一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针由特异性识别SIRT1蛋白的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，多肽的氨基酸序列为：甘氨酸-乙酰化赖氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸，聚集诱导发光分子与多肽中的甘氨酸相连。由于多肽的特定位置上含有乙酰化赖氨酸，使得该荧光探针中的多肽能被SIRT1蛋白特异性识别，从而SIRT1蛋白对该多肽进行去乙酰化修饰；该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去赖氨酸上的乙酰基时，则会产生明显的荧光吸收，进一步地利用内切酶从赖氨酸位置将多肽剪断时，其荧光吸收强度进一步增强，从而能对SIRT1蛋白活性进行特异性的实时检测。

权利要求

1.一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针，其特征在于，由特异性识别SIRT1蛋白的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，所述多肽的氨基酸序列为：甘氨酸-乙酰化赖氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸，所述聚集诱导发光分子与多肽中的甘氨酸相连。

2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述聚集诱导发光分子包含由至少一个四苯乙烯分子构成的基本骨架。

3.如权利要求1或2所述的荧光探针，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：

4.如权利要求3所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以4-羟基二苯酮和二苯酮为原料制备化合物A：(2)在碳酸盐存在下，利用卤代乙酸乙酯与化合物A进行取代反应，获得化合物B：(3)对化合物B进行还原，获得化合物C：

(4)利用预先合成的特异性识别SIRT1蛋白的多肽与化合物C进行固相多肽合成反应，获得如式(Ⅰ)的荧光探针。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，利用强碱对化合物B进行还原。

6.如权利要求1～3任一所述荧光探针在SIRT1蛋白活性检测中的应用。

7.如权利要求1～3任一所述荧光探针在筛选SIRT1蛋白激动剂中的应用。

8.如权利要求1～3任一所述荧光探针在筛选SIRT1蛋白抑制剂中的应用。

说明书

一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 组蛋白去乙酰化是一种重要的组蛋白共价修饰方式，在基因表达中起着非常重要的调控作用。组蛋白去乙酰化主要由组蛋白去乙酰化酶催化完成，现已发现的组蛋白去乙酰化酶除了经典的锌离子依赖的组蛋白去乙酰化酶外，还有一类较为特殊的组蛋白去乙酰化酶—沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)相关蛋白。Sir2相关+蛋白家族是一组高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD )依赖的组蛋白去乙酰化酶，广泛存在于从低等生物到人类的各物种中。目前发现的人类Sirtuin家族成员有7个，SIRT 1～
7，其中SIRT 1是目前研究最深入的一个。

[0003] SIRT 1主要定位于细胞核中，具有较高的NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶活性，通过对组蛋白及多种非组蛋白底物的去乙酰化修饰，调节底物的乙酰化水平和活性，从而参与基因表达调控、细胞凋亡、分化等诸多生理过程，进而影响肿瘤等疾病的发生发展。近年来研究表明，SIRT1蛋白活性与如衰老、肿瘤、神经退行性疾病等与年龄相关的慢性疾病的发生发展密切相关。SIRT1蛋白激动剂被认为在调节能量代谢等方面发挥重要功能，SIRT1蛋白抑制剂也在肿瘤治疗中显示出一定的应用前景。

[0004] 目前常用的SIRT1调节剂筛选方法包括了利用放射标记乙酸或者NAD+的检测方法、基于液相色谱或液质联用分析方法、荧光偏振方法以及免疫印迹方法等。这一类方法大都需要通过多个步骤进行样本处理、难以直接测定得到SIRT1蛋白活性。此外，上述方法均不能用于SIRT1蛋白的细胞实时成像研究。

[0005] 近年来，具有聚集诱导发光(Aggregation-induced emission,AIE)效应的荧光探针逐渐兴起，这类探针可有效地避免传统荧光材料存在的聚集态荧光减弱甚至猝灭的现象，为设计高荧光量子产率的固态材料提供了一种新思路。

[0006] 目前尚未见能特异性地识别SIRT1蛋白并对其进行活性检测的AIE荧光探针的相关报道。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针，该荧光探针能特异性地识别SIRT1蛋白。

[0008] 一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针，由特异性识别SIRT1蛋白的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，所述多肽的氨基酸序列为：甘氨酸-乙酰化赖氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸，所述聚集诱导发光分子与多肽中的甘氨酸相连。

