一种对任意核酸实施靶向切割的方法转让专利
申请号 : CN201310729068.9
文献号 : CN104745570B
文献日 : 2017-04-19
发明人 : 周国华 , 徐澍 , 邹秉杰
申请人 : 周国华
摘要 :
本发明涉及一种对任意核酸实施靶向切割的方法，为了建立该方法，构建并表达了一类结构识别核酸内切酶。具体步骤包括选择靶核酸的切割位置，设计与之互补的核酸探针；加入反应体系，使探针与底物杂交，形成可被结构识别核酸内切酶识别的二级结构；加入该类酶进行切割反应。其中，可被识别的核酸结构包括核酸侵入结构等；该类核酸内切酶的识别功能域由一类能够识别上述核酸二级结构酶的肽段组成，可选自E.coliMuts等；切割功能域选自IIS型核酸内切酶的切割功能；该类核酸内切酶的识别功能域和切割功能域之间的连接片段主要由丝氨酸和甘氨酸组成；该方法突破核酸底物序列的限制，因此可以实现对不同序列核酸的有效靶向切割。
权利要求 :
1.一种对任意核酸实施靶向切割的方法，其特征在于根据目标核酸的靶位点，设计针对靶位点的核酸探针；加入核酸探针，使其与目标核酸杂交，形成能够被一类识别核酸结构并具有切割活性的酶识别的结构；在所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶存在的情况下，核酸探针与目标核酸形成的杂交结构被酶切割；对于序列不同的靶核酸，只需要更换对应的核酸探针，无需更换酶，即能够对任意序列核酸进行靶向切割;所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶为一种重组结构识别核酸内切酶，包含识别功能域、切割功能域以及连接二者的肽段；所述的识别功能域为能够识别结构为5’突出核酸结构、3’突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种的识别功能域；所述的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功能域；所述的连接肽段为不影响结构识别与酶切功能的的柔性肽段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的识别功能域为TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts中任意一种酶的识别功能域或全酶片段；所述的切割功能域为FokI的部分或全部肽段；所述的连接肽段为甘氨酸或丝氨酸的串联组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸为DNA或RNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的目标核酸为单链或者双链，当为双链时分别针对其中一条链的切割位置设计探针。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸探针与靶核酸形成的结构包括
5’突出核酸结构、3’突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种。
7.一种重组结构识别核酸内切酶，该重组结构识别核酸内切酶由识别功能域、切割功能域以及识别功能域和切割功能域之间的连接片段组成，其特征在于所述的识别功能域为能够识别二级结构为5’突出核酸结构、3’突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的任意一种的肽段；所述的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功能域肽段；所述的连接片段主要由丝氨酸和甘氨酸组成。
8.根据权利要求7所述的重组结构识别核酸内切酶，其特征在于所述的识别功能域选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts中任意一种的部分或全部肽段；所述的切割功能域选自FokI的C端196个氨基酸残基；所述的连接片段选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的重组结构识别核酸内切酶，其特征在于所述的识别功能域选自AfuFEN、TaqPol或Tthmuts中任意一种的部分或全部肽段。
10.根据权利要求7所述的重组结构识别核酸内切酶，其特征在于所述重组结构识别核酸内切酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中的任意一种。
说明书 :
