以5℃/min的速度升至70℃，停留2min，以15℃/min的速度升至160℃，停留5min，以2℃/min上的速度升至180℃，停留2min，以5℃/min的速度升至280℃，停留2min；进样方式：分流进样，分流比100∶1；载气流速1ml/min；进样量：1μL；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度280℃；四级杆温度150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)35-480amu。

[0060] 4、多元统计分析

[0061] 各色谱图的保留时间和积分面积由工作站自动完成，色谱图结果见图1和图2-1，2-2，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7。将8种发酵虫草菌丝GC-MS色谱图数据以AIA的格式输出，导入Databridge软件转化为RAW格式，然后再将RAW格式数据导入MassLynx V4.1软件，生成所有化合物的离子强度信息。通过SIMCA P+12.0软件产生3D图，进行多元化统计处理，结果见图3。每个点代表一个单独的样品，不同的发酵虫草菌丝得到了很好的分离，在不同的位置区分开来。相同的发酵虫草菌丝紧簇在一起，这种多元统计分析能很好的区分不同品种的发酵虫草菌丝。

[0062] 本发明的优点在于选择GC-MS技术对发酵虫草菌丝中挥发性成分进行鉴定，解决了对发酵虫草菌丝品种的鉴别问题；该方法操作简便、实验结果直观可靠，为发酵虫草菌丝产品的质量控制和评价提供一种方法。

[0063] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。