[0009] 本发明的荧光探针以聚集诱导发光分子为母核，母核上连接亲水性的多肽，从而形成能特异性检测SIRT1蛋白的荧光探针。由于多肽的特定位置上含有乙酰化赖氨酸，使得该荧光探针中的多肽能被SIRT1蛋白特异性识别，从而SIRT1蛋白对该多肽进行去乙酰化修饰；该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去赖氨酸上的乙酰基时，则会产生明显的荧光吸收，进一步地利用内切酶从赖氨酸位置将多肽剪断时，其荧光吸收强度进一步增强，从而能对SIRT1蛋白活性进行特异性的实时检测。

[0010] 作为优选，所述聚集诱导发光分子包含由至少一个四苯乙烯分子构成的基本骨架。当基本骨架中含有多个四苯乙烯分子时，多个四苯乙烯分子之间通过分子间相互作用聚集。

[0011] 作为优选，所述荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

[0012]

[0013] 本发明还提供了一种所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

[0014] (1)以4-羟基二苯酮和二苯酮为原料制备化合物A：

[0015]

[0016] 具体地，步骤(1)包括：4-羟基二苯酮与二苯酮以四氢呋喃为溶剂在锌粉与四氯化钛催化下加热回流(85℃)发生麦克默里反应，经硅胶色谱分离制备得到化合物A。

[0017] (2)在碳酸盐存在下，利用卤代乙酸乙酯与化合物A进行取代反应，获得化合物B：

[0018]

[0019] 碳酸盐作为催化剂夺取化合物A酚羟基上的氢离子，以便使该氢离子能更快更容易地与卤代乙酸乙酯反应，若缺失碳酸盐，反应将会进行得十分缓慢。

[0020] 碳酸盐可选用碳酸钾或碳酸钠。

[0021] 作为优选，化合物A、卤代乙酸乙酯、碳酸盐的摩尔比为1：1.2～1.4：1.2～1.4，在100～120℃之间回流24h进行取代反应。

[0022] (3)对化合物B进行还原获得化合物C：

[0023]

[0024] 作为优选，利用氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂等强碱对化合物B进行还原。

[0025] 反应时，将化合物B先溶于四氢呋喃中制成B溶液(浓度为0.074mol/L～0.082mol/L)，强碱先溶于水中制成强碱溶液(浓度为3.6mol/L～4.0mol/L)，然后B溶液与强碱溶液在四氢呋喃环境下混合反应，混合比例优选为2.2～2.3：1(v/v)。

[0026] (4)利用预先合成的特异性识别SIRT1蛋白的多肽与化合物C进行固相多肽合成反应，获得如式(Ⅰ)的荧光探针。

[0027] 化合物Ⅳ中的羧基与多肽中甘氨酸的氨基发生脱水缩合反应，获得本发明的荧光探针。

[0028] 本发明还提供了所述荧光探针在SIRT1蛋白活性检测中的应用。

[0029] 本发明还提供了所述荧光探针在SIRT1蛋白激动剂筛选中的应用。

[0030] 本发明还提供了所述荧光探针在SIRT1蛋白抑制剂筛选中的应用。

[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0032] 本发明的荧光探针能够特异性地识别SIRT1蛋白，SIRT1蛋白能特异性地改变荧光探针中乙酰化赖氨酸的乙酰化修饰，从而使本身基本无荧光吸收的荧光探针在470nm下产生明显的荧光吸收，实现对SIRT1蛋白活性的特异性检测，还能进一步用于筛选SIRT1蛋白激动剂和抑制剂。

附图说明

[0033] 图1为本发明一种具有聚集诱导发光特性的荧光探针的合成流程图；

[0034] 图2为实施例1中化合物C和荧光探针的荧光光谱分析结果图；

[0035] 其中，TPE-COOH表示化合物C，TPE-GK(Ac)YDD表示荧光探针，Wavelength/nm表示波长(nm)，PL intensity(a.u.)表示荧光光谱强度，下同；