一种对任意核酸实施靶向切割的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种对任意核酸实施靶向切割的方法。
背景技术
[0002] 分子生物学中对核酸的靶向切割常常使用限制性内切酶，限制性核酸内切酶是一种能催化核酸断裂的酶，只对一定碱基序列中的一定位置发生作用。限制性内切酶主要分成三大类，其中II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸序列，并在该序列中或者序列外的固定位置切割双链，产生粘性或平头末端，是常用的工具酶。尽管目前有超过3700种限制性内切酶被开发，却只能识别300种不同的核酸序列，很难满足科研和应用的需要，因此，数种拓展可被识别序列范围的方法应运而生。
[0003] 第一种研究思路，是将现有限制性内切酶的关键氨基酸突变，使其本身的识别切割特性发生变化，得到不同性质的限制性内切酶，从而识别并切割不同序列。
[0004] 第二种研究思路，是将不同限制性内切酶的识别功能域、切割功能域交叉互换，彼此排列组合，形成新的限制性内切酶，从而识别并切割不同序列。
[0005] 第三种研究思路，是通过频繁变更内切酶中的具有序列识别活性的功能域，实现对多种序列的识别。锌指蛋白核酸内切酶（ZFNs）就是这样一种酶，ZFNs的非特异性核酸切割域源自Fok I酶C端196个氨基酸肽段，与切割功能域相连的识别域是由一系列锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白特异性识别并结合一个特异的三联体碱基，锌指蛋白中alpha螺旋的16个氨基酸决定了锌指蛋白的DNA结合特异性，因此不同的锌指蛋白可以识别并结合不同的核酸序列，通过更换锌指蛋白就可以实现对不同序列核酸底物的识别切割。同时，人们还研究出了转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），该酶与ZFNs的区别在于用转录激活因子样效应子代替了锌指蛋白。前者可以识别不同的单个碱基，后者只能识别不同的三联体碱基，因此TALENs比ZFNs更加具有应用潜力。
[0006] 尽管ZFNs和TALENs实现了对许多不同序列的识别和切割，但其昂贵的价格、过长的设计周期使得二者的广泛应用受到严重限制，原因在于，频繁变更内切酶中的功能域，其过程十分复杂。更加严重的是，尽管理论上可以针对任何序列设计相应的ZFNs，实际上ZFNs几乎只对G碱基含量较高的序列有较好的识别作用，这是因为锌指蛋白中富含精氨酸，精氨酸和G碱基之间相互作用比精氨酸与其它碱基之间的作用力强。并且ZFNs的非特异切割严重，常常错切导致细胞毒性。这些都证明通过频繁变更内切酶中具有序列识别活性的功能域以实现对多种序列识别的方法有较大的局限性。
[0007] 为了提高通用性，降低成本，缩短设计周期，本发明引入了结构识别目的核酸的概念，替代传统的序列识别目的核酸概念，通过一种能和目的核酸形成特殊结构的探针以及一种可识别该结构的酶，实现对不同核酸的靶向识别切割。与频繁变更内切酶中的功能域相比，变更探针更加节省时间和费用，具有较强的创新性、通用性以及应用价值。
发明内容
[0008] 本发明的目的是针对现有核酸切割技术的上述不足，提供一种对任意核酸实施靶向切割的方法。
[0009] 一种对任意核酸实施靶向切割的方法，根据目标核酸的靶位点，设计针对靶位点的核酸探针；加入核酸探针，使其与目标核酸杂交，形成能够被一类识别核酸结构并具有切割活性的酶识别的结构；在所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶存在的情况下，对核酸探针与目标核酸形成的杂交结构进行切割；对于序列不同的靶核酸，只需要更换对应的核酸探针，无需更换酶，即可对任意序列核酸进行靶向切割。
[0010] 其中，所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶为一种重组结构识别核酸内切酶，包含识别功能域、切割功能域以及连接二者的肽段；所述的识别功能域为能够识别结构为5’突出核酸结构、3’突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种的识别功能域，优选TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts中任意一种酶的识别功能域或全酶片段；所述的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功能域，优选Fok I的部分或全部肽段；所述的连接肽段为不影响结构识别与酶切功能的的柔性肽段，优选甘氨酸或丝氨酸的串联组合。