[0036] 图3为在SIRT 1蛋白和/或SIRT 1蛋白调节剂存在下荧光探针的荧光光谱分析结果图；

[0037] 其中，SIRT 1表示SIRT 1蛋白，EX527为SIRT 1蛋白抑制剂，SIRT1720为SIRT 1蛋白激动剂，下同；

[0038] 图4为SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶对荧光探针荧光吸收能力的影响；

[0039] 其中，Sirt1(+)Lysyl(+)表示SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶同时存在，Sirt1(+)Lysyl(-)表示存在SIRT1蛋白，不存在赖氨酰肽链内切酶，Sirt1(-)Lysyl(+)表示存在赖氨酰肽链内切酶，不存在SIRT1蛋白，Sirt1(-)Lysyl(-)表示SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶均不存在；

[0040] 图5为本发明荧光探针检测SIRT1蛋白的原理图；

[0041] 其中，inhibitor表示抑制剂，activator表示激动剂，Lysyl Endopeptidase表示赖氨酰肽链内切酶，Cytoplasm表示细胞质，Nucleus表示细胞核，Ac表示乙酰基，Turn on表示(荧光)亮了，Light up表示(荧光)增强；

[0042] 图6为SIRT1蛋白与荧光强度的量效关系图；

[0043] 其中，SIRT1(mg/mL)表示SIRT1蛋白浓度(mg/mL)；

[0044] 图7为荧光探针与荧光强度的量效关系图；

[0045] 其中，TPE-GK(Ac)YDD(μM)表示荧光探针浓度(μM)；

[0046] 图8为EX527浓度与其对SIRT1蛋白抑制效应的量效关系图；

[0047] 其中，Log Concentratin of EX527(nM)表示EX527浓度(nM)的对数，inhibition rate(％)表示抑制率(％)；

[0048] 图9为SIRT1720浓度与其对SIRT1蛋白激动效应的量效关系图；

[0049] 其中，Log Concentratin of SIRT 1720(nM)表示SIRT 1720浓度(nM)的对数，Activation rate(％)表示激动率(％)；

[0050] 图10A为在SIRT1蛋白调节剂存在下荧光探针染色后的细胞荧光图像；

[0051] 其中，Con(正常组)为正常心肌细胞，Res组为白藜芦醇刺激的心肌细胞，EX组为EX527孵育的心肌细胞；BF列表示在光镜下观察到的细胞图像，FI列表示在荧光下观察到的细胞图像，Merge列表示BF列和FI列的拼接图；

[0052] 图10B为在SIRT1蛋白调节剂存在下经荧光探针染色后细胞的相对荧光强度检测结果；

[0053] 其中，control表示正常心肌细胞，Resveratrol表示白藜芦醇刺激的心肌细胞，EX527表示EX527孵育的心肌细胞，Relative Fluorescence intensity表示相对荧光强度；

[0054] 图11为荧光探针对SIRT1蛋白的检测灵敏度考察结果；

[0055] 其中，Concentratin of SIRT 1(mg/mL)表示SIRT1蛋白的浓度(mg/mL)；

[0056] 图12为与其他蛋白相比，荧光探针对SIRT1蛋白的胞外检测特异性考察结果；

[0057] 其中，Sirt 1、HSA、BSA、CollⅠ、CollⅡ、CYC、Lyso、Trypsin、Thrombin、HDAC3、HDAC1分别表示SIRT1蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、细胞色素C、溶菌酶、胰蛋白酶、凝血酶、组蛋白去乙酰化酶3、组蛋白去乙酰化酶1，(I-I0)/I0表示(样品荧光值-本底值)/本底值，下同；

[0058] 图13为荧光探针对SIRT1蛋白的胞内检测特异性考察结果；

[0059] 其中，FDA表示采用FDA对心肌细胞染色(标记细胞质)，SIRT 1表示用荧光探针TPE-GK(Ac)YDD对心肌细胞染色(标记细胞核)，Merge为FDA和SIRT 1的拼接图；

[0060] 图14为荧光探针的细胞毒性测试结果；

[0061] 其中，Incubation time(h)表示孵化时间(h)，Cell Survival(％)表示细胞存活率(％)。

具体实施方式

[0062] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

[0063] 实施例1具有AIE特性的荧光探针合成

[0064] 本实施例一种具有AIE特性的荧光探针的合成方法，其合成流程如图1所示，包括：

[0065] (1)将4-羟基二苯酮(1.9g，10mmol)与二苯酮(2.2g，12mmol)与锌粉(2.9g，44mmol)加入250ml三口烧瓶中，抽气，通氮气，重复三次；加入80ml THF(四氢呋喃)，0℃冰水浴30min；在冰水浴下滴加四氯化钛(2.4ml，22mmol)，回流过夜，旋干；加入适量二氯甲烷和稀盐酸进行萃取，取下层有机层，利用无水硫酸镁进行干燥，过滤，旋干，过硅胶柱色谱，先用石油醚：乙酸乙酯＝20:1溶剂冲洗，再用石油醚：乙酸乙酯＝8:1溶剂冲洗，收集8:1冲洗下来的部分，旋干，得到化合物A(1.0g)；

[0066] (2)取化合物A(1.0g)加入圆底烧瓶，再加入溴乙酸乙酯0.4ml与碳酸钾0.5g，再加入乙腈，搅拌，升温至110℃，回流24h，过滤，旋干溶剂，过硅胶柱色谱，先用石油醚冲洗，再用石油醚：乙酸乙酯＝20:1溶剂冲洗；收集20:1冲洗下来的部分，旋干，得到化合物B(约0.7g)；

[0067] (3)向化合物B中加入THF 28ml，加入氢氧化钠2g(事先用12ml水溶解)，反应24h，旋干THF，用二氯甲烷溶解，再加入稀盐酸，萃取，取有机相，旋干，得到化合物C(0.4g，TPE-COOH)；

[0068] (4)通过固相多肽合成反应单独合成多肽链，多肽链的序列为甘氨酸-乙酰化赖氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；

[0069] (5)将多肽链的甘氨酸N端氨基与化合物C进行固相多肽合成反应，得到化合物D即本实施例的荧光探针TPE-GK(Ac)YDD。将TPE-COOH和TPE-GK(Ac)YDD溶于Tris-Hcl(pH 8.8)缓冲液中分别制成浓度为50μM的溶液，分别对两种溶液进行荧光光谱分析，设定激发波长为320nm，得到光谱图如图2所示。

[0070] 从图2中可以看出，TPE-COOH在470nm处由于聚合诱导发光效应产生明显的荧光吸收，而新合成的荧光探针TPE-GK(Ac)YDD则基本无荧光吸收。

[0071] 实施例2荧光探针TPE-GK(Ac)YDD在SIRT1蛋白活性检测中的应用

[0072] (1)荧光探针TPE-GK(Ac)YDD检测SIRT1蛋白活性

[0073] 样品组1：加入50μL SIRT1(0.72mg/mL)、12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)和36μL NAD+(50mM)；

[0074] 样品组2：加入50μL SIRT1(0.72mg/mL)、12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)、激动剂SRT1720(500nM)和36μL NAD+(50mM)；

[0075] 样品组3：加入50μL SIRT1(0.72mg/mL)、12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)、抑制剂EX527(200nM)和36μL NAD+(50mM)；

[0076] 样品组4：加入12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)+和36μL NAD(50mM)；

[0077] 四个样品组均在37℃孵育下反应3小时。反应结束后采用JASCO FP-6500分光光度计测量320nm激发下，400nm到600nm的荧光光谱。

[0078] 检测结果如图3所示。

[0079] 由图3可见，SIRT1蛋白加入前，体系中仅含荧光探针，荧光强度较低；而SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶加入后，体系的荧光强度急速上升；当体系中加入SIRT1蛋白激动剂SIRT1720后，体系的荧光强度进一步上升；而当体系中加入SIRT1蛋白抑制剂EX527后，体系的荧光强度则降低。

[0080] (2)SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶对荧光探针TPE-GK(Ac)YDD的荧光吸收能力的影响

[0081] 样品组1：加入50μL SIRT1(0.72mg/mL)、12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)和36μL NAD+(50mM)；

[0082] 样品组2：加入50μL SIRT1(0.72mg/mL)、12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)和36μL NAD+(50mM)；

[0083] 样品组3：加入12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)和36μL NAD+(50mM)；

[0084] 样品组4：加入12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)和36μL NAD+(50mM)；