[0011] 所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶的氨基酸序列优选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中的任意一种。
[0012] 所述的核酸为DNA或RNA。
[0013] 所述的目标核酸为单链或者双链，当为双链时分别针对其中一条链的切割位置设计探针。
[0014] 所述的核酸探针与靶核酸形成的结构包括5’突出核酸结构、3’突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种。
[0015] 一种重组结构识别核酸内切酶，该重组结构识别核酸内切酶由识别功能域、切割功能域以及识别功能域和切割功能域之间的连接片段组成，所述的识别功能域为能够识别二级结构为5’突出核酸结构、3’突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的任意一种的肽段；所述的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功能域肽段；所述的连接片段主要由丝氨酸和甘氨酸组成。
[0016] 所述的识别功能域优选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts中任意一种的部分或全部肽段；进一步优选AfuFEN、TaqPol或Tthmuts中任意一种的部分或全部肽段；所述的切割功能域优选自Fok I的C端196个氨基酸残基；所述的连接片段优选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中的任意一种。
[0017] 所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶的氨基酸序列优选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中的任意一种。
[0018] 本发明所述的5’突出核酸结构是指一种由两条长度不等的互补核酸构成的结构，短核酸的5’端与长核酸的3’端平齐，长核酸的5’端长于短核酸的3’端，即长核酸的5’端有部分处于单链状态，如图1所示；
[0019] 本发明所述的3’突出核酸结构是指由一种由两条长度不等的互补核酸构成的结构，短核酸的3’端与长核酸的5’端平齐，长核酸的3’端长于短核酸的5’端，即长核酸的3’端有部分处于单链状态，如图2所示；
[0020] 本发明所述的切刻核酸结构是指一种由两条互补核酸组成的结构，其中一条核酸的两个相邻碱基之间缺少磷酸二脂碱，如图3所示；
[0021] 本发明所述的Y型核酸结构是指一种由两条部分互补的核酸组成的结构，两条核酸的一段完全互补，另一端不互补，形成Y型，如图4所示；
[0022] 本发明所述的侵入核酸结构是指一种由上游探针、下游探针以及模板探针组成的结构，上、下游探针均与模板互补，DNA双链中上游探针侵入下游双链至少一个碱基形成的如图5所示的结构；
[0023] 本发明所述的错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构是指由两条不完全互补的核酸所组成的结构，其中因为错配或者缺失的碱基而形成一个或若干碱基的不匹配，称之为鼓泡结构，如图6所示。
[0024] 有益效果：
[0025] 本发明方法对于不同的目标核酸，只需要更换对应的探针，不需要更换酶，就可以实现对任意核酸进行靶向切割，具有极强的通用性。
[0026] 本发明重组结构识别核酸内切酶不只可用于体外靶核酸的切割，还可用于细胞内基因组切割，具有良好的创新性。
附图说明
[0027] 图1-是关于能被识别的5’突出核酸结构的示意图
[0028] 图2-是关于能被识别的3’突出核酸结构的示意图
[0029] 图3-是关于能被识别的切刻核酸结构的示意图
[0030] 图4-是关于能被识别的Y型核酸结构的示意图
[0031] 图5-是关于能被识别的侵入核酸结构的示意图
[0032] 图6-是关于能被识别的鼓泡（错配/缺失）核酸结构的示意图
[0033] 图7-是关于一优选例中切割位点的示意图
[0034] 图8-是关于实施例1的结果图
[0035] 图9-是关于实施例2中重组质粒结构示意图
[0036] 图10-是关于实施例2的结果图
[0037] 图11-是关于实施例3的结果图，其中1：重组菌诱导后菌体总蛋白；2：重组菌诱导后菌体上清蛋白；3：宿主菌诱导后菌体上清蛋白4：纯化后的A3N；M：蛋白质分子量Marker[0038] 图12-是关于实施例4的原理图
[0039] 图13-是关于实施例4的结果图，其中1：加入Flap核酸内切酶1体系的反应产物；2：加入重组酶A3N体系的反应产物；3：不加酶的反应体系；4：Flap片段核酸探针；5：上游探针；