[0085] 四个样品组均在37℃孵育下反应3小时。反应结束后采用JASCO FP-6500分光光度计测量320nm激发下，400nm到600nm的荧光光谱。

[0086] 检测结果如图4所示。

[0087] 由图4可见，在SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶同时缺失的情况下，体系的荧光强度较低；当仅加入赖氨酰肽链内切酶时，体系的荧光强度变化不大；而当仅加入SIRT1蛋白时，体系的荧光强度显著上升；当同时加入SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶时，体系的荧光强度则进一步上升。

[0088] 这是因为，荧光探针TPE-GK(Ac)YDD本身基本无荧光吸收，但当SIRT1蛋白和赖氨酰肽链内切酶加入后，SIRT1蛋白先去掉了赖氨酸上的乙酰化修饰，使得四苯乙烯骨架产生了荧光吸收，赖氨酰肽链内切酶进一步从赖氨酸处将肽段剪断，使得四苯乙烯骨架的荧光吸收更强。在SIRT1720存在下，SIRT1蛋白的去乙酰化活性更高，则体系的荧光强度更高；而在EX527存在下，SIRT1蛋白的去乙酰化活性受到抑制，导致乙酰基的去除率降低，乙酰基的存在影响了赖氨酰肽链内切酶对肽段的剪切，从而四苯乙烯骨架的荧光吸收降低，体系的荧光强度也降低(如图5)。

[0089] (3)SIRT1蛋白与荧光强度的量效关系

[0090] 在12μL TPE-GK(Ac)YDD(1mM)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)和36μL NAD+(50mM)体系中，分别加入SIRT1(终浓度为0,0.004,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.08mg/mL)，37℃孵育下反应3小时。反应结束后采用JASCO FP-6500分光光度计测量320nm激发下，400nm到600nm的荧光光谱。

[0091] 检测结果见图6。

[0092] 由图6可见，在荧光探针TPE-GK(Ac)YDD浓度不变的情况下，随着SIRT1蛋白浓度增加，体系的荧光强度也随之提高。

[0093] (4)荧光探针TPE-GK(Ac)YDD与荧光强度的量效关系

[0094] 在40μL SIRT1(1.2mg/mL)、30μL lysyl endopeptidase(14μg/mL)和36μL NAD+(50mM)体系中，分别加入TPE-GK(Ac)YDD(终浓度为1,5,10,15,20,25and 30μM)，37℃孵育下反应3小时。反应结束后采用JASCO FP-6500分光光度计测量320nm激发下，400nm到600nm的荧光光谱。

[0095] 检测结果见图7。

[0096] 由图7可见，在SIRT1蛋白浓度不变的情况下，随着荧光探针TPE-GK(Ac)YDD浓度增加，体系的荧光强度也随之提高。

[0097] 实施例3荧光探针TPE-GK(Ac)YDD在筛选SIRT1调节剂中的应用

[0098] (1)荧光探针TPE-GK(Ac)YDD在筛选SIRT1抑制剂中的应用

[0099] 取2μL荧光探针TPE-GK(Ac)YDD(1mM)，加入10μL SIRT1(0.288mg/ml)、10μL赖氨酰肽链内切酶(14μg/mL)、6μL NAD+(50mM)、10μL不同浓度EX527母液(使得EX527终浓度为0,10,25,50,100,200,500,750,1000,2000nM)，以缓冲液Tris-Hcl pH 8.8补齐至100μL，37℃孵育3h后用Tecan酶标仪测量，设定Ex为320nm(25nm)，Em为465(25nm)。

[0100] 检测结果见图8。

[0101] 由图8可见，随着EX527终浓度的提高，EX527对SIRT1蛋白的抑制效应也逐渐增加；表明荧光探针TPE-GK(Ac)YDD能较好地反映SIRT1蛋白的抑制，可用于SIRT1抑制剂的筛选。

[0102] (2)荧光探针TPE-GK(Ac)YDD在筛选SIRT1激动剂中的应用

[0103] 取2μL荧光探针TPE-GK(Ac)YDD(1mM)，加入10μL SIRT1(0.288mg/ml)、10μL赖氨酰肽链内切酶(14μg/mL)、6μL NAD+(50mM)、10μL不同浓度SRT1720母液(使得SRT1720终浓度为10,25,50,200,500,1000nM)，以缓冲液Tris-Hcl pH 8.8补齐至100μL，37℃孵育3h后用Tecan酶标仪测量，设定Ex为320nm(25nm)，Em为465(25nm)。