6：下游探针；7：靶核酸
6：下游探针；7：靶核酸
[0040] 图14-是关于实施例5的结果图，其中，1：加入重组酶A3N且缺少下游探针体系的反应产物；2：靶核酸；3：上游探针
[0041] 图15-是关于实施例6的结果图
[0042] 图16-是关于实施例7的结果图1
[0043] 图17-是关于实施例7的结果图2
[0044] 图18-是关于实施例8的结果图1
[0045] 图19-是关于实施例8的结果图2
[0046] 图20-是关于实施例8的结果图3
具体实施方式
[0047] 参照下列实施例更详细描述本发明。然而，本发明不应解释为限制于此。
[0048] 实施例1〈目的基因A的扩增〉
[0049] 根据下述PCR方法，扩增识别功能域的编码基因A。将pET24a(+)-FEN1质粒模版（SEQ ID NO.9），0.025U/μL Primestar酶、5mM Mg2+、0.2μM寡核苷酸引物（5’-TATACATATGGGTGCGGATATTGGTGA-3’即SEQ ID No .10和5’-TATAGAATTCGAACCACCTCTCAAGCGT-3’即SEQ ID No.11）、0.2mM dNTPs分别加至反应液中。利用热循环仪，反应液在94℃热处理3min，然后以“94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 100s”的程序循环30次，利用PCR纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，依据纯化试剂盒所附说明书进行纯化处理，并用30μL超纯水洗脱。经琼脂糖电泳分析，结果如图8所示，其中泳道M为λ-EcoT14 I digest DNA Marker，泳道1为PCR产物扩增条带，与Marker对比，条带与Flap核酸内切酶1基因片段理论大小（1017bp）一致，说明扩增产物是目的产物，将该PCR产物送测序，结果也与SEQ ID NO.3第58到1075bp一致。
[0050] 实施例2〈重组质粒pET28a(+)-His-A3N的构建〉
[0051] 利用Nde I和EcoR I酶切酶连反应，将实施例1中的扩增产物A插入质粒pET28a(+)-His-3N（即SEQ ID NO.12，其中第1069到1716bp为编码连接肽段和切割功能域的序列）（上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成）构成重组质粒pET28a(+)-His-A3N，重组质粒结构如图9所示。转化入宿主菌ArcticExpress保存（购自中国微生物菌种资源库）。将菌种接种于5mL LB（含30μg/mL卡那霉素）液体培养基中，37℃ 200r/min振摇培养过夜，利用常规方法提取质粒。用限制性内切酶Xba I和Xho I处理提取的质粒，琼脂糖凝胶电泳验证质粒的正确性，结果见图10，其中泳道M为DL5,000 DNA Marker，泳道1为pET28a(+)-His-A3N双酶切产物，酶切片段条带与Marker对比可见，与理论上应该被切下的片段（1817bp）大小基本一致，说明pET28a(+)-His-A3N构建成功，将该重组质粒送测序，结果如SEQ ID NO.3所示，也与理论序列一致。
[0052] 实施例3〈重组结构识别核酸内切酶A3N的表达和纯化〉
[0053] 利用大肠杆菌重组蛋白表达系统，根据下述方法，表达该重组结构识别核酸内切酶。首先，利用上述方法制备的重组质粒，以常用方法转化进宿主菌ArcticExpress。将所得转化体接种至5mL含有卡那霉素的LB培养基中，并在37℃下以振荡培养方式温育，直到OD600达到0.6。将所得培养物按1%接种至100mL含有卡那霉素的LB培养基中，进一步在37℃下以震荡方式温育，直到OD600达到0.6。接着，将异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷以终浓度0.1mM加至培养物中，由此诱导所需蛋白的表达，以振荡培养方式25℃诱导16小时。收集诱导表达的菌体，超声破菌，离心，由于重组蛋白含有组氨酸标签，上清用镍亲和层析纯化，用
30、50mmol/L咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，300mmol/L咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，将亲和层析纯化得到的重组蛋白A3N进行超滤除盐处理（采用截留分子量为30KDa的超滤膜），保存在重组蛋白A3N储存缓冲液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L DTT，0.1mmol/L EDTA，
50%甘油，pH7.4）中，所得产物用SDS-PAGE分析，结果见图11，诱导表达16h的菌体总蛋白（泳道1）与无目的蛋白的菌体上清蛋白对比（泳道3），发现从平板上挑取的菌落为阳性克隆菌，表达了分子量约为65kDa的重组酶A3N，所表达的目的蛋白有较好的可溶性（泳道2），纯化后的重组酶A3N（泳道4）基本满足生物催化和酶学研究的要求。
30、50mmol/L咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，300mmol/L咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，将亲和层析纯化得到的重组蛋白A3N进行超滤除盐处理（采用截留分子量为30KDa的超滤膜），保存在重组蛋白A3N储存缓冲液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L DTT，0.1mmol/L EDTA，
50%甘油，pH7.4）中，所得产物用SDS-PAGE分析，结果见图11，诱导表达16h的菌体总蛋白（泳道1）与无目的蛋白的菌体上清蛋白对比（泳道3），发现从平板上挑取的菌落为阳性克隆菌，表达了分子量约为65kDa的重组酶A3N，所表达的目的蛋白有较好的可溶性（泳道2），纯化后的重组酶A3N（泳道4）基本满足生物催化和酶学研究的要求。
[0054] 实施例4〈重组结构识别核酸内切酶A3N体外识别活性验证〉
[0055] 重组酶A3N拥有Flap核酸内切酶1功能域，并依靠Flap核酸内切酶1的活性识别目的核酸。Flap核酸内切酶1主要应用于侵入结构核酸反应，其活性也主要是利用侵入结构核酸反应来测定，从而间接地在体外水平测定了重组酶A3N的识别活性。测定A3N识别活性的原理如图12所示，在反应体系中，重组酶A3N的Flap核酸内切酶1活性可识别侵入结构，并切割下游探针，产生Flap片段，反应结果可由尿素聚丙烯酰胺变性电泳检测，由A3N能否产生于Flap核酸内切酶1相同的Flap片段，判断所表达的重组酶A3N是否具有识别核酸侵入结构的活性。
[0056] 将1pmoL上游探针1寡核苷酸5’-ATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCC-3’，即SEQ ID No.13，10pmoL下游探针1寡核苷酸5’-AGCAGGACGGGATCTGGCCTGGTGC-3’，即SE Q ID No.14，1pmoL靶核酸1寡核苷酸5’-CTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAG GGGAAGTGACAT，即SEQ ID No.15，以及Mix（10mmol/L MOPS pH7.5，0.05% Twe en-20，0.05% Nonidet P40）充分混匀，用超纯水补足体积10μL。以“95℃ 5min，55℃ 10min”程序杂交，加入13.8pmoL重组结构识别核酸内切酶A3N（实施例3制备），以Flap核酸内切酶1体系为对照，63℃反应2h，反应产物加2×上样缓冲液（90%甲酰胺，0.5%EDT A，0.1%二甲苯蓝，0.1%溴酚蓝），煮沸5min，急速冷却，20%尿素变性电泳，120V电泳2h，银染分析切割条带。反应产物的电泳结果见图13，其中T表示靶核酸1SEQ ID No.15，UP表示上游探针1SEQ ID No.13，DP表示下游探针1SEQ ID No.14，与没有酶作用的对照组相比（泳道3），在Flap核酸内切酶1的作用下，下游探针1寡核酸SEQ ID No.14被切割产生片段长度更短的切割产物Flap片段（泳道1箭头所示），在重组酶A3N的作用下，下游探针1寡核酸SEQ ID No.14也被切割产生与泳道1所示结果相同的Flap片段（泳道2箭头所示），证明所表达的重组酶A3N具有识别侵入核酸结构（图5）的活性。
[0057] 实施例5〈重组结构识别核酸内切酶A3N体外切割活性验证〉
[0058] 重组酶A3N拥有Fok I位于C端的非特异性DNA切割区域，并依靠其切割底物。Flap核酸内切酶1可识别双链DNA5′突出核酸结构，重组酶A3N拥有Flap核酸内切酶1的识别结构域，因此重组酶A3N也应该可识别双链DNA5′突出核酸结构，选用双链DNA5′突出核酸结构为反应底物，检测A3N的切割活性。如A3N作用产生不同于底物的小片段，则证明A3N有切割活性。