[0104] 检测结果见图9。

[0105] 由图9可见，随着SIRT1720终浓度的提高，SIRT1720对SIRT1蛋白的激动效应也逐渐增加；表明荧光探针TPE-GK(Ac)YDD能较好地反映SIRT1蛋白的激动，可用于SIRT1激动剂的筛选。

[0106] (3)荧光探针TPE-GK(Ac)YDD在基于细胞荧光图像的SIRT1调节剂筛选中的应用[0107] 取终浓度为50μM的荧光探针TPE-GK(Ac)YDD，加入离体培养的H9C2心肌细胞，孵育3小时后，洗去培养液，采用Zeiss显微镜，DAPI通道拍摄细胞荧光图像，结果如图10A和图
10B所示。

[0108] 已知白藜芦醇和EX527分别为SIRT1蛋白的激动剂和抑制剂，从图10A和图10B中可以看出，在细胞层面上，荧光探针TPE-GK(Ac)YDD也能够较好地反映SIRT1蛋白的激动和抑制。

[0109] 实施例4荧光探针TPE-GK(Ac)YDD对SIRT1蛋白的检测灵敏度考察

[0110] 取20μL荧光探针TPE-GK(Ac)YDD(100μM)，加入10μL赖氨酰肽链内切酶(14μg/mL)、6μL NAD+(50mM)、不同浓度SIRT1(终浓度分别为0,0.5,1,2,4,10,20,30,40,50,80,100,
120,150,200μg/mL)，以缓冲液Tris-Hcl pH 8.8补齐至100μL，37℃孵育2.5h后用Tecan酶标仪测量，设定Ex为320nm(25nm)，Em为465(25nm)。

[0111] 检测结果见图11。

[0112] 由图11可见，荧光探针TPE-GK(Ac)YDD对SIRT1蛋白的线性检测范围为0.5～100μg/mL，检测限为0.5μg/mL。

[0113] 实施例5荧光探针TPE-GK(Ac)YDD对SIRT1蛋白的检测特异性考察

[0114] (1)胞外检测特异性考察

[0115] 在2μL荧光探针TPE-GK(Ac)YDD(1mM)，10μL赖氨酰肽链内切酶(14μg/mL)、6μL NAD+(50mM)中，加入终浓度均为0.06mg/mL的SIRT1蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、细胞色素C、溶菌酶、凝血酶和终浓度为0.05mg/ml的组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶3，以缓冲液Tris-Hcl pH 8.8补齐至100μL，37℃孵育2.5h后用Tecan酶标仪测量，设定Ex为320nm(25nm)，Em为465(25nm)。

[0116] 检测结果见图12。

[0117] 由图12可见，除SIRT1蛋白组的信号较强外，其他对照组的信号均较弱，表明荧光探针TPE-GK(Ac)YDD仅能被SIRT1蛋白特异性识别并经SIRT1蛋白的去乙酰化修饰后产生荧光吸收，荧光探针TPE-GK(Ac)YDD对SIRT1蛋白具有较强的检测特异性。

[0118] (2)胞内检测特异性考察

[0119] 取终浓度为50μM的荧光探针TPE-GK(Ac)YDD，加入离体培养的正常大鼠MSC细胞和SIRT1敲除的大鼠MSC细胞，孵育3小时后，洗去培养液，采用NIKON A1R激光共聚焦显微镜，DAPI通道拍摄细胞荧光图像。

[0120] 检测结果见图13。

[0121] 由图13可见，荧光探针TPE-GK(Ac)YDD仅在细胞核内发荧光，而SIRT1蛋白主要在细胞核内表达，表明荧光探针TPE-GK(Ac)YDD对SIRT1蛋白具有显著的检测特异性。

[0122] 实施例6荧光探针TPE-GK(Ac)YDD的细胞毒性测试

[0123] 取终浓度为50μM和100μM的TPE-GK(Ac)YDD，加入到离体培养H9c2细胞中，分别孵育3,6,12,24小时后，用 试剂盒检测细胞活性。

[0124] 检测结果见图14。

[0125] 由图14可见，50μM和100μM的荧光探针在24小时内对细胞均无毒性。