[0059] 将10pmoL上游探针1寡核苷酸SEQ ID No.13，10pmoL靶核酸1寡核苷酸SEQ ID No.15，以及Mix（10mmol/L MOPS pH7.5，0.05% Tween-20，0.05% Nonidet P40）充分混匀，用超纯水补足体积10μL。以“95℃ 5min，55℃ 10min”程序杂交，加入13.8pmoL重组结构识别核酸内切酶A3N（实施例3制备），37℃反应2h，反应产物加2×上样缓冲液（90%甲酰胺，0.5%EDTA，0.1%二甲苯蓝，0.1%溴酚蓝），煮沸5min，急速冷却，20%尿素变性电泳，120V电泳
2h，银染分析切割条带。电泳结果见图14，其中T表示靶核酸2寡核苷酸SEQ ID No.15，UP表示上游探针2寡核苷酸SEQ ID No.13，上游探针2寡核苷酸被切割成小片段（泳道1箭头所示），表明A3N并非发生了随机切割，而是特异性切割。
2h，银染分析切割条带。电泳结果见图14，其中T表示靶核酸2寡核苷酸SEQ ID No.15，UP表示上游探针2寡核苷酸SEQ ID No.13，上游探针2寡核苷酸被切割成小片段（泳道1箭头所示），表明A3N并非发生了随机切割，而是特异性切割。
[0060] 实施例6〈重组结构识别核酸内切酶A3N无序列依赖性验证〉
[0061] 将10pmoL上游探针2寡核苷酸5’-TGGTTCCTCCTGAGGCCTCC-3’，即SEQ ID No.16，10pmoL靶核酸2寡核苷酸5’-TCTACAACCCAAGGAGAGAGGCCTCAGGAGGAACCA-3’，即SEQ ID No.17以及Mix（10mmol/L MOPS pH7.5，0.05% Tween-20，0.05% Nonidet P40）充分混匀，用超纯水补足体积10μL。以“95℃ 5min，55℃ 10min”程序杂交，10pmoL上游探针3寡核苷酸
5’-CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCC-3’，即SEQ ID No.18以及10pmoL靶核酸3寡核苷酸5’-CAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATCTTGACATG-3’，即SEQ ID No.19做同样处理，分别加入
13.8pmoL重组结构识别核酸内切酶A3N，分别37℃反应2h，反应产物加2×上样缓冲液（90%甲酰胺，0.5%EDTA，0.1%二甲苯蓝，0.1%溴酚蓝），煮沸5min，急速冷却，20%尿素变性电泳，
120V电泳2h，银染分析切割条带，结果见图15，与未添加添加重组结构识别核酸内切酶A3N相比，添加重组结构识别核酸内切酶A3N的反应底物均被不同程度地切割成小片段（泳道箭头所示），说明重组结构识别核酸内切酶A3N的识别是没有序列依赖性的。
5’-CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCC-3’，即SEQ ID No.18以及10pmoL靶核酸3寡核苷酸5’-CAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATCTTGACATG-3’，即SEQ ID No.19做同样处理，分别加入
13.8pmoL重组结构识别核酸内切酶A3N，分别37℃反应2h，反应产物加2×上样缓冲液（90%甲酰胺，0.5%EDTA，0.1%二甲苯蓝，0.1%溴酚蓝），煮沸5min，急速冷却，20%尿素变性电泳，
120V电泳2h，银染分析切割条带，结果见图15，与未添加添加重组结构识别核酸内切酶A3N相比，添加重组结构识别核酸内切酶A3N的反应底物均被不同程度地切割成小片段（泳道箭头所示），说明重组结构识别核酸内切酶A3N的识别是没有序列依赖性的。
[0062] 实施例7〈重组结构识别核酸内切酶A3N在体外酶切位点验证〉
[0063] 将10pmoL上游探针1寡核苷酸5’-ATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCC-3’，即SEQ ID No.13，10pmoL3’端生物素修饰的靶核酸1寡核苷酸5’-CTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACAT-bio3’，即SEQ ID No.15以及Mix（10mmol/L MOPS pH7.5，0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40）用超纯水补足体积10μL。以“95℃ 5min，55℃ 10min”程序杂交，加入
13.8pmoL重组结构识别核酸内切酶A3N，分别37℃反应2h。取2μL亲和素修饰的琼脂糖微球（beads），与20μL反应产物混合，37℃充分混匀30min，离心去上清，剩余beads溶于8μL1×退火buffer中制成测序样本。取3μL测序样本，与40μL焦测序反应液（0.1M Tris–HAc pH7.7，
2mmol/L EDTA，10mmol/L Mg(Ac)2，0.1%BSA，1mmol/L DTT，2mmol/L APS，0.4g/L PVP，
0.4mmol/L D-荧光素，1.6U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶，适量商品荧光素酶，2mmol/L三磷酸腺苷硫酸化酶和18U/mL Exo-Klenow DNA polymerase）混和，在小型手提式焦磷酸测序仪上充分振荡，按一定顺序加入核苷酸进行测序。结果见图16，与未加入A3N的产物（图16-B）相比，加入A3N的酶切产物测序产生了较好的信号（图16-A），其测序信号为CCTTGGTTCT，推测探针被切割的位置在探针自3’端第14和15个核苷酸之间（图16-C）。
13.8pmoL重组结构识别核酸内切酶A3N，分别37℃反应2h。取2μL亲和素修饰的琼脂糖微球（beads），与20μL反应产物混合，37℃充分混匀30min，离心去上清，剩余beads溶于8μL1×退火buffer中制成测序样本。取3μL测序样本，与40μL焦测序反应液（0.1M Tris–HAc pH7.7，
2mmol/L EDTA，10mmol/L Mg(Ac)2，0.1%BSA，1mmol/L DTT，2mmol/L APS，0.4g/L PVP，
0.4mmol/L D-荧光素，1.6U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶，适量商品荧光素酶，2mmol/L三磷酸腺苷硫酸化酶和18U/mL Exo-Klenow DNA polymerase）混和，在小型手提式焦磷酸测序仪上充分振荡，按一定顺序加入核苷酸进行测序。结果见图16，与未加入A3N的产物（图16-B）相比，加入A3N的酶切产物测序产生了较好的信号（图16-A），其测序信号为CCTTGGTTCT，推测探针被切割的位置在探针自3’端第14和15个核苷酸之间（图16-C）。
[0064] 将10pmoL上游探针1寡核苷酸5’-ATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCC-3’，即SEQ ID No.13，10pmoL5’端生物素修饰的靶核酸1寡核苷酸5’bio-CTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACA T-3’，即SEQ ID No.15以及Mix（10mmol/L MOPS pH7.5，0.05%Tween-20，0.05%Nonidet P40）用超纯水补足体积10μL。以“95℃ 5min，55℃ 10min”程序杂交，加入
13.8pmoLA3N酶，分别37℃反应2h。取2μL beads，与20μL反应产物混合，37℃充分混匀
30min，离心去上清，剩余beads溶于8μL1×退火buffer中制成测序样本。取3μL测序样本，与
40μL焦测序反应液混和，在小型手提式焦磷酸测序仪上充分振荡，按一定顺序加入核苷酸进行测序。结果见图17，与未加入A3N的产物（图17-B）相比，加入A3N的酶切产物测序产生了较好的信号（图17-A），测序信号可分为两部分，分别是AAGGGGAAGT和tga，因此，推测靶核酸切割位置有两处，均在与上游探针互补的部分，分别在向靶核酸3’端方向第10和11个核苷酸之间，以及向靶核酸3’端方向第19和20个核苷酸之间（图17-C）。
13.8pmoLA3N酶，分别37℃反应2h。取2μL beads，与20μL反应产物混合，37℃充分混匀
30min，离心去上清，剩余beads溶于8μL1×退火buffer中制成测序样本。取3μL测序样本，与
40μL焦测序反应液混和，在小型手提式焦磷酸测序仪上充分振荡，按一定顺序加入核苷酸进行测序。结果见图17，与未加入A3N的产物（图17-B）相比，加入A3N的酶切产物测序产生了较好的信号（图17-A），测序信号可分为两部分，分别是AAGGGGAAGT和tga，因此，推测靶核酸切割位置有两处，均在与上游探针互补的部分，分别在向靶核酸3’端方向第10和11个核苷酸之间，以及向靶核酸3’端方向第19和20个核苷酸之间（图17-C）。
[0065] 实施例8〈重组嵌合型核酸内切酶A3N在体内切割活性验证〉
[0066] CHO-EGFP细胞可稳定表达EGFP蛋白，针对EGFP基因序列设计两条长度为100bp，能够分别与两条链杂交的探针，
[0067] 5’-GTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCG CCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGC-3’，即SEQ ID No.20；
[0068] 5’-GTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAAC ACGATGATAATATGGCCACAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’，即SEQ ID No.21。在脂质体的作用下转染进CHO-EGFP细胞中，使编码EGFP的DNA双链分子上均形成能够被重组酶A3N识别的5’突出结构。将插入了重组酶A3N基因序列并能在真核细胞中表达的质粒pcDNA3.1(+)-A3N瞬时转染进CHO-EGFP细胞中，使重组酶A3N能在CHO-EGFP细胞中表达。同时转入pDSred2质粒，pDSred2质粒在激发光下发红光。如果A3N能够因识别杂交而形成的二级结构而对编码EGFP的DNA双链进行切割，产生双链切口，提高同源重组的效率，使EGFP编码基因发生移码突变，EGFP不表达，CHO细胞在激发光下失去发绿光的能力，而只发射红光。相反，如果EGFP的编码基因没有被切割，则细胞仍能发射绿光，与红光叠加，视为黄光。
[0069] 首先构建pcDNA3.1(+)-A3N。为了得到A3N的基因片段，以实施例2中构建的pET28a2+
(+)-His-A3N作为模版，Primestar酶、5mM Mg 、终浓度为0.2mM的dNTP、终浓度均为0.2μM寡核苷酸引物（5’-TATAGGATCCATGGGTGCGGATATTGGTGA-3’即SEQ ID No.22和5’-CGCGCTCGAGTCAAAGCTTAAAGTTTATCT-3’即SEQ ID No.23）分别加至反应液中。利用热循环仪，反应液在94℃热处理3min，然后以“94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min”的程序循环30次，所得产物依据纯化试剂盒所附说明书进行纯化处理，并用30μL超纯水洗脱。经琼脂糖电泳分析，结果如图18所示，其中泳道M为DL2,000 DNA Marker，泳道1为PCR产物扩增条带，与Marker对比，条带与A3N编码功能基因片段理论大小一致，说明扩增产物是目的产物。
(+)-His-A3N作为模版，Primestar酶、5mM Mg 、终浓度为0.2mM的dNTP、终浓度均为0.2μM寡核苷酸引物（5’-TATAGGATCCATGGGTGCGGATATTGGTGA-3’即SEQ ID No.22和5’-CGCGCTCGAGTCAAAGCTTAAAGTTTATCT-3’即SEQ ID No.23）分别加至反应液中。利用热循环仪，反应液在94℃热处理3min，然后以“94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min”的程序循环30次，所得产物依据纯化试剂盒所附说明书进行纯化处理，并用30μL超纯水洗脱。经琼脂糖电泳分析，结果如图18所示，其中泳道M为DL2,000 DNA Marker，泳道1为PCR产物扩增条带，与Marker对比，条带与A3N编码功能基因片段理论大小一致，说明扩增产物是目的产物。
[0070] 利用BamH I和Xho I酶切酶连反应，将扩增片段插入质粒pcDNA3.1(+)（购自Invitrogen）构成重组质粒pcDNA3.1(+)-A3N，用限制性内切酶BamH I和Xho I处理提取的质粒，琼脂糖凝胶电泳验证质粒的正确性，结果见图19，其中泳道M为λ-EcoT14 I digest DNA Marker，泳道1为pcDNA3.1(+)-A3N双酶切产物，酶切片段条带与Marker对比可见，与理论上应该被切下的片段大小基本一致，说明pcDNA3.1(+)-A3N构建成功。
[0071] 将探针SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、pcDNA3.1(+)-A3N、pDSred2转染进CHO-EGFP细胞，没有被转染的CHO细胞因含有EGFP而被激发呈绿色荧光，被转染的CHO细胞如被切割EGFP序列造成移码突变可因Dsred2激发呈红光，被转染的CHO细胞如没有被切割的可双重激发呈黄光。反应设立对照，结果如图20所示，红色细胞占被转染细胞的比率增加，说明部分EGFP序列被切割，说明本发明设计的结构识别核酸内切酶A3N可在细胞体内对目标序列进行切割。